2. 中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074;
3. 伊朗农业研究、教育和推广组织，森林和牧场研究所，德黑兰，伊朗 999067
2. College of Pharmaceutical Sciences, South-Central Minzu University, Wuhan 430074, China;
3. Research Division of Medicinal Plants, Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, 999067, Iran
头颈部鳞状细胞癌是全世界第六大常见癌症，其中喉癌(laryngeal cancer，LC)最为普遍。喉癌一般起源于人体皮肤喉部，并可能导致咳嗽、气管状、困难、呼吸困难等并发症，给患者带来极大的痛苦[1]。喉癌的目前的治疗方式有手术治疗和放射治疗，由于早期症状不典型，大多数喉癌患者在晚期被诊断。大量临床实践证明，对中晚期病人进行大剂量放、化疗，或对产生耐药的患者再次进行化疗只能导致虚弱的生命更加垂危，加速患者死亡，但是中药治疗可以弥补手术治疗、放射治疗、化学治疗的不足，既能巩固放疗、化疗的效果，又能消除放化疗的毒副作用[2]。因此，为了找到更有效的治疗策略，详细了解中药材治疗喉癌的潜在分子机制是当务之急。
江南卷柏为卷柏科卷柏属植物江南卷柏(Selaginella moelledorffii Hieron.，SM)的全草，是中国、越南、柬埔寨和菲律宾的重要民俗药材，在我国资源丰富，长江以南各省均有分布。现代研究表明其具有止血、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化、降血糖、降血脂等作用[3]。据报道从江南卷柏中提取到的3种萜类化合物对3种人癌细胞系表现出适度的细胞毒活性[4]；来自江南卷柏的富含双黄酮的提取物(A biflavonoid-rich extract from Selaginella moellendorfii Hieron.，SM-BFRE)被认为是一种潜在的喉癌化疗药物，能显著抑制喉癌细胞系的增殖和迁移，在体外和体内实验中进一步证实其抗喉癌作用涉及激活线粒体凋亡通路和抑制STAT3和Akt/NF-κB信号通路，所以江南卷柏治疗喉癌具有重要的研究价值。
本文运用网络药理学探讨江南卷柏治疗喉癌的分子机制进行预测和分析，并结合分子对接技术和体外细胞实验验证，为进一步研究江南卷柏治疗喉癌后续临床应用提供基础[5]。
1 材料与方法 1.1 江南卷柏活性成分和靶点收集根据已发表的文献报道获取江南卷柏化学组成成分，通过ChemDraw 18.1软件绘出各分子结构式，利用SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch/)对各成分进行ADME(人体对外源化学物的吸收、分布、代谢及排泄过程)初步筛选，依据Pharmacokinetics中胃肠道吸收为“high”和Druglikeness中的五个指标(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)两个及两个以上为“yes”筛选出江南卷柏活性成分，不满足上述参数设定条件但通过查阅文献报道有明确抗肿瘤活性或者含量高的化学成分也纳入研究，同时通过化学专业数据库(http://www.organchem.csdb.cn/)及化源网(https://www.chemsrc.com/)补充活性成分。通过PharmMapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn/)预测活性成分作用的靶点，物种选择为“Human Protein Targets Only”，根据Norm Fit≥0.9进行筛选，最后将获得的靶点信息通过Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)进行标准化，结果作为江南卷柏活性成分靶点。
1.2 喉癌相关靶点收集以“Laryngeal cancer”、“Throat cancer”为检索词，利用GeneCards (https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)和DRUGBANK数据库(https://go.drugbank.com/)预测治疗喉癌的靶点信息，合并3个疾病数据库靶点并删除重复值，最后利用Uniprot数据库校正靶点信息。
1.3 PPI网络的构建Venny 2.1.0在线平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/)将江南卷柏活性成分靶点和喉癌靶点取交集，交集靶点即为江南卷柏治疗喉癌的潜在靶点。将其导入STRING数据库(https://string-db.org/)，物种选择为“homo sapiens”隐藏游离的靶点，得到PPI网络信息。Cytoscape 3.8.0软件做可视化分析处理，通过“Analyze Network”功能进行拓扑分析，获得可能的核心靶点。
