2. 安徽医科大学 第一临床医学院，安徽 合肥 230032;
3. 安徽医科大学 第二临床医学院，安徽 合肥 230032
2. First Clinical Medical College, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. Second Clinical Medical College, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
肝癌是最常见的原发性恶性肿瘤之一，是一种高度异质性疾病。近年来，肝癌的死亡率和发病率都呈上升趋势[1]。在肝癌的治疗药物中，中药由于其毒副作用小、安全经济等优点受到了越来越多的关注。丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)是丹参中含量最丰富、生物活性最强的活性成分。它是一种酚类化合物，含有多种酚羟基，因此具有很强的抗氧化活性[2]。Sal B的抗氧化和抗纤维化特性已在先前的研究中得到证实[3]。并且Sal B已被证实能抑制肝癌细胞(HepG2)的迁移和侵袭，促进肝癌细胞(Bel-7404和SK-Hep-1)的自噬并诱导其凋亡[4-5]。为了进一步明确Sal B的抗肝癌作用，本研究选择了HuH-7细胞探究Sal B是否通过Hippo/YAP信号通路抑制HuH-7细胞。
Hippo/YAP信号通路是20年前在黑腹果蝇组织生长筛选中首次发现的。它是抑制果蝇组织生长的关键信号通路[6]。作为Hippo/YAP信号通路的核心，转录共激活因子Yes相关蛋白(transcriptional co-activators Yes-associated protein，YAP)和带有PDZ结合基序的转录共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)是Hippo/YAP信号通路的关键效应因子[7]。一旦Hippo/YAP信号通路被激活，其上游分子丝/苏氨酸蛋白激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1/2，MST1/2)就会被激活而磷酸化，从而磷酸化其下游分子大肿瘤抑制因子1/2(large tumor suppressor 1/2，LATS1/2)。最后导致YAP和TAZ被磷酸化并滞留在细胞质中，从而抑制组织和细胞的生长和增殖。相反，Hippo/YAP信号通路一旦关闭，YAP和TAZ就被去磷酸化并转移到细胞核中，与TEAD结合激活细胞增殖、生存和迁移的转录程序[8]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)作为YAP/TAZ/TEAD的关键靶基因，在肝癌组织中过表达[9]。近年来，Hippo/YAP信号通路已成为抑制肝细胞增殖、存活和肝癌形成的重要途径之一[10]。
1 材料与方法 1.1 细胞株HuH-7细胞由中国科学院细胞库提供。
1.2 试剂TGF-β1粉末(货号：100-21)购自美国PeproTech公司。Sal B (纯度≥ 98%，货号：PS0054-0020)购自成都普思生物科技公司。MST1/2抑制剂XMU-MP-1(货号：T4212)购自TargetMol Chemical公司。p-TAZ(#59971)、TAZ(#72804)、MST1(#3682)、CTGF(#86641)、Smad2(#5339)、p-Smad2C(Ser465/467)(#18338)和PAI-1(#49536)等抗体购自美国CST公司。p-MST1(#AF2367)、YAP(#AF6328)、p-YAP(Ser127)(#AF3328)、c-Myc(#AF6054)和GAPDH(#AF7021)等抗体购自江苏亲和生物科技有限公司。p-Smad2L(Ser250/255)抗体由日本关西医科大学Koichi Matsuzaki教授赠送。
1.3 仪器Axio Observer 3型倒置荧光显微镜(ZEISS)；ImageXpress MicroConfocal高内涵细胞成像分析系统平台(Moleculaf Devices)；DYY-10电泳仪(北京六一仪器厂)；BX-53型正置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)
1.4 细胞培养和药物处理以含10%胎牛血清的DMEM培养HuH-7细胞，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中。在细胞培养瓶中将HuH-7细胞培养至可传代的密度时，使用胰酶消化，将细胞悬液接种在培养皿或孔板中。实验分组如下：对照组、TGF-β1组、TGF-β1+Sal B组、5 μmol·L-1 XMU-MP-1组、5 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B组、10 μmol·L-1 XMU-MP-1组、10 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B组。根据实验分组分别加入TGF-β1 (9 pmol·L-1)、Sal B (50 μmol·L-1)、5 μmol·L-1 XMU-MP-1和10 μmol·L-1 XMU-MP-1处理24 h。随后，根据不同的检测指标分别对细胞进行相应的处理。Sal B和XMU-MP-1储备液的配置：将适量的Sal B和XMU-MP-1粉末溶解在DMSO溶液中，制成50 000 μmol·L-1 Sal B和10 000 μmol·L-1 XMU-MP-1溶液，分装后放入-80 ℃冰箱中保存。TGF-β1溶液的配置：将10 μg TGF-β1粉末溶于100 μL柠檬酸盐缓冲液，并用900 μL PBS缓冲液稀释，制成10 mg·L-1 TGF-β1溶液，分装后放入-80 ℃冰箱中保存。
1.5 CCK-8法检测细胞活力将HuH-7细胞以每孔100 μL细胞悬液接种在96孔板中，每孔细胞数约为5×103个，每组设立3个复孔。培养结束后，每孔分别加入10 μL CCK-8溶液，继续置于37 ℃，5%CO2的培养箱中孵育3 h。用酶标仪在吸光度为450 nm处检测HuH-7细胞的吸光度，并记录各组的吸光度值。
