鲎试剂在1968年被科学家研发出来，几十年来因为灵敏、有效、使用简便等优点已经成为国内外细菌内毒素检查法所使用的经典试剂，其在细菌内毒素检测领域的地位短期内无可替代。细菌内毒素检查法作为注射剂类药物质量安全控制的重要指标^[1]，极度依赖鲎生物资源，但由于过度捕捞、鲎繁育环境遭到破坏等因素，鲎资源面临枯竭的问题^[2-3]，保护鲎资源并且寻找鲎试剂法的替代方法成为当前的研究重点^[4-5]。主要有两个研究方向，一个是以重组技术替代天然鲎试剂的重组c因子法和重组鲎试剂法，另一个是以天然鲎试剂减量为主的微量法，本研究针对微量法展开。

细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度法两类，光度法又可分为浊度法和显色法，微量动态浊度法在此前已进行验证^[6]，故本次研究的重点为微量动态显色法。显色法的优势在于其所用的鲎血资源是凝胶法的一半，微量动态显色法试剂更进一步极大节省了鲎资源。传统的动态显色法一般的加样体积为100 μL供试品溶液+100 μL鲎试剂，本次微量动态显色法实验研究的加样体积为25 μL+25 μL，依照《中国药典》四部9101分析方法验证指导原则^[1]进行方法学验证，并同时开展该方法的品种适用性研究，以及与传统方法结果一致性比对研究。来确定微量动态显色法是否满足《中国药典》的要求，能否作为现有细菌内毒素检查法的补充方法，以期同时达到保障药品细菌内毒素检测和节约鲎资源的目的。

1 材料 1.1 仪器

酶标仪(Multiskan FC)，购自湛江安度斯生物有限公司；酶标仪(synergyHT，ELx-808)，购自Biotek公司。

1.2 试剂

细菌内毒素国家标准品(批号：150800-201601，9 000 EU/支)、细菌内毒素质控品(沙门菌，批号：150609-202201，10 000 EU/支)，均产自中国食品药品检定研究院；细菌内毒素国际标准品(批号：10/178，10 000EU/瓶)，购自世界卫生组织；微量动态显色法鲎试剂(批号：2004270，2203230，10-0.01 EU·mL^-1，0.35 mL/支)，购自湛江安度斯生物有限公司(厂家1)；微量动态显色法鲎试剂(批号：22090218，22050218，10-0.01 EU·mL^-1，0.35 mL/支)，购自福州新北生化工业有限公司(厂家2)；动态显色法鲎试剂(批号：2208150，50-0.005 EU·mL^-1，1.25 mL/支)，购自湛江安度斯生物有限公司；细菌内毒素检查用水(BET水)，中国食品药品检定研究院(批号：160009-201801)和湛江安度斯生物有限公司(批号：2201250)；酶标板(批号：221015-078-F)，购自湛江安度斯生物有限公司；半孔酶标板，购自湛江安度斯生物有限公司(批号：210518-594、220410-594-B)和福州新北生化工业有限公司。

2 方法 2.1 检测方法

检测条件：采用微量动态显色法鲎试剂，每孔样品和鲎试剂加样量各25 μL，检测波长405 nm，检测温度37 ℃，厂家1试剂预设OD值0.1，厂家2试剂预设OD值0.05。研究内容：进行方法学验证、品种适用性研究及一致性比对研究。参与实验室：中国食品药品检定研究院(实验室1)、北京市药品检验研究院(实验室2)、山东省食品药品检验研究院(实验室3)、江苏省食品药品监督检验研究院(实验室4)。统计方法：使用Excel和JMP13软件对结果进行统计分析，采用单因素方差分析。

2.2 方法学验证

根据《中华人民共和国药典》四部(ChP)“9101药品质量分析方法验证指导原则”项下“杂质测定”中“定量”项要求^[1]，对微量动态显色法进行“专属性”、“准确度”、“精密度”、“定量限”、“线性”、“范围”、“耐用度”等7项内容的验证。由于厂家1微量动态显色法鲎试剂已在2020-2021年的“国家局重点实验室”课题项目中完成了方法学的验证^[7]，所以本次实验方法学验证试验部分只针对厂家2试剂开展。