1.4 药物-靶点网络的构建和分析将活性成分和潜在靶点导入Cytoscape 3.8.0软件中，绘制药物-靶点网络图，对网络进行“Analyze Network”功能分析，以度值中位数为筛选条件，获得可能的核心靶点和关键活性化合物。
1.5 GO和KEGG通路富集结果与分析把潜在靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO和KEGG通路富集分析，选择标识符为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，选择物种为“homo sapiens”。
1.6 药物-靶点-通路网络图的构建和分析把上述步骤的活性成分、潜在靶点和前20条通路导入Cytoscape 3.8.0软件中，绘制药物-靶点-通路网络图，对网络进行“Analyze Network”功能分析，以度值中位数为筛选条件，进一步筛选出可能的核心靶点、化合物和通路。
1.7 分子对接验证利用Chem3D软件中把关键成分进行处理并下载其3D分子结构(MOL2格式)作为对接的配体，在蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB，https:l/www.rcsb.org/)中下载靶点蛋白结构(PDB格式)作为对接的受体，利用SYBYL-X 2.0软件进行分子对接，使用Discovery Studio 4.5软件把对接活性好的组合进行分析并绘图。
1.8 SM-BFRE的制备江南卷柏于2018年8月购买于中国广西壮族自治区南宁市的药草市场，经由中南民族大学药学院万定荣教授鉴定。药材标本(编号SC0064)保存在中南民族大学药学院标本馆。
1.9 细胞培养及MTT细胞活力测定人喉癌细胞Hep-2和人胚胎肾细胞株HEK 293购买于美国模式培养物寄存库(ATCC；美国)及FaDu购买于北京协和医院细胞库，Hep-2细胞和HEK293培养于DMEM(含10%的FBS和1%的双抗)，FaDu培养于MEM(含10%的FBS和1%的双抗)。所有细胞均培养于的37 ℃恒温培养箱(含5%CO2)。
将处在对数生长期的Hep-2、FaDu和HEK 293细胞均匀的接于在96孔板中培养24 h, 分别用0、5、10、20、50、100 mg·L-1的SM-BFRE处理6、12、24 h后，弃掉上清并用PBS润洗，再加入100 mL (5 g·L-1 MTT ∶ DMEM=1 ∶ 9)，置于恒温培养箱中孵育60 min。最后弃去每孔内容物，加入150 μL DMSO，使用全波长酶标仪(赛默飞世尔科技公司)，在562 nm处检测吸光度值(A)。抑制率=[1-(A给药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%。IC50值使用GraphPad Prim 7.0软件计算细胞抑制率。
1.10 Hoechst 33258染色法取处在对数生长时期的Hep-2细胞进行细胞计数，以2×105个细胞接种于6孔板中，培养至过夜直至细胞铺满板底，细胞分别用0、10、30、50 mg·L-1 SM-BFRE处理24 h。待指定实验时间，弃去原培养基，在每个用药物处理后的孔中加入1 mL电镜固定液(冰醋酸∶甲酸=1 ∶ 3)，固定20 min。固定完毕，弃去固定液，每孔加入2 mL PBS清洗两遍。最后加入1 mL 5 mg·L-1的Hoechst 33258染料(美国Sigma公司)。避光染色半小时后，再黑暗环境中用荧光显微镜观察是否存在凋亡小体，并在40倍拍摄照片。
1.11 Western blot将Hep-2细胞置于100×20 mm的细胞培养皿中培养至约70%~80%融合。然后分别用4种浓度梯度(0、10、30和50 mg·L-1)的SM-BFRE处理24 h，在RIPA裂解缓冲液(中国碧云天公司)中分离并提取细胞。收集上清液，用BCA试剂盒(中国碧云天公司)测定其浓度。然后将蛋白质放入微沸的水中10 min，然后放入-80 ℃的冰箱中进行进一步分析。等量的蛋白(40 μg)通过SDS-PAGE分离(10%或12.5%)，然后通过电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将含有蛋白质条带的膜用溶解在TBST中的5% BSA封闭2 h。处理后，将膜与一抗在4 ℃孵育过夜。第2天清洗3次后，用相应的二抗孵育60 min。凝胶成像分析系统(上海伯乐生命医学产品有限公司)用于采集发光图像。同时利用Image Lab软件分析蛋白的变化趋势。
1.12 统计学分析数据采用x±s表示，用SPSS 20.0处理，两两比较用t检验，多组间比较用F检验。
2 结果 2.1 江南卷柏相关靶点筛选根据已发表的文献报道获取135个江南卷柏化学组成成分，通过筛选和补充得到110个活性成分，其中86个与疾病靶点有交集。通过PharmMapper数据库预测各个活性成分靶点后进行合并删除重复值，通过Uniprot数据库标准化靶点信息后得到82个药物靶点。
