2. 安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，安徽 合肥 230022
2. Dept of Oncology, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China
G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛表达于多种组织中[1]。GRK2蛋白由689个氨基酸残基组成，其结构包括氨基端结构域、激酶结构域和羧基端结构域。GRK2不仅能磷酸化G蛋白偶联受体，参与其信号调节，还可以磷酸化多种非受体底物，并以激酶活性依赖的方式与其他底物相互作用[2]。GRK2也可与细胞内激酶信号分子直接作用并调节其活性，如PI3K/Akt、MEK1/2、p38 MAPK[3]。此外，GRK2还可结合并磷酸化细胞骨架蛋白，包括tubulin、ezrin、synuclein[4]。提示GRK2参与多种细胞内信号转导，进而影响疾病的发生发展。
1996年，Jaber等[5]提出，Grk2基因敲除纯合子(Grk2-/-)小鼠具有胚胎致死性。Grk2-/-胚胎在妊娠15.5 d之后无法存活，而Grk2基因敲除杂合子小鼠(Grk2+/-)在妊娠期之后正常存活，但小鼠体质量和体型与野生型小鼠相比较小，生长速度减慢[6]。GRK2在肝脏中表达丰富，肝脏中非实质细胞之一肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)位于肝窦的内皮间隙，占总肝细胞群的8%~10%[7]。由于HSC在肝脏中占比较低等特点[8]，本研究通过Cre-loxP重组酶系统特异性敲除C57BL/6J小鼠HSC中Grk2基因，为探究HSC中GRK2在肝脏疾病中的作用提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物Grk2fl/fl小鼠与Lrat-Cre小鼠，均购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。实验动物饲养繁殖于安徽医科大学临床药理研究所SPF屏障环境[实验动物使用许可证号：SYXK(皖)2020-001]。饲养环境为恒温(22±2)℃，湿度50%±5%，12 h/12 h昼夜交替。所有操作经安徽医科大学临床药理研究所实验动物伦理委员会批准。
1.1.2 主要试剂蛋白酶K，购自美国Sigma公司；2×Taq PCR Master Mix，购自北京博迈德基因技术有限公司；引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Super Red核酸染料，购自北京兰杰柯科技有限公司；抗β-actin抗体，购自Affinity公司；抗Desmin抗体，购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；抗GRK2抗体，购自美国Santa Cruz公司；Alexa Fluor 647山羊抗兔荧光二抗、Alexa Fluor 488山羊抗鼠荧光二抗，均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.1.3 仪器通用型电泳仪(北京六一生物科技有限公司，型号DYY-7C)；全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司，型号Tanon 5200)；正置光学显微镜(德国LEICA公司，型号DM4B)；冰冻切片机(德国LEICA公司，型号CM 1950)；PCR仪(美国BIO-RAD公司，型号T100)。
1.2 方法 1.2.1 HSC特异性敲除Grk2小鼠的构建策略与流程Grk2位于小鼠19号染色体，在其2号外显子的两端插入loxP位点(Fig 1A)。根据Cre-loxP原理，将带有loxP位点的Grk2fl/fl小鼠与HSC特异性表达Cre重组酶的Lrat-Cre小鼠交配，Cre酶在HSC内特异性识别loxP位点，实现在HSC内特异性敲除。将Grk2fl/fl小鼠与Lrat-Cre+/+小鼠进行交配得到Grk2fl/-/Lrat-Cre+/-的小鼠，将其与Grk2fl/fl小鼠进行杂交，对其子代进行鉴定并筛选得到Grk2fl/fl/Lrat-Cre+/-(Grk2ΔHSC)实验组小鼠和Grk2fl/fl/Lrat-Cre-/-对照组小鼠(Fig 1B)。
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| Fig 1 Establishment strategy (A) and flow chart (B) of Grk2ΔHSC |