2.2.1 准确度

用检查用水稀释细菌内毒素国家标准品，制备浓度为3.16、0.316和0.031 6 EU·mL^-1的溶液，用微量动态显色法鲎试剂进行检测，要求重复6次试验进行准确度的验证，并在3家实验室展开验证(实验室1、2、4)。以内毒素检测值的回收率为指标，依照药典1143中“光度测定法”项下的相关规定^[1]，回收率应在50%~200%之间。

2.2.2 精密度

精密度的验证包括重复性、中间精密度、重现性三种类型，药典四部9101中说明“已有重现性验证，不需验证中间精密度”，故本实验考察重复性与重现性，实验操作同“2.2.1准确度”，重复性是对每个实验室多次测定的结果进行评价，重现性对实验室之间的协同检验结果进行评价。以所有检验回收率的变异系数(RSD)为指标，依照药典9101中“样品中待测成分的含量与精密度可接受范围关系表”^[1]，RSD应低于32%。

2.2.3 线性

用内毒素检查用水稀释内毒素国家标准品制备成浓度为10、1、0.1、0.01 EU·mL^-1的溶液，然后依据《中国药典》-1143细菌内毒素检查法中的“标准曲线的可靠性试验”项下要求^[1]，使用微量动态显色法制备一条标准曲线，共需完成6次试验，并要在不同的6天中进行，同时在4家实验室进行协作实验(实验室1~4)。以标准曲线的相关系数(r)为指标，要求r的绝对值应≥0.980。

2.2.4 范围

范围指方法能达到精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间，微量动态显色法鲎试剂的线性范围为10~0.01 EU·mL^-1，实验操作同“2.2.3”。依照药典9101中“范围”项下的规定^[1]，以最高和最低点的检测值为指标，检测结果应分别在最高点(10)和最低点(0.01)的80%~120%之间。

2.2.5 专属性

本项目考察微量动态显色鲎试剂对不同来源的内毒素标准品(国家标准品、国际标准品、质控品，以下简称Ss 1-3)检测的准确性和精密度，试验方法同“2.2.1”中的准确度试验，每种内毒素标准品进行3次实验。以内毒素检测值的回收率和回收率的RSD为指标，回收率应在50%~200%之间，回收率的RSD应低于32%。

2.2.6 耐用性

本项目考察实验条件的改变对检测结果的影响，考察因素有不同酶标仪、不同酶标板，操作同“2.2.1”。选择Multiskan FC/ET酶标仪、Biotek的两种型号酶标仪(synergyHT，ELx-808)共3种酶标仪(以下用Mr 1-3表示)进行实验，考察不同型号的仪器可能带来的影响。选择使用两个厂家的微量动态显色法鲎试剂(以下用Mf 1-2表示)，分别使用本厂家、对方厂家的半孔板酶标板(以下用Plant 1-2表示，Plant1表示厂1的板，Plant2表示厂2的板)和100 μL的普通酶标板进行实验，考察不同酶标板可能带来的影响，验证指标同“2.2.5”。

2.2.7 定量限

本项目考察微量法能定量测定的内毒素最低量，本方法的最低检测量应为0.01 EU·mL^-1，重复进行6次实验，测定0.01 EU·mL^-1的反应时间，与阴性对照反应时间进行比较，阴性对照时间应大于最低点的反应时间，并进行显著性检验，以验证最低点和阴性对照点能否完全分开。

2.3 品种适用性研究

选取生产企业多、市场用量大的药品，使用微量动态显色法鲎试剂，按照《中国药典》-1143细菌内毒素检查法中的“干扰试验”项下的要求进行方法学研究^[1]，确定是否能使用微量动态显色法检验这些具有代表性的药品，以考察微量显色鲎试剂的适用性，因选取品种均适用于使用常量法检测，所以本次研究无需再进行常量法鲎试剂的实验。实验室2、3、4参与此项研究。

2.4 一致性比对 2.4.1 合格样品检测比对

分别使用厂1的100和25 μL、厂2的25 μL反应体系的鲎试剂，选择生产企业多、市场用量大、具有代表性的日常检验为合格的品种，进行检验结果一致性的比对研究，比较实际检测中微量动态显色法和动态显色法的检验结果是否存在差异^[8]。实验室1-4共同参与此项研究。

