结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是当今最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率仅次于肺癌及胃癌，位列恶性肿瘤第3位。目前CRC的治疗强调以手术为主，辅以放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等手段。“药食同源”中药既是食品又是药品，具有饱腹之功、疗病之效[1]，对降低CRC的发病率和死亡率具有重要的意义。研究表明，覆盆子[2]、马齿苋[3-4]、砂仁[5]等药食同源中药对肠炎及CRC有治疗作用。苹果酸(Malic acid)是其活性成分之一，抑制肿瘤生长和转移，还可以降低化疗药物的毒副作用，提高化疗药物的使用剂量[6]。但目前关于苹果酸对肠道疾病的治疗效果具体分子机制研究尚少。因此，我们将对苹果酸对CRC的抑制作用及其分子机制进行初步研究。
1 材料与方法 1.1 细胞株、试剂与仪器人结直肠癌细胞株LoVo、HCT8和HCT116，均保存于本实验室。苹果酸二甲酯(Dimethyl malate, DMM)购自美国Sigma-Aldrich公司，ERK1/2和p-ERK1/2抗体购自Proteintech Group公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人结直肠癌细胞株LoVo、HCT8和HCT116均为贴壁细胞，含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养于含有5%的CO2、37 ℃细胞培养箱中。
1.2.2 细胞计数为了检测苹果酸处理后细胞的增殖情况，将LoVo和HCT8细胞接种于24孔板(1×104个/孔)，经不同浓度苹果酸处理后，每24 h使用台盼蓝排除法进行细胞计数，持续4 d，绘制生长曲线。
1.2.3 细胞克隆形成为了检测苹果酸处理后细胞的克隆形成率，将LoVo和HCT8细胞接种于6孔板(1×104个/孔)，经不同浓度苹果酸处理后，在5% CO2、37 ℃的条件下培养7 d，加入甲醇固定15 min，结晶紫染色15 min，洗去浮色，晾干，拍照并计算克隆形成率。
1.2.4 蛋白免疫印迹分析不同浓度苹果酸与HCT116细胞分别共同孵育48 h后，收集细胞，RIPA裂解并提取总蛋白，进行浓度测定、电泳、转膜、封闭、抗体孵育，最后使用ECL发光试剂在暗室曝光。
1.2.5 统计学分析采用SPSS 26.0统计软件对实验结果进行分析处理。结果以x±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 苹果酸对LoVo和HCT8细胞增殖的影响LoVo细胞分别用0、2.5、5及10 mmol·L-1的苹果酸处理，HCT8细胞分别用0、2、4及8 mmol·L-1的苹果酸处理。细胞计数的实验结果显示，与对照组相比，苹果酸明显抑制LoVo和HCT8细胞的生长速度，且具有剂量相关性，差异具有统计学意义(P＜0.05, P＜0.01)，见Tab 1和Tab 2。说明苹果酸可能抑制结直肠癌的细胞增殖能力。
| Group | Dose/mmol·L-1 | Day 0 | Day 1 | Day 2 | Day 3 | Day 4 |
| Control | - | 10 000 | 20 030±1 985 | 43 898±4 940 | 114 150±6 029 | 294 057±19 359 |
| DMM | 2.5 | 10 000 | 15 345±5 587 | 30 397±6 239* | 76 000±4 866** | 205 062±20 569** |
| 5 | 10 000 | 12 772±2 324* | 20 167±4 848** | 38 917±5 457** | 90 603±7 150** | |
| 10 | 10 000 | 4 570±1 413** | 2 200±626** | 2 400±1 600** | 1 058±470** | |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs Control. | ||||||
| Group | Dose/mmol·L-1 | Day 0 | Day 1 | Day 2 | Day 3 | Day 4 |
| Control | - | 10 000 | 10 908±1 930 | 41 208±4 893 | 147 517±5 387 | 288 275±9 111 |
| DMM | 2 | 10 000 | 7 800±1 300 | 19 600±1 732** | 91 092±3 214** | 182 667±4 822** |
| 4 | 10 000 | 4 900±1 126* | 16 042±2 366** | 68 073±6 472** | 117 985±12 766** | |
| 8 | 10 000 | 9 020±1 576 | 20 847±2 174** | 63 973±6 501** | 104 965±5 354** | |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs Control. | ||||||
根据Tab 3、4结果，苹果酸组细胞的克隆形成数明显低于对照组(P＜0.01)，且呈现剂量依赖性。说明苹果酸对结直肠癌的克隆形成能力具有抑制作用。
| Control | DMM/mmol·L-1 | |||
| 2.5 | 5 | 10 | ||
| Number of clone | 825±110 | 711±63 | 423±71** | 96±17** |
| **P＜0.01 vs Control. | ||||
| Control | DMM/mmol·L-1 | |||
| 2 | 4 | 8 | ||
| Number of clone | 547±66 | 443±52 | 185±48** | 60±33** |
| **P＜0.01 vs Control. | ||||
为了进一步探讨苹果酸抑制结直肠癌细胞增殖的潜在机制，通过免疫印迹实验检测不同浓度苹果酸处理前后的HCT116细胞中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平。结果显示，2、4和8 mmol·L-1的苹果酸明显减小p-ERK1 /2与ERK1 /2的比值，见Tab 5。提示苹果酸抑制结直肠癌细胞的增殖有可能与ERK1 /2通路有关。
| Dose | Control | 2 mmol·L-1 | 4 mmol·L-1 | 8 mmol·L-1 |
| p-ERK1/2/ERK1/2 | 1.26±0.09 | 1.17±0.11* | 1.12±0.10** | 0.93±0.09** |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs Control. | ||||
CRC是当今世界第四大常见的肿瘤类型[7]，我国CRC发病率及死亡率也均呈现明显的上升趋势。CRC的常规临床治疗手段为手术及放化疗等，然而，由于手术应激、放化疗的毒副作用及药物耐药等情况的出现，寻找毒性更低、效果更好的治疗方法仍十分重要。随着研究的深入，药食同源中药在抗肿瘤治疗中的优势逐渐显露出来。苹果酸作为一种药食同源中药单体，本研究发现，苹果酸对CRC细胞的增殖具有明显的抑制作用，有望成为前景可观的抗癌药物。
细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)是介导信号转导至核内的重要细胞信号分子，其参与从质膜到胞核的信号转导，是细胞增殖、分化、凋亡等的重要调节因素，在CRC发生发展中起到重要作用[8]。本研究发现，苹果酸明显降低ERK1/2的磷酸化水平，推测苹果酸抑制CRC细胞增殖与ERK1/2通路有关。后续我们将对此分子机制开展进一步研究。
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