1.6 EdU实验检测细胞增殖将HuH-7细胞以每孔500 μL细胞悬液接种在24孔板中，每孔细胞数约为2.5×105个。用BeyoClick cells EdU细胞增殖试剂盒检测HuH-7细胞的增殖情况。将EdU溶液以适当比例用DMEM稀释，加入弃掉一半培养液的24孔板中。孵育2 h后，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，用含0.3% TritonX-100的PBS溶液通透细胞15 min，用click reaction solution避光孵育细胞30 min，用Hoechst33342对HuH-7细胞核进行染色，同样在避光条件下孵育10 min。孵育结束后用PBS溶液彻底洗涤细胞，用高内涵细胞图像分析系统采集图像。用ImageJ软件对EdU染色检测结果进行分析。
1.7 细胞划痕实验检测细胞迁移将HuH-7细胞以每孔2 mL细胞悬液接种于6孔板中，每孔细胞数约为1.2×106个。用无菌枪头在细胞贴壁部分划出一块空白区域，用PBS洗掉脱落的细胞，置于倒置显微镜下拍照记录0 h的细胞划痕宽度。培养24 h后，用PBS洗掉漂浮的细胞，置于倒置显微镜下拍照记录24 h的细胞划痕愈合情况。根据划痕宽度计算划痕愈合率，划痕愈合率=(W0 h-W24 h)/W0 h×100%。W0 h、W24 h分别表示0、24 h的细胞划痕宽度。
1.8 免疫荧光染色实验检测YAP和TAZ的表达将HuH-7细胞接种于置有细胞爬片的12孔板中，每孔接种1 mL细胞悬液，每孔细胞数约为5×104个。培养结束后，用4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min，用0.3% Triton X-100溶液通透细胞15 min，用quickblock封闭液封闭细胞60 min，然后与一抗(YAP和TAZ抗体)在4 ℃下孵育过夜。第2天，加入二抗(Cy3标记)，在室温下避光孵育1 h，然后与DAPI溶液在室温条件下避光孵育10 min。最后用PBS溶液充分洗净，取出细胞爬片，将细胞生长面置于滴加抗荧光猝灭剂的载玻片上，并于荧光显微镜下采集图像。采用Image J软件对免疫荧光染色结果进行分析。
1.9 Western blot检测Hippo通路相关因子的表达将HuH-7细胞以每孔2 mL细胞悬液接种于6孔板中，每孔细胞数约为2×106个。培养结束后，每孔加入100 μL裂解液(RIPA ∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂∶ EDTA=100 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1)，置于冰上裂解30 min，离心取上清液。用BCA试剂盒测定蛋白样品浓度后进行SDS-PAGE电泳，然后用印迹技术将整个细胞蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂乳液室温下封闭PVDF膜1 h，一抗孵育PVDF膜，置于4 ℃冰箱中孵育过夜。使用以下一抗：YAP(1 ∶ 5 000)，p-YAP(1 ∶ 5 000)，TAZ(1 ∶ 1 000)，p-TAZ(1 ∶ 1 000)，p-MST1(1 ∶ 1 000)，MST1(1 ∶ 1 000)，CTGF(1 ∶ 1 000)，GAPDH(1 ∶ 5 000)。将PVDF膜与二抗在室温下孵育1 h(稀释比例1 ∶ 5000)。用增强型化学发光ECL试剂覆盖PVDF膜后用ChemiDocTMMP成像系统采集图片。采用ImageJ软件对免疫印迹结果进行分析。
1.10 统计分析实验结果的所有数据均以x±s表示。所有数据的统计学意义采用单因素方差分析(ANOVA)。结果用GraphPad Prism 9软件进行分析，所有结果均重复3次。
2 结果 2.1 Sal B对HuH-7细胞增殖能力的影响CCK-8实验结果表明，与对照组相比，TGF-β1和XMU-MP-1均能刺激HuH-7细胞的增殖。与5 μmol·L-1 XMU-MP-1相比，10 μmol·L-1 XMU-MP-1对HuH-7细胞的作用更为明显。而Sal B的干预则可以逆转TGF-β1和XMU-MP-1的促增殖作用(Fig 1B)，差异具有统计学意义(P < 0.05)。同时，EdU实验结果也显示，经TGF-β1和XMU-MP-1处理后，EdU荧光标记的增殖的细胞核数量明显增加。但是，Sal B则抑制了这一趋势(Fig 2)，差异具有统计学意义(P < 0.05)。
|
| Fig 1 Effect of Sal B on viability of HuH-7 cells (x±s, n=3) A: Chemical structure of Sal B. B: CCK-8 assay was used to detect the viability of HuH-7 cells. 1:Control; 2: TGF-β1;3: TGF-β1+Sal B; 4:5 μmol·L-1 XMU-MP-1;5: 5 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B; 6: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1;7: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B. ##P < 0.01 vs the control group; **P < 0.01 vs the TGF-β1 group; ▽▽P < 0.01 vs the 5 μmol·L-1 XMU-MP-1 group; ▼▼P < 0.01 vs the 10 μmol·L-1 XMU-MP-1 group. |
|