2.4.2 可检测出内毒素的样品检测比对

使用10批能检测出内毒素含量的样品，分别采用动态显色法鲎试剂和微量动态显色法鲎试剂进行检测，对检测的内毒素数值进行比对以及统计分析，以考察25 μL反应体系对天然内毒素检验结果的准确性。因只有厂家1生产常量动态显色法鲎试剂，故本研究只选择厂1的常量和微量法试剂进行实验。

3 结果 3.1 方法学验证 3.1.1 准确度

对回收率的数据汇总分析，数据表见Tab 1，对Tab 1数据进行分布图绘制，结果见Fig 1，由图表数据可以看出，3个实验室18次实验共54个回收率均在50%~200%，说明该方法的准确度良好，符合药典对细菌内毒素检测的要求。

3.1.2 精密度

使用Excel表计算回收率的RSD，实验室1、2、4的结果分别为24%、14%、23%，均小于32%，使用JMP13对所有回收率数据进行单因素方差分析，显著性结果为0.0663，大于0.05，说明多次实验结果之间并没有显著性差异，3个实验室回收率的总体RSD为21%，小于32%，总体看来，该方法的精密度良好。

3.1.3 线性

对4个实验室所做标准曲线的相关系数(r)的绝对值进行汇总，结果见Tab 2，结果显示，24条标准曲线相关系数的绝对值均＞0.980，r绝对值平均值为0.997，该方法的标准曲线具有很好的线性。

3.1.4 范围

最高和最低点浓度检测值以及与对应标示值的比值结果见Tab 3，由数据看出，标准曲线最高点和最低点的数值均在限值的80%~120%之间，该方法具有较好的线性范围。

3.1.5 专属性

取3次实验结果平均值，结果见Tab 4，由数据看，3种内毒素获得的回收率均在50%~200%之间，符合药典对内毒素检测准确度的要求，说明微量动态显色鲎试剂可以对不同来源的内毒素标准品进行准确的检测，该方法具有较好的专属性。

3.1.6 耐用性

不同仪器实验结果见Tab 5，由数据显示，回收率均在50%~200%之间，符合药典对内毒素检测准确度的要求，回收率的RSD计算结果为24%，低于32%，具有较好的精密度，说明仪器的改变对测定结果没有明显影响。关于不同酶标板的实验结果，使用普通酶标板没有测得任何浓度的反应时间结果，说明普通酶标板不适合用于微量检测。半孔酶标板实验结果见Tab 6，由数据显示，回收率均在50%~200%之间，符合药典对内毒素检测准确度的要求，回收率的RSD计算结果为20%，低于32%，精密度良好，说明半孔酶标板厂家的改变对检测结果没有明显影响。该方法具有较好的耐用性。

3.1.7 定量限

检测限最低点和阴性对照反应时间检测结果见Tab 7，检测限的最低点反应时间均高于阴性对照的反应时间，0.01 EU·mL^-1与阴性对照的内毒素检测值均值分别为0.11 EU·mL^-1、0.006 EU·mL^-1，对两组浓度值进行配对t检验，计算所得P=0.002 8(P<0.05)，说明最低点和阴性对照浓度存在显著性差异，认为最低点和阴性对照点能够完全分开。表明该方法的定量限为0.01 EU·mL^-1。

