类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，以持续的炎症和关节损伤为特征[1]。主要的病理变化是滑膜细胞的增生和骨的破坏；对软骨、骨和其他邻近组织的损害往往是不可逆的，并且在疾病的后期阶段会造成残疾[2]。引起RA的原因很复杂，包括遗传因素、吸烟、微生物感染、激素、寒冷刺激和饮食等[3]。炎性细胞因子在RA的免疫病理中起着重要作用，如白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子－α(TNF-α)等水平升高，可诱导炎症细胞浸润和滑膜细胞增生。目前没有药物可完全治愈RA，临床上常用的药物有非甾体类抗炎药(NSAIDs)和糖皮质激素(GCs)类等。但这些药物的生物利用度低，频繁、长期使用会导致一些副作用，包括免疫缺陷和体液紊乱[4]。近年来，中草药已被广泛用于替代抗炎药物，研究表明用中药治疗RA的疗效更好，副作用更少[5]。
雷公藤在中医上广泛用于治疗RA，在《中华本草》中描述称“祛风除湿，消肿止痛，活血通络，清热解毒”[6]。半萜类、二萜类化学成分是雷公藤所含的主要成分，这些药效对肝脏、肾脏、心脏、生殖系统、血液系统等都存在很大的毒副作用，这使得雷公藤及其制剂在治疗RA过程中有一定限制[7]。雷公藤多苷(tripterygium glycosides，TG)是从雷公藤根部提取的有效成分，中国最早研究和使用的抗炎和免疫调节中药之一，被称为“中国首创植物新药”，不仅保留了雷公藤的免疫抑制作用，而且还消除了其许多有毒成分，没有其他中药可以替代它在RA治疗中的主要作用[8-9]。但研究发现随着日用剂量加大、用药时间延长，使用雷公藤多苷治疗RA毒副作用的发生风险也会随之增加，对肝、肾会造成一定程度的损伤[10]。因此，我们需要探索一种有效、安全的药物载体来提高雷公藤多苷的药理性能。
目前多从药物炮制、中药配伍、剂量改变、剂型修饰和常规检测与预防等方面进行探索，来提高药物应用的安全性。纳米制剂被广泛用于新剂型研发中，具有明显的优势，如增强生物相容性和靶向性，增强生物分布和优化对靶器官的治疗效果，提高药物疗效和减轻相关器官的毒副作用[11]。为了降低TG的毒性、在抗RA中更好发挥其免疫抗炎等作用，本研究通过将其制成雷公藤多苷纳米粒，建立胶原诱导型(collagen-induced arthritis，CIA)动物模型，研究其对RA的治疗作用。
1 材料 1.1 实验动物♂SD大鼠，6~8周龄，体质量(180±20)g，购自北京华阜康有限公司，许可证号为SCXK(京)2019-0008。购回后在河南中医药大学动物中心SPF级条件下饲养。符合动物伦理委员会的认可。
1.2 药品与试剂聚乙二醇6k－腙键－甲氧聚己内酯2k(PCL6k-HYD-MPEG2k)(西安齐岳生物科技有限公司，批号：QM02202103)，雷公藤多苷片(上海复旦复华药业有限公司，国家准字Z31020415)，雷公藤多苷(西安昊轩生物科技有限公司，LGTHS20180722，纯度99%)，雷公藤多苷纳米颗粒(实验室制备)。ELISA试剂盒TNF-α、IL-6和IL-1β(欣博盛生物科技股份有限公司，批号：R220617-102b、R220617-003b、R220617-007b)，牛Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂(美国Chondrex公司，批号：210532、210574)。天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，尿素氮(BUN)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒和肌酐(CRE)试剂盒(南京建成生物工程所，批号分别为：20220518、20220629、20220519、20220521)。
1.3 主要仪器酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：1510-02820C)、粒径分析仪(Brookhaven Instruments，型号：250144)，电子天平(梅特勒-托仪多仪器上海有限公司，型号：AL204)、透射电子显微镜[型号：JEM-1230(HC)]。