2.2 喉癌相关靶点收集Genecards数据库中，以Relevance score＞2.99(中位数)进行选取得到1 819个靶点。OMIM和DRUGBANK分别预测到503和29个基因，合并3个疾病数据库靶点并删除重复值得到喉癌相关靶点1 642个。
2.3 PPI网络构建利用Venny 2.1.0取交集得到34个潜在靶点并绘制韦恩图，如Fig 1。采用STRING数据库中构建PPI网络，隐藏一个游离的靶点后得到最终的PPI网络，如Fig 2，对应的tsv文件导入Cytoscape 3.8.0软件中进行分析处理，如Fig 3，该网络中共有33个节点，156条边，其中节点代表靶蛋白，边代表靶蛋白之间存在相互作用的关系，节点大小和颜色深浅表示节点的度值，节点越大，颜色越深表示该节点越重要(Fig 4、Fig 7同)。利用“Analyze Network”功能计算出各节点的度值(degree，DC)、介数中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和平均最短距离(average shortest path length，ASPL)，以各个数值中位数为界限，筛选出符合degree≥8且BC≥0.007 2且CC≥0.571 4且ASPL≤1.75的靶蛋白有15个，按照度值对关键靶点蛋白进行排序，分别为ALB、EGFR、ESR1、CASP3、PGR、MAPK14、AR、MAPK1、IGF1R等，即为江南卷柏治疗喉癌的可能的核心靶点。
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| Fig 1 Venn diagram of S. moellendorffii and laryngeal cancer targets |
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| Fig 2 PPI network of potential targets of S. moellendorffii in treatment of laryngeal cancer |
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| Fig 3 PPI network analysis diagram of potential targets |
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| Fig 4 Active ingredient-potential target network diagram |
利用Cytoscape 3.8.0软件绘制药物-靶点网络图，如Fig 4。该网络中共有120个节点，619条边，包括86个活性成分和34个潜在靶点，其中绿色方形为江南卷柏活性成分，橙色圆形为江南卷柏治疗喉癌的潜在靶点。其中DC≥14.5的靶蛋白17个，即核心靶点PIM1、TTR、ESR1、CTSD、MAPK1、ALB等，筛选出DC≥7的化合物47个，即关键成分(-)-丁香脂素、dihydrobuddlenol B等。
2.5 GO和KEGG通路富集结果与分析利用DAVID数据库对潜在靶点进行GO和KEGG分析，其中，GO分析确定了84个生物过程(BP)、14个细胞成分(CC)、37个分子功能(MF)。以P≤0.05为初始筛选条件，分别选取Count值排名前10条信号通过微生信在线作图工具进行可视化，如Fig 5所示，横坐标为富集功能信息，纵坐标为富集基因数，其中BP主要表现在对信号转导和凋亡过程的负调控等；CC主要集中在细胞质、核及细胞外外泌体等部分；MF变化主要表现在蛋白质、受体及ATP结合等。
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| Fig 5 GO functional enrichment analysis of potential targets of S.moellendorffii in treatment of laryngeal cancer |
KEGG富集分析共获得88条通路，依据P≤0.05选取前20条信号通路通过微生信在线作图工具进行可视化，如Fig 6，横坐标为富集基因数占比，纵坐标为信号通路类别，气泡越大表示富集基因数越多，富集越显著，颜色由绿转红，表示P值越小。主要涉及癌症的途径、TNF和PI3K-Akt相关信号通路和生物学过程等。以上表示江南卷柏治疗喉癌的过程可能涉及多通路、多靶点和多生物过程。
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| Fig 6 KEGG enrichment analysis of potential targets of S.moellendorffii in treatment of laryngeal cancer |
