2. 上海中医药大学附属普陀区中心医院，上海 200062;
3. 复旦大学基础医学院病理系，上海 200032
2. Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200062, China;
3. Dept of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China
糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最为常见的微血管并发症，发病率约为20%~40%，并已成为全球范围内导致慢性肾脏病及终末期肾病的首要病因[1-2]。DN在病程中可涉及肾小球及肾小管间质的诸多病理变化，如细胞外基质增多、足细胞表型改变及肾纤维化等，推动着DN向终末期肾病的进展。Yes相关蛋白(Yes associated protein，YAP)是Hippo信号通路下游的重要效应分子[3]，可直接调控包括结缔组织生长因子(CTGF)在内的多种细胞因子的转录[4]。其在慢性肾脏病中的作用近年来开始受到诸多学者的关注。DN的众多病理进程，如足细胞损伤、系膜细胞增生及肾间质纤维化等[4-6]均有YAP的参与。
益肾化湿颗粒(Yishen Huashi Granule，YSHS)(国药准字Z20090250)源于李东垣《脾胃论》中的经典方剂“升阳益胃汤”，具有升阳补脾、益肾化湿、利水消肿的功效，主治以脾肾亏虚为主的DN，临床疗效及安全性较好[7]。国内学者采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术对YSHS主要成分进行了准确定性，共鉴定出包括香豆素类、三萜类、黄酮类化合物在内的主要成分68个。其中，柴胡皂苷A、黄芪甲苷III/IV、泽泻醇A等与肾病的预测靶点有良好的结合活性，并能参与晚期糖基化产物-中膜产物受体信号通路在内的多条通路。说明该药具有多成分、多靶点、多途径的特点[8]。另有研究表明，YSHS可上调DN小鼠nephrin、podocin等足细胞功能蛋白[9]，而下调CTGF的过表达则能改善足细胞功能蛋白的表达减少[10]。本研究从YAP/CTGF信号通路入手，观察YSHS对DN小鼠YAP的调控作用及由此对CTGF与足细胞功能蛋白nephrin、wilm′s tumor 1(WT1)及podocalyxin mRNA表达的影响，探讨该药改善DN肾小球病理损伤的可能机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物8周龄雄性C57BL6小鼠，SPF级，体质量(22~25) g，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2018-004，合格证号：20180004025908。小鼠饲养于SPF级动物房中，环境温度(23~25)℃，湿度40%~70%，分笼饲养，自由进水，保持良好通风环境，标准动物干饲料，12 h交替照明。
1.1.2 药物益肾化湿颗粒(YSHS)，由广州康臣药业有限公司提供。组分：人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜、大枣，10 g/袋。维替泊芬(vertepofin，VP)(编号SML0534)，购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.1.3 主要试剂链脲佐菌素(STZ)(S0130)购自美国Sigma-Aldrich公司。小鼠血肌酐(serum creatinine，Scr)试剂盒(C011-2-1)、尿素氮(blood urea nitrogen，Bun)试剂盒(编号C013-2-1)及尿蛋白(urine protein，Upro)试剂盒(C035-2-1)，均购自南京建成生物工程研究所。YAP抗体(14074T)及磷酸化-YAP丝氨酸127抗体(p-YAP S127)(13008T)均购自美国CST公司，CTGF抗体(ab6992)购自英国Abcam公司。
1.2 方法 1.2.1 模型建立及分组给药从28只C57BL/6小鼠中随机抽取7只作为对照组，其余21只通过STZ诱导建立DN小鼠模型。采取连续5 d腹腔注射2%的STZ (50 mg·kg-1、0.1 mol·L-1、pH 4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)，其中首次注射前禁食24 h，d 2~5注射前禁食6 h，对照组给予等体积溶媒。末次注射72 h后尾静脉取血检测血糖，以血糖≥16.7 mmol·L-1，尿蛋白定量超过正常对照组，且大于原24 h尿蛋白量150%(连续出现2次以上)[11]为DN模型制备成功。随机分为模型组、YSHS组和VP组，每组7只，第8周结束后开始干预。其中YSHS组给予YSHS每日一次性灌胃5 g·kg-1，VP组为隔日腹腔一次性注射25 mg·kg-1，对照组与模型组给予等体积生理盐水一次性灌胃。
1.2.2 尿蛋白、血肌酐及尿素测定留取给药前后小鼠尿液标本双缩脲法测定Upro。干预结束后处死小鼠，腹主动脉取血，3 000 r·min-1离心15 min取上层血清，分别用肌氨酸氧化酶及脲酶法检测Scr及Bun水平。
1.2.3 HE染色观察取小鼠肾皮质组织，10%中性甲醛溶液内固定24 h后，常规脱水、二甲苯透明及石蜡包埋，制成4 μm切片。行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，二甲苯透明，烤干后中性树胶封片，光镜观察肾小球系膜区改变情况。根据肾小球系膜区增宽程度分为轻度(系膜区宽度<毛细血管襻直径)、中度(系膜区宽度>毛细血管襻直径) 及重度(系膜基质挤压襻呈结节、团块或分叶状)进行评估。