2 方法 2.1 TG-NPs的制备方法和质量控制称取雷公藤多苷6 mg、PCL6k-HYD-MPEG2k 30 mg分别加入适量丙酮溶解后混合。然后放置于烧瓶中，40 ℃条件下旋转蒸发直至底部出现均匀薄膜。转移至真空干燥箱20 ℃条件下放置12 h，除去丙酮。加入3 mL蒸馏水，800 r·min-1磁力搅拌2 h促进薄膜水合，250 W下超声处理5 min，促进纳米粒分散，然后过0.22 μm微孔滤膜，即得雷公藤多苷纳米粒(TG-NPs)。用透射电镜观察纳米粒的形态，动态光散射法检测纳米粒的粒径，高效液相色谱法(HPLC)测定纳米粒中的药物含量，测定包封率和纳米粒性质的稳定性，用于后续实验。
2.2 CIA模型的建立及分组给药在冰浴条件下将完全弗氏佐剂与牛Ⅱ型胶原1 ∶ 1充分乳化。在大鼠的脚趾、尾部、背部3个部位经皮注射混合乳剂，每只0.3 mL[12]。14 d后重复上述步骤。二次免疫后7 d，免疫组大鼠的脚趾肿胀、关节炎症指标均明显升高，提示CIA模型建立成功。再随机将其分为3组，即CIA模型组(Model)、雷公藤多苷组(TG)及雷公藤多苷纳米粒组(TG-NPs)。TG组每天灌胃6.25 mg·kg-1的雷公藤多苷片[13]，TG-NPs组尾静脉注射6.25 mg·kg-1的雷公藤多苷纳米粒，给药周期为2天1次，给药的第1天记为d 0，正常组、模型组给予等量的生理盐水，持续20 d。
2.3 一般情况监测从第2次免疫后的第7天开始，每2 d对各组大鼠的进食、精神与活动等进行监测和记录，并检测各给药组对CIA大鼠体质量的影响。
2.4 大鼠足趾肿胀度与关节炎指数的测定免疫后第7天开始，每隔1天用游标卡尺测量各组大鼠双脚的肿胀情况，进行评分并计算大鼠的关节炎指数(arthritis index，AI)，AI由所有关节炎指数之和构成，最高分值为16分。0分：足趾正常，无关节红肿；1分：足小趾关节红肿；2分：趾关节、足趾的关节红肿；3分：踝关节严重红肿，或踝以下足爪红肿；4分：踝关节和所有足趾肿胀，关节严重变形。
2.5 脏器指数的测定将大鼠处死后，取出其心脏、肝、肾、脾和睾丸等组织，用电子天平称重各脏器的质量。脏器指数＝脏器质量(g)/大鼠体质量(g)×100%。
2.6 大鼠脏器组织的病理形态学观察组织在多聚甲醛中固定24 h，用常规方法制备石蜡切片(厚度为3 μm)后，用苏木精－伊红(HE)染色，在显微镜下观察组织的形态学变化。
2.7 大鼠膝关节与踝关节滑膜组织病理形态学观察用药20 d后，进行麻醉，腹主动脉采血，将血标本静置后以3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清保存。之后取大鼠左后肢的膝关节和踝关节，用4%多聚甲醛溶液固定，切片并行HE与TUNEL染色，观察病理变化。
2.8 大鼠血清中ALT、AST、BUN、CRE及TNF-α、IL-1β、IL-6含量的测定ALT、AST用微板法检测，BUN用比色法，CRE用肌氨酸氧化酶法。TNF-α、IL-1β、IL-6的水平按照ELISA试剂盒的说明书，每项指标检测均严格按照各自试剂盒的说明进行，均用酶标仪检测。
2.9 统计学分析使用SPSS软件和GraphPad进行统计和数据分析。所有数据以x±s表示，单因素方差分析用于比较组间差异。
3 结果 3.1 TG-NPs的制备及质量评价 3.1.1 TG-NPs的形态及平均粒径在电镜下观察到纳米粒分布均匀，呈球形，有典型的环状结构。动态光散射法测定TG-NPs的粒径为(111.81±1.54) nm，(n=3)。PDI为0.157±0.009，表面带负电荷，Zeta电位为(-20.85±2.74) mV，见Fig 1。
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| Fig 1 Morphology, size distribution and potential distribution of nanoparticles under transmission electron microscopy(x±s, n=3) A: ×20 000; B: ×50 000; C: Particle size distribution; D: Potential distribution. |