利用Cytoscape 3.8.0软件绘制药物-靶点-通路网络图，如Fig 7。该网络中共有140个节点，739条边，包括86个活性成分、34个潜在靶点和20条信号通路，绿色方形表示活性成分，红色圆形表示潜在靶点，青色V型表示潜在通路，根据度值筛选出DC≥18.5的靶蛋白17个，即核心靶点PIM1、MAPK1、MAPK10、TTR、ESR1、CTSD、ALB等，筛选出DC≥7的化合物47个，即关键成分(-)-丁香脂素、dihydrobuddlenol B等，筛选出DC≥6的通路11个，即潜在通路癌症的途径、PI3K-Akt信号通路等。
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| Fig 7 Active ingredient-potential target-pathway network diagram |
根据上述网络药理学分析及筛选得到江南卷柏核心活性成分有穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、鸡毛松双黄酮A、扁柏双黄酮、2″, 3″-二氢金连木黄酮、(-)-丁香脂素、N-卷柏酰基-L-苯丙氨酸、卷柏酮A、大黄酸、β-谷甾醇、垫状卷柏三酚S 11种，与核心靶点MAPK1、ESR1、ALB和CTSD进行分子对接验证。在Chem3D软件中将11个成分进行最小能量化处理并下载其3D分子结构(MOL2格式)，在PDB数据库中以人源蛋白、分辨率及优先选择具有原始配体为依据下载靶点蛋白结构(PDB格式)，在SYBYL-X 2.0软件的Dock Ligands中对蛋白进行去水，加氢，能量优化，删除非相关的配体分子，选择蛋白本身的Ligands模式产生活性口袋进行分子对接验证，对接结果如Fig 8。据了解，数值大于7表明有较强烈的对接活性，在3-7之间有较好的对接活性，数值小于3表明有一定的对接活性，结果表示评分大于7的占总数的16%，表示少部分成分与靶点有强烈的结合活性，评分大于3的占总数的95.5%，表示大部分成分和靶点的结合活性较好。从SYBYL-X 2.0软件中选取对接活性最好的4个组合并下载其pdb格式，采用Discovery Studio 4.5软件中Ligand Tnteractions模式对结果进行可视化分析，如Fig 9所示，靶蛋白以彩色三维结构(由红色、绿色、青色和灰色组成)表示，相互作用关系以彩色虚线表示，其中绿色虚线表示氢键作用连线，棕色虚线表示电子作用，紫色虚线表示疏水作用，配体以黄色棍状表示，其余的较小得棍状则为氨基酸残基，Fig 9A为2″, 3″-二氢金连木黄酮与MAPK1受体蛋白的对接图，其中2″, 3″-二氢金连木黄酮与氨基酸ASP106、GLN105、MET108和ASP167形成6个氢键作用，与ASP111和LYS54形成两个电子作用，与ILE56、VAL39、ALA52、ILE31和LEU156形成9个疏水作用；Fig 9B为N-卷柏酰基-L-苯丙氨酸与ESR1受体蛋白的对接图，其中N-卷柏酰基-L-苯丙氨酸与氨基酸GLY521和ASP351形成3个氢键作用，与ASP351形成一个电子作用，与MET421和LEU525形成3个疏水作用；Fig 9C为扁柏双黄酮与ALB受体蛋白的对接图，其中扁柏双黄酮与氨基酸SER489和GLY434形成3个氢键作用，与LEU460、TYR411、LEU387、VAL433和CYS438形成9个疏水作用，Fig 9D为银杏双黄酮与CTSD受体蛋白的对接图，其中银杏双黄酮与氨基酸ASP323、ASP231、GLN14和SER80形成4个氢键作用，与THR234、GLY233、VAL31、GLN14、PHE131、ILE134和TYR78形成6个疏水作用，这些相互作用共同维持蛋白和化合物之间的稳定构象。
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| Fig 8 Molecular docking total score heatmap |
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| Fig 9 Molecular docking diagram A: Docking results of MAPK1-2″, 3″-dihydroochnaflavone; B: Docking results of ESR1-N-selaginelloyl-L-phenylalanine; C: Docking results of ALB-Hinokiflavone; D: Docking results of CTSD-Ginkgetin. |