3.2 品种适用性

研究选择了48个品种，共74批样品进行了方法学研究。48个品种包括常用的大输液、抗生素、化学药品注射剂、疫苗、生物制品等，具有较好的市场代表性。品种分别为：葡萄糖注射液、氯化钠注射液、葡萄糖氯化钠注射液、注射用头孢噻肟钠、注射用盐酸去甲万古霉素、注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠、注射用青霉素钠、盐酸普鲁卡因注射液、注射用艾司奥美拉唑、枸橼酸芬太尼注射液、盐酸吗啡注射液、盐酸哌替啶注射液、盐酸布桂嗪注射液、注射用三氧化二砷、注射用替考拉宁、酚磺乙胺注射液、氨甲苯酸注射液、盐酸利多卡因注射液、硫辛酸注射液、注射用顺铂、盐酸羟考酮注射液、尼克刹米注射液、氨甲苯酸注射液、注射用奥扎格雷钠、氟马西尼注射液、利奈唑胺氯化钠注射液、注射用兰索拉唑紫杉醇注射液、盐酸氨溴索注射液、奥沙利铂甘露醇注射液、注射用泮托拉唑钠、盐酸利托君注射液、盐酸纳洛酮注射液、盐酸纳美芬注射液、硝酸甘油注射液、扎喷酸葡胺注射液、重组新型冠状病毒疫苗(5型腺病毒载体)、注射用尖吻蝮蛇血凝酶、肝素钠注射液、注射用伊米苷酶、烟酰胺注射液、重酒石酸去甲肾上腺素注射液、人血白蛋白、复方氨基酸注射液(18AA)、人粒细胞刺激因子注射液、缩宫素注射液、卡贝缩宫素注射液、那曲肝素钙注射液等。实验结果为，所有品种采用微量动态显色法鲎试剂进行方法学研究，干扰试验的回收率均在50%~200%之间，说明以上品种均可使用微量动态显色法进行细菌内毒素检验，该方法的品种适用性良好。

3.3 一致性比对 3.3.1 合格样品比对

研究选择在日常检验中获得的72个品种133个批次的合格样品进行实验，所选品种包括化学药品和生物制品，具体为：枸橼酸芬太尼注射液、注射用伊米苷酶、烟酰胺注射液、盐酸吗啡注射液、盐酸哌替啶注射液、盐酸布桂嗪注射液、紫杉醇注射液、注射用泮托拉唑钠、盐酸利托君注射液、盐酸纳洛酮注射液、盐酸纳美芬注射液、硝酸甘油注射液、葡萄糖注射液、扎喷酸葡胺注射液、氯化钠注射液、人用狂犬病疫苗(鸡胚细胞)、人干扰素a-2a原液、重组人促甲状腺素注射液、重组人促甲状腺素注射液原液、螨变应原注射液、重组促卵泡素β注射液、地舒单抗注射液、9价重组人乳头、水痘减毒活疫苗、重组新型冠状病毒疫苗(CHO)Omicron原液、鼻喷流感病毒载体新冠肺炎疫苗、注射用尖吻蝮蛇血凝酶、肝素钠注射液、葡萄糖氯化钠注射液、尼克刹米注射液、氨甲苯酸注射液、注射用奥扎格雷钠、注射用青霉素钠、注射用顺铂、盐酸羟考酮注射液、重酒石酸去甲肾上腺素注射液、人血白蛋白、氟马西尼注射液、注射用三氧化二砷、注射用头孢噻肟钠、注射用替考拉宁、注射用盐酸去甲万古霉素、盐酸普鲁卡因注射液、酚磺乙胺注射液、注射用绒促性素、冻干人用狂犬病疫苗(vero细胞)、硝酸异山梨酯注射液、复方氨基酸注射液(18AA)、玻璃酸钠注射液、注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠、盐酸氨溴索注射液、奥沙利铂甘露醇注射液、注射用维迪西妥单抗、注射用人白介素-2(I)、胞磷胆碱钠注射液、左氧氟沙星注射液、甲硝唑氯化钠注射液、盐酸林可霉素注射液、人粒细胞刺激因子注射液、盐酸利多卡因注射液、硫辛酸注射液、吸入用乙酰半胱氨酸溶液、醋酸加尼瑞克注射液、帕拉米韦注射液、法莫替丁注射液、盐酸多巴酚丁胺注射液、格隆溴铵新斯的明注射液、注射用尼可地尔、注射用奥美拉唑钠、舒更葡糖钠注射液、己酮可可碱注射液、注射用氯诺昔康。结果表明，常量和微量动态显色法测得的内毒素含量乘以稀释倍数后，均小于规定的内毒素限值，均可判定供试品符合规定。微量法与常量法的检验结果一致，说明微量动态显色法与常量法具有良好的一致性。

3.3.2 可检测出内毒素的样品检测比对

进行试验的样品包括：人用狂犬病疫苗(鸡胚细胞)4批、琥珀酰明胶注射液1批、血液制品样品2批(欧洲药品质量管理局EDQM能力验证样品)、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗3批，结果见Tab 8。结果表明，两种方法测得内毒素浓度乘以稀释倍数后，均大于规定内毒素限值，均可判定供试品不符合规定。对两种方法检测到的内毒素含量值进行配对t检验，双侧检验P值为0.4757，大于0.05，结果没有显著性差异。说明对于天然内毒素的检测，微量动态显色法与常量动态显色法比较，具有良好的一致性。