将4周龄的小鼠进行编号，剪下3~5 mm的鼠尾，加入相应鼠尾裂解液和蛋白酶K，置于55 ℃恒温水浴锅消化过夜。次日3 000 r·min-1离心5 min，取200 μL裂解后产物，使用乙醇提取法获得小鼠DNA样本。依据引物(Tab 1)进行PCR反应。PCR体系的构成：12.5 μL 2×Taq Mix、9.5 μL去离子水、正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL和DNA模板(100 mg·L-1)1 μL，总体积25 μL。取13 μL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后在凝胶扫描成像系统显影，根据观察到的扩增片段长度进行基因鉴定。
| Primer | Sequence(5′-3′) | Band size/bp |
| Grk2-F | CCCACATAACTGGAAGAGAGAACC | WT: 326 |
| Grk2-R | CCAGGACTTGTCTATTGTTTGGC | Targeted: 431 |
| Lrat-Cre-F | GGGCAGTCTGGTACTTCCAAGCT | WT: 0 |
| Lrat-Cre-R | TCACATCCTCAGGTTCAGCAGG | Targeted: 391 |
观察实验组Grk2ΔHSC小鼠和对照组Grk2fl/fl小鼠的体质量、生长发育状态、繁殖能力等。
1.2.4 Grk2ΔHSC小鼠原代HSC的分离小鼠禁食12 h，麻醉后置于解剖台上，消毒后剪开腹腔，拨开肠道，暴露肝脏、肝门静脉与下腔静脉，于肝门静脉平行插入留置针，将Hank’s液用蠕动泵以合适的速度通过肝门静脉灌入肝脏，待肝脏变成淡白色，将Hank’s液替换为Ⅳ型胶原酶溶液，继续灌注。剥离肝脏，去除胆囊，把肝脏放入装有Ⅳ型胶原酶溶液的培养皿中。将肝脏剪碎并制成细胞团块悬浮液，置于37 ℃恒温水浴锅中消化30 min。消化完成后用滤网过滤肝脏悬浮液，然后4 ℃、2 000 r·min-1离心15 min，取沉淀弃上清液，用Hank’s液清洗沉淀，离心弃上清液。DMEM培养液重悬后，用25% Percoll和100% Percoll梯度离心分离，4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min。吸取中间层的细胞，再次4 ℃、2 000 r·min-1离心10 min，下层沉淀即为HSC。
1.2.5 免疫荧光双染检测HSC中GRK2的表达将小鼠肝脏用4%多聚甲醛固定24 h后，用15%蔗糖脱水24 h，再用30%蔗糖脱水24 h，最后用OCT包埋。冰冻切片机切片，厚度为6 μm。用PBS清洗3 min，重复3遍后，用0.5% Triton X-100通透30 min，再用50×EDTA冷修复10 min，PBS清洗3 min，重复3遍后，用5% BSA封闭1 h，加入Desmin抗体和GRK2抗体，4 ℃孵育过夜。次日复温1 h后，用PBS清洗5 min，重复3遍后，荧光二抗室温孵育1.5 h。PBS清洗后，DAPI孵育10 min，使用抗荧光淬灭剂封片，正置光学显微镜观察拍照。
1.2.6 检测Grk2ΔHSC小鼠HSC中GRK2蛋白表达将小鼠原代HSC加入裂解液(RIPA ∶PMSF=99 ∶1)研磨后，冰上裂解30 min，吸取裂解液，12 000 r·min-1离心20 min，取上清，加入上样缓冲液，煮沸10 min。进行SDS-PAGE电泳，转膜，PVDF膜用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入GRK2抗体和β-actin抗体4 ℃孵育过夜。加入对应二抗室温孵育2 h，用ECL发光显影液于凝胶成像系统中检测目的蛋白条带。采用ImageJ软件定量分析条带灰度值，根据GRK2与β-actin条带灰度值的比值，计算其相对表达量。
1.2.7 检测小鼠心脏、脾、肺和肾脏组织中GRK2蛋白表达称取适量小鼠肺、脾、肾脏和心脏组织于1.5 mL EP管中，加入裂解液后冰上裂解，12 000 r·min-1离心20 min，取上清弃沉淀，加入上样缓冲液，煮沸10 min，进行Western blot检测，步骤同“1.2.6”。
1.2.8 肝脏及其它器官组织HE染色将小鼠肝脏、肺、脾、心脏和肾脏组织石蜡包埋、切片，石蜡切片于二甲苯中脱蜡10 min，依次用梯度乙醇水化，使用苏木精染色，经流水洗去染料，0.1%的盐酸乙醇分化，流水冲洗后，0.5%伊红染液浸泡，流水冲洗多余染液，依次经梯度乙醇脱水，再经二甲苯浸泡，最后中性树脂封片。待树脂风干后，使用正置荧光显微镜观察并拍照。