| Fig 2 Effect of Sal B on proliferation of HuH-7 cells (x±s, n=3) EdU assay was used to detect the proliferation of HuH-7 cells (scale bar = 100 μm). 1:Control; 2: TGF-β1;3: TGF-β1+Sal B; 4:5 μmol·L-1 XMU-MP-1;5: 5 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B; 6: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1;7: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B.##P < 0.01 vs the control group; **P < 0.01 vs the TGF-β1 group; ▽▽P < 0.01 vs the 5 μmol·L-1 XMU-MP-1 group; ▼▼P < 0.01 vs the 10 μmol·L-1 XMU-MP-1 group. |
细胞划痕实验结果表明，与对照组相比，TGF-β1能够明显地刺激HuH-7细胞的迁移，Sal B则抑制了TGF-β1的促迁移作用，差异具有统计学意义(P < 0.05)。但是XMU-MP-1对HuH-7细胞的迁移功能几乎没有影响，并且10 μmol·L-1 XMU-MP-1对HuH-7细胞迁移功能的影响与5 μmol·L-1 XMU-MP-1相比，这两种浓度对HuH-7细胞迁移功能的影响差异不大(Fig 3)。
|
| Fig 3 Effect of Sal B on migration of HuH-7 cells (x±s, n=3) Wound healing assay was used to detect the migration of HuH-7 cells (scale bar = 100 μm). 1: Control; 2: TGF-β1; 3: TGF-β1+Sal B; 4: 5 μmol·L-1 XMU-MP-1;5: 5 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B; 6: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1;7: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs the control group; **P < 0.01 vs the TGF-β1 group. |
免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，TGF-β1和XMU-MP-1显著促进YAP和TAZ的荧光表达，差异具有统计学意义(P < 0.05)。并且与5 μmol·L-1 XMU-MP-1相比，10 μmol·L-1 XMU-MP-1对YAP和TAZ荧光表达的促进作用更为明显。但是，TGF-β1和XMU-MP-1对YAP和TAZ荧光表达的促进作用均被Sal B逆转(Fig 4A-B)。
|
| Fig 4 Effect of Sal B on YAP and TAZ expressions in HuH-7 cells (x±s, n=3) A: Immunofluorescent staining was used to detect the fluorescence intensity of YAP (scale bar=50 μm); B: Immunofluorescent staining was used to detect the fluorescence intensity of TAZ (scale bar=50 μm). 1:Control; 2: TGF-β1; 3: TGF-β1+Sal B; 4:5 μmol·L-1 XMU-MP-1; 5: 5 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B; 6: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1; 7: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs the control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs the TGF-β1 group; ▽P < 0.05 vs the 5 μmol·L-1 XMU-MP-1 group; ▼P < 0.05 vs the 10 μmol·L-1 XMU-MP-1 group. |
Western blot结果显示，与对照组相比，TGF-β1显著增加了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表达水平，而降低了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表达。而Sal B则抑制了TGF-β1的诱导作用，增加了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表达，降低了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表达(Fig 5-7)。
|
| Fig 5 Effect of Sal B on expressions of p-MST1 and MST1 proteins in HuH-7 cells (x±s, n=3) Western blot assay was used to detect the protein expressions of p-MST1 and MST1. 1:Control; 2: TGF-β1;3: TGF-β1+Sal B; 4:5 μmol·L-1 XMU-MP-1;5: 5 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B; 6: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1;7: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B. ##P < 0.01 vs the control group; *P < 0.05 vs the TGF-β1 group; ▽P < 0.05 vs the 5 μmol·L-1 XMU-MP-1 group; ▼P < 0.05 vs the 10 μmol·L-1 XMU-MP-1 group. |