使用高效液相法(HPLC)测定纳米粒中的药物含量，以TP为标准(加标)，在1~100 mg·L-1浓度下，TP有良好的线性关系y=18 744x-1 128.7 (r=0.999 9)。将TG-NPs超滤前总浓度及超滤后上层及下层液体浓度代入公式计算，得包封率为(73.22±0.58)%，(n=3)。
3.1.3 TG-NPs的稳定性测定为考察TG-NPs的稳定性，将TG-NPs分别存放在4 ℃冰箱和25 ℃环境下。结果如Fig 2所示，在4 ℃条件下，纳米粒的粒径、PDI及Zeta电位都保持在一个相对稳定的状态，当纳米粒保存在25 ℃条件下，粒径及PDI变化程度较大，表明7 d内纳米粒可以在4 ℃条件下稳定存在，且直至20 d基本上无变化。为模拟体内环境，将TG-NPs分别加入PBS和DMEM培养基(含10%FBS)，并置于恒温摇床中(100 r·min-1，37 ℃)，于特定时间点检测粒径、PDI及Zeta电位。结果显示，在PBS中，粒径与在去离子水中相比有所增加，但还是保持在相对稳定的状态，Zeta电位均有较为明显的下降；在DMEM培养基(含10%FBS)中，纳米粒的粒径及Zeta电位在去离子水中有所下降，PDI较在去离子水中明显升高。
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| Fig 2 TG-NPs size, PDI, Zeta in different environments (x±s, n=3) A, B and C were placed at 4 ℃ and 25 ℃ for 7 days, respectively. D, E and F were placed in PBS and DMEM medium containing 10% fetal bovine serum for 48 h at 37 ℃. |
免疫后，大鼠会出现乏力、尿量增多、食欲下降等症状。如Fig 3显示，与正常组相比，其余各组大鼠体质量明显降低(P < 0.01)；给药治疗后，TG-NPs组大鼠体质量相较于模型组明显提高(P < 0.05)。
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| Fig 3 Changes of body weight in each group (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal group; #P < 0.05 vs model group. |
与正常组比较，各组大鼠足趾肿胀度与关节炎指数均明显增加(P < 0.01)；与模型组比较，给药组大鼠肿胀度与关节炎指数降低(P < 0.05)，其中TG-NPs组疗效优于TG组(P < 0.05)，如Fig 4。
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| Fig 4 Changes in swelling degree of left (A) and right (B) foot and scores of arthritis index (C) in each group (x±s, n=6) **P < 0.01 vs normal group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model group, △P < 0.05, △△P < 0.01 vs TG group. |
与正常组相比，各组大鼠的脾、肾、睾丸指数均明显升高，差异具有统计学意义(P < 0.05，P < 0.01)；各组的肝指数均降低，差异没有显著性。见Tab 1。
| Group | Cardiac index | Liver index | Spleen index | Renal index | Testicular index |
| Normal | 0.30±0.04 | 2.84±0.51 | 0.16±0.03 | 0.63±0.05 | 0.68±0.05 |
| Model | 0.36±0.02** | 2.59±0.14 | 0.24±0.05** | 0.77±0.04** | 0.94±0.09** |
| TG | 0.36±0.02** | 2.67±0.16 | 0.23±0.01** | 0.74±0.04** | 0.92±0.04** |