将500 g干燥的江南卷柏整株植物用高速粉碎机粉碎，得到的均匀粉末在室温下用95%的乙醇浸渍提取4遍。减压蒸发溶剂，得到粗提物61.5 g。将粗提物浸膏以1 ∶ 10悬浮在温水中，然后按顺序用等体积的PE、EtOAc和正丁醇(n-BuOH)分别萃取4次，将相应的萃取液合并后，浓缩干燥得到PE部位4.3 g，EtOAc部位9.4 g、n-BuOH部位23.7 g以及水部位。将EtOAc部位进行D101大孔树脂柱色谱分离，依次用质量浓度为10%、30%、50%、70%、80%和95%的水-乙醇进行梯度洗脱，得到142种洗脱液。根据高效液相色谱分析结果，将不同的洗脱液合并为7个组分(Frs. A-G)。Fr. E为纯化的江南卷柏双黄酮富集物(SM-BFRE，3.5 g)，通过MTT法细胞活力测定实验筛选出SM-BFRE对喉癌细胞增殖的抑制作用最强。
2.9 MTT法检测SM-BFRE对喉癌细胞增殖的影响为了检测SM-BFRE在体外对喉癌细胞的抗增殖作用，我们采用了MTT法分别检测了不同浓度和给药时间下，SD-BFRE对两种喉癌细胞系(Hep-2和FaDu)的细胞活力的影响。结果如Fig 10所示，经过SD-BFRE给药12 h后，Hep-2和FaDu细胞的IC50值呈现出一定的浓度和时间依赖性。与此同时，在相同实验条件下，并没有观察到SM-BFRE对HEK 293有明显的细胞毒活性。
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| Fig 10 Cell viability inhibited by SM-BFRE A and B: Cellular inhibition rates of Hep-2 and FaDu cells after treatment with different concentrations of SD-BFRE for 6 h, 12 h and 24 h; C: Cytostatic rate of Hep-2, FaDu and HEK 293 cells treated with different concentrations of SD-BFRE for 24 h |
为了确定SM-BFRE处理后产生的喉癌细胞活力是否与细胞凋亡有关，我们采取了Hoechst 33258染色法，对被SM-BFRE处理了24 h的Hep-2细胞进行了检测。结果如Fig 11显示，随着给药剂量的上升，明亮的蓝色的凋亡小体的数量明显上升。
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| Fig 11 Changes in apoptosis of Hep-2 cells |
PI3K/Akt是介导细胞凋亡与存活的关键信号通路。在癌细胞中，PI3K/Akt可以通过促进核因子κB(NF-κB)入核进而调节基因的表达。这些基因在肿瘤的发生发展中至关重要。
为了研究SM-BFRE诱导的细胞凋亡是否与PI3K/Akt/NF-κB信号通路相关，我们采用Western blot法对该通路的重要基因进行检测。结果如Fig 12显示，SM-BFRE以剂量依赖性抑制p-Akt, NF-κB, Cox-2的表达水平，但不影响Total-Akt的蛋白表达水平，提示SM-BFRE通过抑制PI3K/Akt/NF-κB/Cox-2通路来诱导喉癌细胞发生凋亡。
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| Fig 12 Expression of PI3K/Akt/NF-κB/Cox-2 pathway key proteins in Hep-2 cells detected by Western blot After SM-BFRE treatment for 24 h, the relative protein level of COX-2, NF-κB and p-Akt in Hep-2 cells were determined by Western blot. *P < 0.05 vs 0 mg·L-1. |
喉癌是一种常见的恶性头颈部鳞状细胞癌，死亡率较高。咽喉是位于上消化道的器官，与吞咽、呼吸和说话等许多基本功能息息相关[6]。过去，喉癌的传统治疗方法聚焦于化学疗法，放射疗法以及局部手术，现如今，癌症疫苗接种成为一种个性化的癌症治疗方法。但是，不论是喉癌的发生还是预后治疗，都对患者的身心健康产生极大的影响。因此，寻找靶向性强、低毒高效、疗效确切的癌症治疗策略是当务之急。中医使用药用植物来治疗肿瘤及其并发症的历史悠久，拥有系统且长期的临床用药经验及治疗体系。从药用植物中提取分离的天然产物具有低毒高效的特点，具有很高的研究开发价值。因此，探寻具有抗肿瘤潜力的天然产物防治喉癌可以作为一种新型的癌症治疗策略[7]。
根据传统中医典籍记载[8]，江南卷柏已有上千年的药用历史，始载于宋代《本草图经》，并以江南卷柏为其正名，又名地柏，“地柏……根黄，状如丝，茎细，上有黄色点子，无花，叶三月生，长四、五寸许，四月采，暴干用”。现代药理学研究[9]显示，江南卷柏中黄酮类化合物是抗肿瘤、抗氧化的主要活性成分。COX-2是癌症的不良预后标志物之一，其在绝大多数组织中不表达，而在炎症、肿瘤等病理状态下具有较高的表达量。江南卷柏总黄酮能在mRNA水平上抑制环氧合酶COX-2，进而抑制COX-2蛋白质表达，降低PGE2产量。除双黄酮类化合物外，萜类、生物碱类、苯丙素类化合物等均有抑制肿瘤细胞生长的作用。