|
| Fig 6 Effect of Sal B on expressions of p-YAP, YAP, p-TAZ, and TAZ proteins in HuH-7 cells (x±s, n=3) Western blot was used to detect the protein expressions of p-YAP, YAP, p-TAZ, and TAZ. 1:Control; 2: TGF-β1;3: TGF-β1+Sal B; 4:5 μmol·L-1 XMU-MP-1;5: 5 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B; 6: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1;7: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs the control group; *P < 0.05 vs the TGF-β1 group; ▽P < 0.05, ▽▽P < 0.01 vs the 5 μmol·L-1 XMU-MP-1 group; ▼P < 0.05, ▼▼P < 0.01 vs the 10 μmol·L-1 XMU-MP-1 group. |
|
| Fig 7 Effect of Sal B on expressions of CTGF protein in HuH-7 cells (x±s, n=3) Western blot was used to detect the protein expression of CTGF. 1:Control; 2: TGF-β1; 3: TGF-β1+Sal B; 4:5 μmol·L-1 XMU-MP-1; 5: 5 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B; 6: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1; 7: 10 μmol·L-1 XMU-MP-1+Sal B. ##P < 0.01 vs the control group; *P < 0.05 vs the TGF-β1 group; ▽▽P < 0.01 vs the 5 μmol·L-1 XMU-MP-1 group; ▼P < 0.05 vs the 10 μmol·L-1 XMU-MP-1 group. |
|
| Fig 8 Diagram of regulatory mechanism of Sal B and XMU-MP-1 in Hippo/YAP pathway in HuH-7 cells XMU-MP-1 directly inhibited the activity of MST1, thereby inhibiting the phosphorylation process of MST1, and inhibited p-MST1 could not phosphorylate LATS1. As a result, YAP and TAZ directly entered the nucleus, binding to TEAD to play a carcinogenic role. However, Sal B could inhibit the inhibitory effect of XMU-MP-1 on the activity of MST1 and activate the activity of MST1, so that YAP and TAZ were phosphorylated and degraded in the cytoplasm, and could not enter the nucleus to play a carcinogenic role. |
如Fig 5所示，与对照组相比，XMU-MP-1处理明显降低了p-MST1和MST1的蛋白表达，成功地验证了XMU-MP-1的作用，差异具有统计学意义(P < 0.05)。同时，与对照组相比，XMU-MP-1作用后，YAP、TAZ和CTGF的蛋白表达增加，而p-YAP和p-TAZ的蛋白表达降低。并且与5 μmol·L-1 XMU-MP-1相比，10 μmol·L-1 XMU-MP-1对上述蛋白的作用更为明显(Fig 5-7)。
3 讨论以上实验结果表明，Sal B能有效地抑制TGF-β1刺激的HuH-7细胞的增殖和迁移。此外，本研究还证实了Sal B对HuH-7细胞的抑制作用可能与Hippo/YAP信号通路有关。
HuH-7细胞系最早是在一名携带丙型肝炎病毒的日本男子身上发现的。从那时起，HuH-7细胞为丙型肝炎病毒的详细分子研究提供了一条新的途径[11]。已有研究证明[4]，Sal B可以通过调节Hippo/YAP信号通路抑制肝癌HepG2细胞。但一种药物可能对不同的细胞系有不同的影响。例如，抗病毒药物奥司他韦可以促进HepG2细胞的凋亡，但不能促进HuH-7细胞的凋亡[12]。Takuma等[13]对几种肝癌细胞系(包括HuH-7和HepG2细胞)进行体外细胞增殖实验，发现了HuH-7细胞对雷戈拉非尼最敏感。此外，我们还发现，在铁代谢、药物筛选和肝毒性研究方面，HuH-7细胞可能比HepG2细胞具有更大的优势[11, 14]。可能是Lin等[15]对几种肝癌细胞进行了肝毒性测试，发现HuH-7细胞与人类原代肝癌细胞具有最高的相似性。因此，本研究选择了HuH-7细胞，为Sal B抗肝癌作用的研究提供更全面的证据。并且本研究也发现了Sal B对TGF-β1和MST1/2抑制剂刺激的HuH-7细胞的迁移能力的影响与HepG2细胞相比，确实存在一些差别。在先前的研究中[4]，MST1/2抑制剂可以很明显的促进HepG2细胞的迁移，并且受到不同浓度的MST1/2抑制剂的影响，Sal B则可以抑制MST1/2抑制剂的促增殖作用。但是经过我们多次的实验论证，MST1/2抑制剂对HuH-7细胞迁移能力的影响很微弱，就算加大MST1/2抑制剂的浓度，也无法起到很明显的作用。我们猜测HuH-7细胞迁移能力对MST1/2抑制剂的不敏感可能与HuH-7细胞的高分化特性有关。