1.2.4 Western blot检测采用Western blot法对YAP、p-YAP S127及CTGF的蛋白表达进行测定。取部分肾皮质组织提取总蛋白。100 ℃ 10 min蛋白变性后加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转入PVDF膜。用5%脱脂奶粉TBST浸泡PVDF膜，室温摇床封闭1 h后，加入一抗兔抗YAP抗体(1 ∶1 000)，抗p-YAP S127抗体(1 ∶1 000)，抗CTGF抗体(1 ∶1 000)，并以GAPDH(1 ∶1 000)为内参在4 ℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜3次，每次5 min，加入羊抗兔IgG-HRP(1 ∶5 000)，37 ℃孵育1 h，再次洗涤3次。显影曝光后ImageJ软件分析结果。
1.2.5 RT-PCR检测引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成(Tab 1)。采用TRIzol Reagent一步法提取总RNA后，稀释并逆转录，将制备好的cDNA用于PCR扩增，各指标均扩增40个循环，以β-actin为内参，YAP、CTGF、nephrin、WT1和podocalyxin的mRNA相对表达量用2-ΔΔCt表示。引物序列，见Tab 1。
| Gene | Primer sequence (5′-3′) | Annealing Temperature (℃) | Product size (bp) |
| YAP | Forward：ATTTCGGCAGGCAATACGGA Reverse：CATCCTGCTCCAGTGTAGGC |
60.11 60.08 |
101 |
| CTGF | Forward：CAATGCACTTGCCTGGATGG Reverse：CAACTGCTGTGCGGTCCTT |
59.83 60.89 |
160 |
| nephrin | Forward：AGAAGCTCCACGGTTAGCAC Reverse：CCTGTGAAGGCTTGGCGATA |
60.04 60.11 |
116 |
| WT1 | Forward：CTGGACTTCCTCCTGTCGC Reverse：CTGCGATCCTGCGGATTCT |
59.78 59.93 |
170 |
| podocalyxin |
Forward：CACCCAGTGGCATCTACACTT Reverse：CTCGGAGACACTGGAAGTCA |
60.00 58.75 |
147 |
| β-actin | Forward：GGCTGTATTCCCCTCCATCG Reverse：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT |
60.34 59.78 |
281 |
采用SPSS 26.0软件进行统计分析，实验结果以x±s，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。
2 结果 2.1 YSHS对DN小鼠肾功能、尿蛋白的影响如Tab 2所示，与对照组相比，第12周时，模型组小鼠Scr及Bun水平均明显升高(P < 0.01)。YSHS组、VP组相较于模型组，Scr、Bun水平均有较明显改善(P < 0.01，P < 0.05)。与同期对照组相比，DN小鼠在第8周和第12周时的Upro均明显升高(P < 0.01)，经YSHS、VP治疗4周后，两组各自的Upro较同期模型组均明显下降(P < 0.01)。
| Group | Scr (umol/L) | Bun (mmol/L) | Upro (mg/L) at 8wks | Upro (mg/L) at 12wks |
| Normal control | 30.5±17.3 | 3.44±0.55 | 259.47±38.01 | 260.50±40.91 |
| Model | 139.6±31.2** | 11.65±2.37** | 585.09±102.93** | 771.28±141.92** |
| YSHS | 82.0±32.0## | 8.60±1.52## | 596.13±81.47** | 593.24±125.11## |
| VP | 104.6±29.0# | 7.27±1.77## | 584.52±129.70** | 591.16±130.28## |
| **P < 0.01 vs normal control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model. | ||||
如Fig 1所示，对照组肾小球结构基本正常。与对照组相比，模型组肾小球系膜区基质明显增多，系膜区宽度>毛细血管襻直径(中度增宽)；而经YSHS与VP治疗后，上述病理表现较模型组有所减轻。
|
| Fig 1 Effect of Yishen huashi Granule on pathological changes in glomerulus of mice(HE ×400) A: Normal control; B: Model; C: YSHS group; D: VP group. Red arrow for mesangial matrix accumulation and area widened. |
Western blot结果显示，与对照组相比，模型组小鼠YAP、p-YAP S127及CTGF蛋白表达明显增加(P < 0.01)。经VP治疗后YAP、p-YAP S127和CTGF的蛋白表达较模型组明显下降(P < 0.01)。而经YSHS治疗后，三者的表达较模型组亦有明显下降(P < 0.01)，见Fig 2。
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| Fig 2 The protein expression of YAP, p-YAP S127 and CTGFin renal cortex among each group (x±s, n=7) 1, 2:Normal control (NC) group; 3, 4: Model group; 5, 6: VP group; 7, 8: YSHS group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Normal control group; ##P < 0.01 vs Model group; ▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01 vs VP group. |