| TG-NPs | 0.34±0.04* | 2.72±0.20 | 0.22±0.03** | 0.73±0.04* | 0.91±0.03** |
| *P < 0.05，**P < 0.01 vs normal group. | |||||
心脏组织病理学观察结果显示：大鼠各组的心肌细胞形态正常，排列清晰，无明显差异。肝脏组织病理学观察结果显示：大鼠肝细胞正常组无肿胀变形，肝索排列整齐；模型组排列较紊乱，部分细胞稍肿胀呈空泡状，炎性细胞浸润；TG组肝细胞排列紊乱，胞质疏松呈网状，炎性细胞浸润明显；TG-NPs组肝细胞排列较整齐、炎性细胞浸润不明显，形态接近正常。脾脏组织病理学观察结果显示，正常组脾脏小体呈圆形，结构清晰；模型组白髓结构紊乱，有大量凋亡小体；TG组白髓结构稍紊乱，有部分凋亡小体；TG-NPs组较TG组明显改善，白髓损伤明显减少。肾脏组织病理学观察结果显示：正常组与模型组肾小管细胞排列紧密，肾脏肾小球结构完整，管腔清晰可见；TG组肾小球萎缩明显，间质内纤维组织弥漫性增多。与TG组相比，TG-NPs组肾组织病变明显减轻。睾丸组织病理学观察结果显示：正常组大鼠睾丸形态正常，细胞层次宽，间质细胞发育良好，管腔内丝状精子细胞排列紧密，模型组大鼠管腔内丝状精子细胞少于正常对照组。在TG的毒性作用下，大鼠曲细精管出现萎缩变形，且管腔内精子细胞数量明显少于正常组。与TG组相比，TG-NPs组大鼠的睾丸组织病变有所减轻。见Fig 5。
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| Fig 5 Pathological micrograph of heart tissue of each group of mice stained with HE (×200) |
如Fig 6所示，正常组大鼠足趾正常，模型组大鼠足趾与踝关节肿胀明显，并伴有严重变形。TG组相比模型组肿胀较轻，变形不明显，TG-NPs组肿胀程度明显改善。从HE染色观察膝踝关节病理学变化，正常组细胞排列均匀整齐，细胞核清晰可见，着色均匀，未见滑膜增厚和血管新生；而模型组细胞排列杂乱，滑膜重度增生，部分细胞核坏死，着色不均，可见缺损和血管翳形成；TG相比于模型组，轻度增生，轻度血管新生及部分炎症细胞浸润；TG-NPs组细胞排列相对整齐，着色均匀，没有明显的增生，血管新生少，炎症细胞浸润少。提示经过治疗后，TG-NPs组对大鼠滑膜改善作用最为明显。
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| Fig 6 Photographs of right hind foot and histopathological analysis of knee and ankle (HE, ×200) |
如Fig 7所示，大鼠滑膜TUNEL染色后，阳性凋亡细胞核为棕黄色。模型组的滑膜细胞有少量的凋亡，TG组相较于模型组滑膜细胞凋亡指数升高(P < 0.05)，TG-NPs组相较于其他组滑膜细胞凋亡指数升高明显(P < 0.01)。
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| Fig 7 Knee and ankle TUNEL staining (A) (×200) and quantitative analysis (B-C) (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs normal group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model group; △△P < 0.01 vs TG group. |
如 Tab 2所示，与正常组相比，除BUN之外，所有模型组均有明显增加(P < 0.05)，TG-NPs组大鼠中的ALT、BUN、CRE水平相较于模型组明显降低(P < 0.05)，CRE水平相较于TG组下降明显(P < 0.05)。大鼠血清中的炎症因子，相比于正常组，模型组大鼠中TNF-α、IL-1β含量均明显增加(P < 0.01)，TG-NPs组均明显低于模型组(P < 0.05)，且效果优于TG组。见Tab 3。
| Group | AST/ U·L-1 |
ALT/ U·L-1 |
BUN/ mmol·L-1 |
CRE/ mmol·L-1 |