4 小结与讨论^[2] 4.1 小结

细菌内毒素检查法又称为鲎试剂法，收录于《中国药典》2020版四部，是注射剂类药物质量标准建立的必备验证项目之一，对于保护患者用药安全、避免药品中的内毒素引起不良反应甚至危及生命的后果有着重要意义。微量法的研究作为鲎试剂法的补充方法，相比于其他替代方法而言，具有依然使用的是天然鲎试剂、反应原理和操作步骤等和原方法基本相同，操作简便，更容易推广使用等优点，有着不可替代的优势。

经过方法学验证(专属性、准确度、精密度、定量限、线性、范围、耐用度)、品种适用性以及一致性比对研究，表明微量动态显色法符合药典四部规定的方法学验证的有关要求，可以用做细菌内毒素的检测。本研究所用试剂用量为25 μL，相较于传统的100 μL，可大大减少鲎试剂的使用量，符合3R原则中的“减少”，可以作为鲎试剂检测的补充替代方法，为重组等替代方法的研究提供缓冲时间。

4.2 讨论

微量动态显色法因反应体系体积变小，相比于常量动态显色法，微量动态显色法存在以下现象。首先，因加样量的变化，有些微量法的反应时间会比常量法的反应时间长，常量法的预设onset OD值(0.1)不一定适用于微量法，应当按照说明书的相应规定设置OD值，并将试验时间延长至反应结束。其次，因反应体系变小，对某些样品的抗干扰能力可能会比常量法低，此时需要选择合适的排除干扰的方法。如在品种适用性研究中，部分样品第一次采用微量法研究得到的结果为回收率低于50%，但在对样品和结果分析后，通过使用Tris缓冲液稀释等方法，成功排除干扰，回收率在50%~200%之间，即可以满足方法的建立要求。

加样量的减少导致反应时间变长，为避免标准曲线最低点与阴性对照的反应时间区分不开，应当对实验环境和实验操作的要求更严格，以保证实验结果的有效性与可靠性：①应进一步保证实验环境无内毒素的污染；②加样时最好采用反向加样法，避免加样过程中产生气泡；③加样时建议深入酶标板孔，贴着微孔板底加样，防止液体挂壁，影响检测准确性；④在耗材使用方面，必须使用半孔酶标板，才能确保微量法的检测，2.2.6耐用性实验中进行了普通酶标板的实验，但并未得到实验数据，推测可能是由于加样量与孔径不匹配，导致铺在孔中的液面偏薄，不足以达到酶标板的检测要求。最好使用与鲎试剂配套的同厂家的酶标板，因本研究中使用不同厂家的半孔酶标板对结果没有明显影响，故若条件受限时也可以使用对方鲎试剂厂家的半孔酶标板。

天然内毒素是指非纯化的混合物，由多糖、脂质、蛋白质三部分组成，根据美国药典参考标准质量要求^[9]：“标准物质是反映特定药物和食品的高度表征本”，标准内毒素应为高度纯化并经过标定的物质，我国的细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而得^[10]，并以国际标准品为基准。相比于微量动态浊度法^[6]的研究中以标准内毒素为研究对象，本方法学验证的实验中除了验证标准内毒素以外，还增加了对天然内毒素检测值的一致性比对研究，具体分为可检测出和不可检测出内毒素的品种，以验证该方法能否准确检测出天然内毒素，以进一步证实了微量法的可靠性，具有较好的研究价值与意义。

在药品生产企业使用微量法进行内毒素检测时，首先需依据中国药典四部1143光度测定法项下“干扰试验”部分中提及，检测鲎试剂发生变化时，须重新对品种进行干扰试验。如涉及到药品质量标准的变更，建议可参考《药品上市后变更管理办法》^[11]第十七条和二十条规定，“相关企业应当充分评估该变更可能对药品安全性、有效性和质量可控性影响的风险程度，确定变更管理类别，按照有关技术指导原则和药品生产质量管理规范进行充分研究、评估和必要的验证，经批准、备案后实施或报告”。