TGF-β1与肝纤维化、肝癌等肝病的发生发展密切相关。近年来，它在肝癌组织和癌旁基质中的上调表达引起了研究人员的兴趣[16]。因此，本实验选择TGF-β1诱导HuH-7细胞建立体外肝癌模型。MST1/2是Hippo信号通路的上游分子。当细胞受到外界信号的刺激时，MST1/2被激活从而激活Hippo信号通路。LATS1/2受激活的MST1/2的影响而被磷酸化，从而促进YAP和TAZ的磷酸化和降解。相反，当MST1/2缺失或被抑制时，YAP和TAZ进入细胞核并与TEAD结合，激活增殖和抗凋亡基因，如CTGF基因，以加速肝癌的增殖和发展[17]。因此，本实验采用5 μmol·L-1和10 μmol·L-1 MST1/2抑制剂来探讨在当MST1/2被抑制，Sal B对HuH-7细胞的抑制作用是否通过调节Hippo/YAP信号通路。
YAP/TAZ是Hippo信号通路的下游效应器，在动物发育过程中调节器官生长，促进受损器官的再生。然而，YAP/TAZ的过度激活可能导致小鼠癌症的发生[18]。本研究发现，在HuH-7细胞中，TGF-β1和XMU-MP-1明显降低了p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白表达水平，而增加了YAP、TAZ和CTGF的蛋白表达水平，其中10μmol·L-1 XMU-MP-1的作用更为明显。而Sal B可抑制TGF-β1和XMU-MP-1的刺激作用，降低YAP、TAZ和CTGF的蛋白水平，增加p-MST1、MST1、p-YAP和p-TAZ的蛋白水平。免疫荧光染色同样显示，Sal B可抑制YAP和TAZ的表达。这些结果都表明，Hippo信号通路的上游分子MST1被XMU-MP-1抑制，失活的MST1促进YAP和TAZ去磷酸化后入核，进而介导靶基因CTGF的表达，促进肝癌的发生。而Sal B可减弱XMU-MP-1的作用，提示Sal B可能通过增强MST1/2的活性，激活YAP/TAZ的磷酸化，从而减少YAP/TAZ入核。
在以上讨论的基础上，我们进一步提出了Sal B除了上调MST1/2的活性外，是否还有其他途径来减轻MST1/2抑制剂的影响，如抑制MST1/2的蛋白酶体活性或减少MST1/2的泛素化降解。这些问题需要我们在不久的将来进一步探索。
综上所述，本研究证实了Sal B能够抑制TGF-β1诱导的HuH-7细胞的增殖和迁移。我们推测Sal B的抗肝癌作用可能与激活Hippo/YAP信号通路有关。然而，关于Sal B激活Hippo/YAP信号通路具体的分子机制还没有明确的证据，需要进一步研究。本研究为Sal B的抗肝癌作用提供了一些数据，为其抗肝癌机制提供了新的见解。
| [1] |
Tang Y, Guo C, Yang Z, et al. Identification of a tumor immunological phenotype-related gene signature for predicting prognosis, immunotherapy efficacy, and drug candidates in hepatocellular carcinoma[J]. Front Immunol, 2022, 13: 862527. doi:10.3389/fimmu.2022.862527 |
| [2] |
田影, 何克江, 朱靖博. 丹酚酸B的体外抗氧化活性[J]. 大连工业大学学报, 2008, 27(4): 304-8. Tian Y, He K J, Zhu J B. Antioxidant activity of salvianolic acid B in vitro[J]. J Dalian Polytechnic Univ, 2008, 27(4): 304-8. |
| [3] |
阚悦, 杨雁. 基于Cleaved caspase-9研究丹酚酸B对肝纤维化细胞凋亡的影响[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(6): 827-32. Kan Y, Yang Y. Effect of salvianolic acid B on apoptosis of liver fibrotic cells based on cleaved caspase-9 protein[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(6): 827-32. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2019.06.018 |
| [4] |
Xu W, Shi Z, Yu X, et al. Salvianolic acid B exerts an anti-hepatocellular carcinoma effect by regulating the Hippo/YAP pathway and promoting p-Smad3L to p-Smad3C simultaneously[J]. Eur J Pharmacol, 2023, 939: 175423. doi:10.1016/j.ejphar.2022.175423 |
| [5] |