1.2.9 统计学分析所有实验数据采用GraphPad Prism 8.3.0进行统计分析，实验结果用x±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 HSC特异性敲除Grk2小鼠的一般情况Grk2fl/fl/Lrat-Cre小鼠与Grk2fl/fl小鼠每日正常饮水，体质量无明显差异，生长发育良好，性情无变化。Grk2ΔHSC雌鼠每胎产4~9只小鼠，成活率>90%。
2.2 HSC特异性敲除Grk2小鼠基因鉴定6~8周的Grk2fl/-/Lrat-Cre小鼠与Grk2fl/fl小鼠交配产生子代基因型鉴定结果见Fig 2。使用flox引物和Cre引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳对基因型进行鉴定。若有Lrat-Cre重组酶基因，可扩增出391 bp的目的片段。若小鼠基因型为Grk2fl/fl纯合子，则仅扩增出431 bp的目的片段，若小鼠基因型为Grk2fl/-杂合子，则能同时扩增出431 bp和326 bp的片段。Fig 2中1、2、3、4、5均为带有391 bp的Lrat-Cre基因目的条带，其中1、3带有431 bp的Grk2fl/fl基因目的条带。结果提示，1和3为Grk2ΔHSC小鼠，2、4、5为Grk2fl/-/Lrat-Cre杂合子小鼠。
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| Fig 2 Results of genotype identification of mice by PCR M was DNA marker; 1 and 3 were Grk2ΔHSC mice; 2, 4 and 5 were Grk2fl/-/Lrat-Cre mice. |
HSC为肝脏非实质细胞，其中Desmin是HSC标记蛋白之一[7]。Fig 3免疫荧光结果显示，Grk2fl/fl小鼠肝组织中Desmin(绿色荧光)与GRK2(红色荧光)具有明显共定位(白色箭头)，而Grk2ΔHSC小鼠肝组织中未见明显的Desmin和GRK2共定位，提示Grk2ΔHSC小鼠HSC中GRK2的表达明显降低。为进一步确证HSC中GRK2已被敲除，分离Grk2ΔHSC小鼠的原代HSC，提取蛋白，利用Western blot检测GRK2蛋白表达。Fig 4结果显示，Grk2fl/fl对照组小鼠原代HSC中表达GRK2；与Grk2fl/fl小鼠相比，Grk2ΔHSC小鼠HSC中GRK2蛋白的表达明显降低，提示成功构建了Grk2ΔHSC小鼠模型。
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| Fig 3 Expression of GRK2 in HSC of Grk2ΔHSC mice by immunofluorescence double staining (×200) |
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| Fig 4 Expression of GRK2 in HSC of Grk2ΔHSC mice (x±s, n=6) **P < 0.01 vs Grk2fl/fl |
为了观察HSC中特异性敲除Grk2对其他器官组织中GRK2表达的影响，Western blot检测了其他主要组织中GRK2的表达情况。如Fig 5所示，在肺、脾、肾脏和心脏组织中，两组小鼠GRK2蛋白的表达差异无显著性。提示HSC中敲除Grk2基因对小鼠其他器官组织中GRK2蛋白的表达无明显影响。
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| Fig 5 Expression of GRK2 in other tissue (x±s, n=6) ns: no significant difference compared with Grk2fl/fl |
为分析HSC中Grk2敲除对小鼠肝脏组织的影响，HE染色观察Grk2ΔHSC小鼠肝脏组织形态。如Fig 6所示，Grk2ΔHSC和Grk2fl/fl小鼠肝组织中，均以中央静脉区为中心，呈放射状排列，肝小叶结构、形态正常，肝板排列整齐，肝细胞排列紧密，未见有变性、坏死、脂肪滴异常累积以及炎性细胞浸润。提示HSC特异性敲除Grk2对肝组织无明显影响。