如Fig 3所示，与对照组比较，模型组YAP与CTGF的mRNA表达量均有所上升(P < 0.01，P < 0.05)。与模型组比较，YSHS组两者的mRNA均有所下降(P < 0.01)，其中CTGF的mRNA表达量亦低于对照组水平(P < 0.01)。与对照组、模型组比较，VP组两者的mRNA表达量明显下降(P < 0.01)，其中YAP的mRNA表达量亦明显低于YSHS组(P < 0.01)。
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| Fig 3 Relative mRNA expression of YAP and CTGF in renal cortex among each group (x±s, n=7) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Normal control group; ##P < 0.01 vs Model group; ▲▲P < 0.01 vs VP group. |
如Fig 4所示，与对照组比较，模型组nephrin、WT1和podocalyxin的mRNA表达量明显下降(P < 0.01)。与模型组比较，YSHS组三者的mRNA表达量均明显上升(P < 0.01)，而VP组nephrin、podocalyxin的mRNA表达量有所上升(P < 0.01，P < 0.05)，但WT1的mRNA表达量与模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。
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| Fig 4 Relative mRNA expression of nephrin, WT1 and podocalyxin in renal cortex among each group (x±s, n=7) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Normal control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Model group; ▲▲P < 0.01 vs VP group. |
DN的主要临床表现有蛋白尿、低蛋白血症性水肿及肾功能不全，故中医属于“尿浊”、“水肿”、“虚劳”等范畴，病机上则多因脾失健运，并由脾及肾，导致脾肾两虚而引发。益肾化湿颗粒秉承“升阳益胃汤”方义，是从脾论治的代表方剂。临床研究表明，该药与利格列汀联用可有效降低DN患者肾功能相关指标[7]。本研究中，经YSHS治疗后的DN小鼠，尿蛋白浓度、血肌酐及尿素水平上均有明显下降，再次证实了该药在减少蛋白尿及延缓肾功能进展方面的作用。
YAP是Hippo信号通路下游的核心元件之一，具有通过进入细胞核促进转录增殖来调节细胞生长、分化及凋亡的作用。该作用又与YAP的磷酸化密切相关。通常，YAP以磷酸化的形式滞留在胞浆中，只有去磷酸化的YAP才能入核发挥相应的生物学功能。YAP可参与DN病程进展过程中的多个环节。在db/db小鼠中，YAP表达增多是导致肾小球系膜细胞增生及系膜区基质增多的重要原因[5]。肾近曲小管上皮细胞中YAP的活化可促进DN肾间质纤维化，而上述进程可通过YAP抑制剂VP的干预得到改善[4]。此外，过表达的YAP还能诱使足细胞重新进入细胞周期并发生去分化，造成足细胞表型的改变[12]。与上述文献报道相符，本研究中DN小鼠肾皮质组织中的YAP在蛋白与mRNA表达水平上均明显升高，经YSHS治疗后，上述指标均出现不同程度的下降且肾小球系膜区基质增多情况亦得到改善，说明该药具有下调YAP表达，以减轻肾小球系膜区病理损伤作用。我们还发现，经YSHS治疗后p-YAPS127蛋白表达亦较模型组有明显下降。这从一定程度上提示，YSHS对DN的治疗作用并非通过将YAP滞留于胞浆以减少YAP入核的形式实现，而主要是通过减少YAP的表达来完成。
作为一种重要的纤维化诱导因子，CTGF能促进DN中肾小球系膜区基质增多、肾小球硬化及间质纤维化的发生。在DN大鼠肾组织及DN患者肾小球中，均可以发现CTGF在mRNA表达水平的升高[13-14]。足细胞损伤导致相关功能蛋白表达水平下降是DN的又一重要病理标志[15]，而该过程亦与CTGF密切相关[16]。通过特异性抗体清除CTGF，可有效提高DN中nephrin等足细胞蛋白的表达[10]。而相关研究已证实，CTGF可直接受到YAP的调控[4]。利用VP进行干预，可抑制DN小鼠肾组织中CTGF的表达[4]。因此，本研究中我们对肾皮质组织中CTGF及分别位于足细胞裂孔膈膜、细胞核及顶端的功能蛋白nephrin、WT1、podocalyxin的mRNA表达情况进行了观察。结果显示，模型组小鼠CTGF的蛋白及mRNA表达水平明显升高，而YSHS和VP组CTGF的表达量均出现下降，该结果与DN大鼠的研究报道一致[13]。此外，YSHS组小鼠的nephrin、WT1及podocalyxin的mRNA表达量较模型组均有所上调。说明YSHS具有通过抑制YAP过表达，下调CTGF表达水平上调nephrin、WT1及podocalyxin等足细胞功能蛋白mRNA的作用。值得注意的是，与模型组比较，VP组小鼠的nephrin和podocalyxin的mRNA表达水平亦有上升，但WT1的mRNA表达升高不明显。造成该结果的原因可能与本研究中VP的给药剂量(25 mg·kg-1，隔日一次)远低于文献报道中的剂量(100 mg·kg-1，隔日一次)，从而减弱了该药的疗效有关。
综上所述，益肾化湿颗粒在DN治疗过程中具有降低尿蛋白、保护肾功能的作用。该作用可能与其下调DN小鼠肾皮质组织中YAP的表达水平，从而减少CTGF表达，并上调足细胞nephrin、WT1及podocalyxin等功能蛋白的mRNA表达有关。
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