Gong L, Di C, Xia X, et al. AKT/mTOR signaling pathway is involved in salvianolic acid B-induced autophagy and apoptosis in hepatocellular carcinoma cells[J]. Int J Oncol, 2016, 49(6): 2538-48. doi:10.3892/ijo.2016.3748 |
| [6] |
Driskill J H, Pan D. The Hippo pathway in liver homeostasis and pathophysiology[J]. Annu Rev Pathol, 2021, 16: 299-322. doi:10.1146/annurev-pathol-030420-105050 |
| [7] |
Meng Z, Moroishi T, Guan K L. Mechanisms of Hippo pathway regulation[J]. Genes Dev, 2016, 30(1): 1-17. doi:10.1101/gad.274027.115 |
| [8] |
Ma S, Meng Z, Chen R, Guan K L. The hippo pathway: Biology and pathophysiology[J]. Annu Rev Biochem, 2019, 88: 577-604. doi:10.1146/annurev-biochem-013118-111829 |
| [9] |
Mao B, Hu F, Cheng J, et al. SIRT1 regulates YAP2-mediated cell proliferation and chemoresistance in hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene, 2014, 33(11): 1468-74. doi:10.1038/onc.2013.88 |
| [10] |
Liu Y, Wang X, Yang Y. Hepatic Hippo signaling inhibits development of hepatocellular carcinoma[J]. Clin Mol Hepatol, 2020, 26(4): 742-50. doi:10.3350/cmh.2020.0178 |
| [11] |
Vecchi C, Montosi G, Pietrangelo A. HuH-7: A human "hemochromatotic" cell line[J]. Hepatology, 2010, 51(2): 654-9. doi:10.1002/hep.23410 |
| [12] |
Huang P J, Chiu C C, Hsiao M H, et al. Potential of antiviral drug oseltamivir for the treatment of liver cancer[J]. Int J Oncol, 2021, 59(6): 109. doi:10.3892/ijo.2021.5289 |
| [13] |
Takuma K, Fujihara S, Fujita K, et al. Antitumor effect of regorafenib on microRNA expression in hepatocellular carcinoma cell lines[J]. Int J Mol Sci, 2022 Jan 31, 23(3): 1667.
|
| [14] |
Liu Y, Flynn T J, Xia M, et al. Evaluation of CYP3A4 inhibition and hepatotoxicity using DMSO-treated human hepatoma HuH-7 cells[J]. Cell Biol Toxicol, 2015, 31(4-5): 221-30. doi:10.1007/s10565-015-9306-9 |
| [15] |
Lin J, Schyschka L, Mühl-Benninghaus R, et al. Comparative analysis of phase Ⅰ and Ⅱ enzyme activities in 5 hepatic cell lines identifies HuH-7 and HCC-T cells with the highest potential to study drug metabolism[J]. Arch Toxicol, 2012, 86(1): 87-95. doi:10.1007/s00204-011-0733-y |
| [16] |
Pang M, Teng Y, Huang J, et al. Substrate stiffness promotes latent TGF-β1 activation in hepatocellular carcinoma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017 Jan 29;483(1): 553-8.
|
| [17] |
Qiu Y, Huang D, Sheng Y, et al. Deubiquitinating enzyme USP46 suppresses the progression of hepatocellular carcinoma by stabilizing MST1[J]. Exp Cell Res, 2021, 405(1): 112646. doi:10.1016/j.yexcr.2021.112646 |
| [18] |
Moya I M, Halder G. Hippo-YAP/TAZ signalling in organ regeneration and regenerative medicine[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2019, 20(4): 211-26. doi:10.1038/s41580-018-0086-y |