| Normal | 14.05±4.59 | 14.45±5.73 | 5.27±0.95 | 41.05±2.30 |
| Model | 37.26±16.06** | 21.08±5.42* | 6.19±1.19 | 52.36±10.96* |
| TG | 31.73±13.26* | 12.48±5.03## | 5.20±0.76 | 54.95±22.84 |
| TG-NPs | 27.07±14.92 | 9.61±1.30## | 4.91±0.55# | 38.25±7.36##△ |
| *P < 0.05，**P < 0.01 vs normal; #P < 0.05，##P < 0.01 vs model; △P < 0.05 vs TG. | ||||
| Group | TNF-α/ng·L-1 | IL-1β/ng·L-1 | IL-6/ng·L-1 |
| Normal | 26.31±8.05 | 26.51±3.61 | 35.79±17.27 |
| Model | 66.33±9.59** | 33.72±2.58** | 43.25±18.38 |
| TG | 53.14±7.79**# | 32.06±4.85* | 35.42±13.28 |
| TG-NPs | 42.22±8.53**##△ | 28.65±4.40# | 22.29±11.60# |
| *P < 0.05，**P < 0.01 vs normal; #P < 0.05，##P < 0.01 vs model; △P < 0.05 vs TG. | |||
RA是一种慢性全身性免疫疾病，通常表现为滑膜组织中炎症因子的过度分泌、关节软骨的侵蚀和血管翳的形成。与其他几种关节炎模型相比，大鼠胶原蛋白诱导的Ⅱ型关节炎(CIA)模型在病理学上与人类RA相似，目前普遍被作为RA的最佳模型[14]。在本研究中，通过皮下注射混合乳剂，在背部和掌垫的多个部位，建立大鼠CIA模型。与正常组相比，模拟大鼠表现为体质量减轻，尿量和食物消耗减少，脚趾关节肿胀变形，影响正常的活动，关节炎指数增加，表明CIA模型成功。
滑膜组织中炎症因子的过度产生是RA免疫病理的一个重要因素。这些因素包括TNF-α、IL-1β和IL-6。TNF-α已被证明可引起RA患者的各种T细胞功能障碍，在RA的活动期和晚期其分泌量增加，导致炎症反应增加，骨和关节破坏恶化[15]。IL-1β调节几种炎症因子的表达，促使炎症因子的协同增加。另一个重要的促炎因子IL-6作用于中性粒细胞，诱发炎症并可能导致关节破坏[16]。成纤维滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocyte，FLS)凋亡不足在RA的发病机制中起着重要作用：当RA患者的微环境发生改变时，FLS无法凋亡，开始异常增殖，释放出大量的细胞因子，刺激滑膜细胞增殖、严重的炎症细胞浸润、血管翳形成和随后的骨和关节侵蚀[17]。
纳米粒是由天然或合成的高分子材料制成。纳米载体可以将治疗药物运送到靶点，改善生物分布、药代动力学、稳定性和可溶性，并减少药物的毒副作用。本实验通过制备TG-NPs，得到符合小鼠尾静脉的理想粒径[(111.81±1.54) nm]，相较TG原药，纳米粒药物组的生化指标AST、ALT、BUN、CRE均明显下降，且有效减轻了TG对肾或肝等脏器的有害影响(Fig 5)，说明TG以纳米粒作为载体后能起到明显减毒作用，明显提高TG的用药安全性。同时，TG-NPs治疗组大鼠的足趾肿胀程度和关节炎指数下降，体质量增加。TNF-α、IL-1β、IL-6的表达明显降低，其表达与大鼠的足趾肿胀、AI指数严重程度成正比，而与体质量成负比。此外，还观察到纳米粒组大鼠凋亡指数明显升高，炎性细胞浸润减少。表明本实验制备的雷公藤多苷纳米粒可能通过抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，促进滑膜细胞凋亡，减轻CIA大鼠的炎症反应，保护软骨和关节滑膜，达到改善RA的目的。
综上所述，TG-NPs对CIA有较好的治疗作用，单独使用TG的毒副作用得到改善。这证明了所建立的纳米给药系统与其他常规药物相比，对RA具有优越的效果和较高的药物安全性，对今后的研究和开发具有参考价值。
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