支气管哮喘(bronchial asthma)属朝医学“哮喘”范畴，是以气道炎症(airway inflammation)和气道重塑^[1](airway remodeling)为明显病理标志的呼吸系统疾病。鹿茸大补汤为太阴人哮喘代表方剂，有补肺气益精血的功用。课题组前期研究显示鹿茸大补汤能够通过WNT5A、TLR4等通路调控哮喘相关蛋白的表达^[2]，但是对通路间是否存在交互作用尚未验证。故本次利用朝医鹿茸大补汤对WNT5A和TLR4信号通路交互调节的机制进行研究。

1 材料与方法 1.1 实验材料、试剂 1.1.1 细胞

人支气管上皮细胞(BEAS2B)购买于广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.1.2 药品与试剂

鹿茸10 g，麦冬、薏苡仁各7.5 g，麻黄、山药、杏仁、天冬、五味子各5 g，购自延吉市北京同仁堂第一分店药店。按照文献[3]记录方法由延边大学药学院制作鹿茸大补汤冻干粉，用DMSO溶解后微孔滤膜过滤。冻干粉的主要成分为哌嗪类生物碱、类黄酮、氰苷类、甾体类等，与水煎液HPLC结果一致^[4]。anti-WNT5A(货号bs-1984R)、anti-TLR4(货号bs-1021R)、anti-NF-κB p65(货号bs-20160R)、anti-β-Actin(bs-0061R)购自北京博奥森有限公司。

1.1.3 仪器

AI600超灵敏化学发光成像仪(美国GE公司)；cytation5多功能成像酶标仪箱(美国Bio-Tek公司)。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞的分组

将细胞分为正常组、IL-13组、DMSO组、LRDBT组、DEX组；W+T-组(ICG+TAK-242)、W+T+组(ICG+LPS^[5])、W-T+组(FrpHE+LPS)、W-T-N+组(FrpHE+TAK-242、+PMA)，以上处理药物均为100 μmol·L^-1，处理后共同给予10 μg·L^-1的IL-13刺激细胞24 h。

1.2.2 MTT药物浓度筛选

给予不同浓度的鹿茸大补汤冻干粉，检测A值。

1.2.3 Western blot检测WNT5A、TLR4和NF-κB蛋白表达

提取细胞蛋白，进行蛋白印迹实验。

1.2.4 免疫荧光(IF)检测细胞内NF-κB蛋白表达

加入抗体培养，在成像仪下观察拍照。

1.3 统计学分析

实验结果以x±s表示，实验数据应用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0进行分析。

2 结果 2.1 MTT药物浓度筛选

与Control组相比，IL-13刺激组细胞的增殖量明显升高(P＜0.01)，以2.5 mg·L^-1为药物浓度梯度进行MTT实验，结果显示鹿茸大补汤冻干粉浓度为10 mg·L^-1时细胞增殖趋于稳定(P＜0.01)。

2.2 Western blot检测细胞中WNT5A、TLR4和NF-κB蛋白水平的表达

与Control组相比，W+T-和W-T+组中以上蛋白表达上升；与W+T-和W-T+组相比，W+T+组以上蛋白表达明显上升。与Control组相比，IL-13组和DMSO组中以上蛋白表达水平上升；与IL-13组和DMSO组相比，LRDBT组和DEX组以上蛋白表达水平下降。

2.3 IF检测细胞内NF-κB表达

在微孔成像仪下观察拍照可知，与Control组相比，IL-13组胞内荧光亮度增高，证明NF-κB的表达升高；与IL-13组相比，LRDBT组胞内荧光亮度减弱，证明NF-κB的表达降低，且在核内胞质均有表达。

3 讨论

气道重塑中TLR4和WNT信号通路均可激活NF-κB，另一方面LPS与TLR4结合并激活NF-κB以诱导WNT5A的表达^[6]。综上所述，鹿茸大补汤不仅单独调控WNT5A或TLR4信号通路，还可以抑制WNT5A和TLR4信号通路交互作用对NF-κB叠加影响，进而改善气道重塑，为哮喘的治疗提供了另外的选择。