本研究通过网络药理学分析得到江南卷柏治疗喉癌的活性成分有穗花杉双黄酮、银杏双黄酮、鸡毛松双黄酮A、扁柏双黄酮等，这些双黄酮类化合物均可抑制肿瘤细胞生长。有研究发现[10]，HER2被认为是乳腺癌细胞的不良预后标志物，穗花杉双黄酮可以在蛋白质和mRNA水平上抑制脂肪酸合酶的表达，还可以抑制HER2活化并调节人乳腺腺癌细胞中的Akt、mTOR和JNK磷酸化。
江南卷柏治疗喉癌的靶点主要有MAPK1、ESR1、ALB和CTSD等。MAPK1属于MAPK激酶家族，可通过激活MAPK信号通路，促进MMP-13等细胞外基质分解代谢因子表达，从而抑制Ⅱ型胶原等合成代谢蛋白表达，导致细胞外基质受损，与肿瘤细胞转移有关。ESR1可能影响非小细胞肺癌中许多重要的分子事件和信号通路，尤其是膜相关的细胞通讯相关过程，包括受体激活、信号转导、细胞黏附、免疫反应等[11]。据报道[12]，恶性肿瘤可引起尿中ALB蛋白的浓度增高，但不同肿瘤蛋白含量增高的程度及阳性率有差异，可作为恶性肿瘤的辅助诊断指标，对观察肿瘤病人有一定临床意义。研究表明[13]，CTSD或其前体除正常生理作用外，其异常表达或修饰与多种肿瘤的转移、预后和药物抗性有关，其新的糖基化异构体66 ku的表达与肺癌的肿瘤类型、临床分期、淋巴结转移和患者的吸烟状况密切相关且影响肺癌患者的预后生存时间。分子对接结果亦表示，2″, 3″-二氢金连木黄酮、N-卷柏酰基-L-苯丙氨酸等11个成分与MAPK1、ESR1、ALB、CTSD 4个核心靶点有95.5%具有较好的对接活性，进一步说明这些靶蛋白和成分与SM-BFRE治疗喉癌有着密切关系。
KEGG富集分析显示，江南卷柏治疗喉癌的潜在靶点主要富集在癌症途径、TNF、PI3K/Akt和FoxO相关信号通路等，癌症通路的下游信号通路包括MAPK、PI3K/Akt等，有研究发现[14]，过表达miR-509-3p可明显减弱喉癌细胞的生长、转移和侵袭，作用机制可能与PI3K/Akt和RAP2B信号通路有关。据报道[15]，肿瘤坏死因子具有激活诱导T、B细胞、增强NK细胞杀伤靶细胞、促进吞噬等功能，同时也是机体炎症反应和一系列病理生理过程的重要介质。头框转录因子O家族(FOXO)是近年来研究发现的与癌症发生发展有关的蛋白，在结直肠癌、胃癌、鼻咽癌等多种癌细胞的生长过程中发挥调控作用，FOXO在喉癌组织中表达上调，能够抑制喉癌细胞增殖，促进喉癌细胞凋亡，作用机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关[16]。
由于网络药理学分子对接是计算机结果，具有一定的局限性，所以我们通过药理实验，对上述结论进行进一步验证。
无限增殖是恶性肿瘤细胞的基本特征，所以抑制肿瘤细胞的快速增殖一直是肿瘤治疗领域的重要手段，从而进一步抑制肿瘤在体内的扩散和转移。在本实验中，从江南卷柏中提取出来的SM-BFRE对两种喉癌细胞系和人正常胚胎肾细胞具有选择杀伤性，并呈现一定的剂量与时间依赖性，其中对喉癌Hep-2的抑制增殖作用最强，对HEK 293没有明显的细胞毒活性。细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，在损伤细胞中起着促进细胞内稳态的作用。目前临床抗肿瘤药物多通过凋亡途径发挥作用。在细胞凋亡过程中，早期发生细胞收缩和漂浮，随后细胞分解为凋亡小体，并伴随染色质凝结和核碎裂[17]。在本研究中，Hoechst 33258染色可以显示，SM-BFRE可诱导喉癌细胞凋亡，并呈剂量依赖性。
PI3K/Akt通路在肿瘤细胞中高度活跃，参与调节细胞增殖、分化、凋亡及转移等。当受到炎症、损伤、及致癌物质的诱导下，Akt被磷酸化激活，使得存在于细胞质中的NF-κB抑制剂降解，使NF-κB入核进而抑制细胞凋亡。越来越多的证据表明，NF-κB调节基因的转录表达，这些基因对肿瘤的发生发展至关重要[18]。COX-2是NF-κB的下游重要靶基因，参与肿瘤存活、迁移、侵入、甚至炎症。KEGG富集分析结果显示，PI3K/Akt通路是主要癌症富集途径，所以我们使用Western blot法分析该通路上关键蛋白的表达水平变化，实验结果表明，SM-BFRE以剂量依赖性抑制p-Akt、NF-κB、Cox-2的表达水平，这提示我们SM-BFRE所诱导的喉癌细胞凋亡可能通过抑制PI3K/Akt/NF-κB/Cox-2信号通路。
综上所述，在分子水平上，本研究基于网络药理学、分子对接技术和药理实验探究江南卷柏治疗喉癌的作用机制，发现喉癌的关键活性成分2″, 3″-二氢金连木黄酮、N-卷柏酰基-L-苯丙氨酸等可能作用于MAPK1、ESR1、ALB和CTSD等核心靶蛋白，并通过癌症途径、PI3K/Akt等相关信号通路等抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡。江南卷柏治疗喉癌涉及多个有效成分，作用靶点及通路，为进一步的实验研究和扩展临床应用范围提供新思路。
| [1] |