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| Fig 6 HE staining results in liver tissue of Grk2ΔHSC and Grk2fl/fl mice |
为进一步明确HSC特异性敲除Grk2对其他组织是否有影响，HE染色观察小鼠肺、脾、心脏和肾脏组织。如Fig 7所示，Grk2ΔHSC小鼠与Grk2fl/fl小鼠肺组织中肺泡未见有增大，组织结构正常，间质无明显增宽等病变；两组小鼠脾组织中红、白髓边界清晰，生发中心清晰可见，脾索网络结构良好；心肌细胞排列整齐，大小无明显差异；两组小鼠肾小球形态完整无损伤，肾小管排列紧密无异常，未见炎性细胞浸润。以上结果表明，Grk2ΔHSC小鼠与Grk2fl/fl小鼠中其他器官组织学形态无明显改变。提示HSC特异性敲除Grk2基因小鼠并未影响肝脏及主要器官组织学形态。
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| Fig 7 Histopathological examination results of lung, spleen, heart and kidney tissues in Grk2ΔHSC and Grk2fl/fl mice (×200) |
由于小鼠和人类之间的遗传和病理生理学的相似性，基因工程小鼠模型通常是研究人类疾病的首选。然而，某些基因的全身性敲除小鼠可能会引起胚胎发育异常，纯合子致死等问题，导致没有存活的小鼠进行基因功能研究。由于基因的改变可能在不同的细胞和组织中发挥不同的作用，产生复杂的表型[9]。因此，细胞特异性敲除小鼠模型正逐渐成为研究的重要工具。Cre-loxP重组酶系统因其操作简单而被广泛应用于生物医学研究的基因编辑。Cre重组酶是整合酶家族的位点特异性重组酶，于1984年在噬菌体P1中发现，且是由噬菌体P38进行编码的单体蛋白[10]。单个38 ku的Cre重组酶识别两个重复的34个碱基对的loxP位点，介导相同方向的两个loxP位点之间的DNA片段缺失，或两个倒置的loxP位点之间的DNA片段翻转[11]。
肝脏是维持全身生理稳态的中枢器官，是一个高度结构化的器官，其最小结构单位是呈六边形的肝小叶。肝细胞占肝组织大部分，排列在沿小叶轴径向延伸的肝板中[12]。肝脏内的间质细胞包括HSC、成纤维细胞和血管平滑肌细胞等。HSC位于肝细胞和血窦之间的窦周间隙。在正常肝脏中，HSC有助于协调肝脏发育，维持细胞外基质正常结构[13]。HSC也分泌生长因子和细胞因子，并作为类维生素A或含维生素A代谢物的主要储存库。肝损伤后，HSC会失去含类维生素A的脂滴，分化为肌成纤维细胞。活化后的HSC表达α平滑肌肌动蛋白，并合成大量的胶原纤维，进而促进肝纤维化形成[14]。如果肝损伤得到改善，HSC数量将由于细胞凋亡而减少，剩余的将少部分去分化变为未激活的HSC，这些静止的HSC有助于去除纤维化瘢痕并重建HSC基底细胞外基质支架[15]。
本课题组前期研究发现，猪血清诱导的免疫性肝纤维化大鼠肝脏组织和原代HSC中GRK2表达水平随造模时间的延长有下降趋势，提示GRK2的表达变化可能在肝纤维化发生发展中具有重要的调控作用[16]。有研究表明，腺苷A2A受体的激活促进HSC产生胶原，从而参与肝纤维化的发生发展[17]。结合Khoa等[18]研究发现，GRK2磷酸化腺苷A2A受体使其脱敏，提示GRK2可能通过调节腺苷A2A受体脱敏从而参与肝纤维化。本研究采用两个方向相同的loxP位点标记在Grk2基因的两端，Lrat-Cre酶在HSC内识别并切除在两个loxP位点间的目的基因，产生Grk2基因缺失的重组DNA。选用Lrat-Cre工具鼠与Grk2fl/fl小鼠进行多代繁育和基因鉴定，最终得到Grk2ΔHSC小鼠。
本实验采用免疫荧光双染和Western blot检测小鼠HSC中GRK2的表达，结果显示与对照组相比，实验组小鼠HSC中GRK2水平明显降低，而在肺、脾、肾脏和心脏的表达变化差异无显著性，表明HSC特异性敲除Grk2基因小鼠表型符合预期。Grk2ΔHSC小鼠生长发育良好，子代存活率高。HE染色显示肝脏及主要器官组织(肺、脾、心脏和肾脏)结构正常，未见细胞变性、坏死和炎性细胞浸润等病变，与Grk2fl/fl小鼠组织形态学无明显差异。本研究为后续研究GRK2在肝脏疾病中的潜在作用提供了小鼠模型，后续研究将继续探讨HSC特异性敲除Grk2基因对肝脏疾病进程的影响，以进一步明确GRK2在肝脏疾病中的功能机制。
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