Mermod M, Adam A, Clair C, et al. Squamous cell carcinoma of the head and neck -screening in patients who misuse alcohol and tobacco in Switzerland: a prospective pilot study[J]. Br J Oral Maxillofac Surg, 2019, 57(10): 1053-7. doi:10.1016/j.bjoms.2019.09.013 |
| [2] |
Zhang J, Wang P, Cui Y. Long noncoding RNA NEAT1 inhibits the acetylation of PTEN through the miR-524-5p/HDAC1 axis to promote the proliferation and invasion of laryngeal cancer cells[J]. Aging, 2021, 13(22): 24850-865. doi:10.18632/aging.203719 |
| [3] |
宋蕊, 刘丽芳, 马海燕, 等. 江南卷柏的化学成分[J]. 药学与临床研究, 2016, 24(4): 318-20. Song R, Liu M F, Ma H Y, et al. The chemical constituents of Selaginella moelledorffii Hieron.[J]. Pharm Clin Res, 2016, 24(4): 318-20. |
| [4] |
Wu W, Jia X H, Zhang S, et al. Two New Abietane Diterpenoids from Selaginella moellendorffii Hieron.[J]. Chem Biodivers, 2020, 17(6): e2000111. doi:10.1002/cbdv.202000111 |
| [5] |
李洵珣, 金晨, 陈康, 等. 基于网络药理学和分子对接分析丰城鸡血藤治疗乳腺癌的分子靶点和机制[J]. 中国药理学通报, 2022, 38(5): 767-75. Li X X, Jin C, Chen K, et al. Analyzing the molecular targets and mechanisms of Fengcheng chickweed for breast cancer treatment based on network pharmacology and molecular docking[J]. Chin Pharmacol Bull, 2022, 38(5): 767-775. |
| [6] |
Calkovsky, Wallenfels V, Calkovska P, et al. A. Laryngeal Cancer: 12-year experience of a single Center[J]. Adv Exp Med Biol, 2016, 911: 9-16. |
| [7] |
Wei D, Xu J, Liu X Y, et al. Fighting cancer with viruses: oncolytic virus therapy in China[J]. Hum Gene Ther, 2018, 29(2): 151-9. doi:10.1089/hum.2017.212 |
| [8] |
张学艳, 杨萍, 陈科力, 等. 江南卷柏的本草考证及化学成分与药理作用研究进展[J]. 中国药房, 2018, 29(14): 1992-8. Zhang X Y, Yang P, Chen K L, et al. Research progress on the materia medica, chemical constituents and pharmacological effects of Selaginella moellendorffii Hieron.[J]. J Chin Pharm, 2018, 29(14): 1992-8. doi:10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.27 |
| [9] |
张震, 王峰. 穗花杉双黄酮的生物活性研究进展[J]. 中国新药杂志, 2013, 22(23): 2775-8. Zhang Z, Wang F. Research progress on bioactivity of Amentoflavone[J]. Chin New Drugs J, 2013, 22(23): 2775-8. |
| [10] |
Lee J S, Sul J Y, Park J B, et al. Fatty acid synthase inhibition by amentoflavone suppresses HER2/neu (erbB2) oncogene in SKBR3 human breast cancer cells[J]. Phytother Res, 2013, 27(5): 713-20. doi:10.1002/ptr.4778 |
| [11] |
高秀娟. 基于系统生物学研究雌激素受体通过调节膜受体信号网络促进NSCLC的进展[D]. 华中科技大学, 2019. Gao X J. Systems biology-based study of estrogen receptor promotes NSCLC progression by regulating membrane receptor signaling network[D]. Huazhong Univ Sci Technol, 2019. |
| [12] |
梅昆, 李静. 恶性肿瘤患者尿液β2-m、Alb和IgGRlA联合检测的临床价值[J]. 中国肿瘤临床, 1995, 22(3): 187-90. Mei K, Li J. Clinical value of urine β2-m, Alb and IgGRlA combined detection in patients with malignant tumors[J]. Chin J Cancer Clin, 1995, 22(3): 187-90. |
| [13] |
张慧娟, 郑晓伟, 乔玲, 等. 组织蛋白酶D新的糖基化异构体在肺癌中表达的临床意义及其与预后的相关性[J]. 解剖学报, 2018, 49(2): 191-197. Zhang H J, Zheng X W, Qiao L, et al. Clinical significance of new glycosylation isoforms of histone D expressed in lung cancer and their correlation with prognosis[J]. J Anat, 2018, 49(2): 191-197. |
| [14] |
王继国, 王虹园, 李婷. miR-509-3p靶向RAP2B基因通过PI3K/AKT信号通路调控喉癌细胞增殖、迁移和侵袭[J]. 中国老年学杂志, 2021, 41(22): 5093-8. Wang J G, Wang H Y, Li T. MiR-509-3p targets RAP2B gene to regulate laryngeal cancer cell proliferation, migration and invasion via PI3K/AKT signaling pathway[J]. Chin J Gerontol, 2021, 41(22): 5093-8. doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2021.22.064 |
| [15] |
姚俊, 周慧, 张月飞. 喉癌患者血清IL-6及TNF-α的含量测定及其临床意义[J]. 河北医学, 2007, 13(7): 815-817. Yao J, Zhou H, Zhang Y F. Determination of serum IL-6 and TNF-α levels in laryngeal cancer patients and their clinical significance[J]. Hebei Med, 2007, 13(7): 815-817. doi:10.3969/j.issn.1006-6233.2007.07.022 |
| [16] |
陈旭东, 唐世雄, 张建华. 过表达FOXO4调控Wnt/β-catenin信号通路促进喉癌细胞凋亡的研究[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科, 2017, 24(11): 569-574. Chen X D, Tang S X, Zhang J H. Overexpression of FOXO4 regulates Wnt/β-catenin signaling pathway to promote apoptosis in laryngeal cancer cells[J]. Chin J Otorhinolaryngol Head Neck Surg, 2017, 24(11): 569-74. |
| [17] |
Kaczanowski S. Apoptosis: its origin, history, maintenance and the medical implications for cancer and aging[J]. Phys Biol, 2016, 13(3): 031001. doi:10.1088/1478-3975/13/3/031001 |
| [18] |
Hoesel B, Schmid J A. The complexity of NF-κB signaling in inflammation and cancer[J]. Mol Cancer, 2013, 12: 86. |