2. 赤峰学院医学部，内蒙古 赤峰 024000;
3. 内蒙古人类遗传病研究重点实验室，内蒙古 赤峰 024000;
4. 赤峰学院附属医院神经内科，内蒙古 赤峰 024005;
5. 天津医科大学肿瘤医院、天津医科大学肿瘤研究所、国家癌症临床医学研究中心、天津市肿瘤防治重点实验室、天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津 300060
2. the Department of Medical, Chifeng University, Chifeng Inner Mongolia, Chifeng 024000, China;
3. Key Laboratory of Human Genetic Diseases in Inner Mongolia, Chifeng Inner Mongolia 024000, China;
4. Dept of Neurology, the Affiliated Hospital of Chifeng University, Chifeng Inner Mongolia 024005, China;
5. Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin 300060, China
帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征是中脑黑质致密部(compact part of substantia nigra，SNpc)多巴胺能(DA)神经元的选择性死亡和缺失，黑质-纹状体多巴胺能系统功能退化，最终导致患者运动和非运动功能障碍。氧化应激、神经炎症、凋亡、兴奋性毒性、线粒体功能障碍、蛋白质清除机制缺陷、神经营养因子耗竭等机制参与了PD中多巴胺能神经元的丢失，参与PD的发病机制。传统中药(traditional Chinese medicine，TCM)因为多靶点、多途径和多层次药效作用，引起致力于防治以PD为主的神经退行性疾病的学者关注[1]。
表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate，EGCG)是一种来源于绿茶提取物的丰富多酚成分，近年研究显示在帕金森病(PD)的实验模型中是有效的，使其成为PD治疗的潜在药物。本文对EGCG在PD中的神经保护作用及其机制进行了综述，重点总结归纳了EGCG通过抗凋亡、抗氧化、抗炎、调节多巴胺生成和α-突触核蛋白聚集等机制在PD中的神经保护作用的最新进展。
1 EGCG的化学特性和生物利用度EGCG(分子式为C22H18O11)，是绿茶茶多酚的主要组成成分，是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，一杯250 mL的1.25%(W/V)绿茶中含有约177 mg EGCG。EGCG由四个标记为A、B、C和D的环组成(分子式见Fig 1)。A和C为苯并吡喃环，它在C2处有一个苯基，在C3处有一个没食子酸基团。B环具有位置3, 4, 5-三羟基，D环没食子酸部分在C3处配置为酯。EGCG及其代谢产物主要经肝脏代谢，进入胆汁或肠细胞，进入肠腔以粪便形式排出，少量通过尿液排出体外。茶叶的生物利用度取决于其本身的分子尺寸和极性。表儿茶素(epicatechin，EC)(分子量290)的生物利用度显著高于EGCG (分子量458 u)。当人类口服相当于两杯无咖啡因茶后，EGCG的血浆峰值水平通常在0.2 μmol·L-1左右。通过口服具有显著药理剂量的EGCG后，在小鼠和人类中分别检测到2~9 μmol·L-1和7.5 μmol·L-1的峰值血浆浓度。人喝两杯绿茶后，EGCG的血浆浓度最高为0.15 μmol·L-1。同时，EGCG在血浆中以大量游离形式存在。EGCG的消除半衰期为3.4±0.3小时。正常人志愿者口服1.6 g剂量的EGCG，血浆EGCG浓度达到生理浓度。口服EGCG通过肠道吸收，口服消化1~ 2 h后血浆中检测到EGCG；禁食大鼠和人血浆中EGCG的峰值浓度分别为0.156 kg·L-1和1.047 kg·L-1。EGCG的另一个重要特性是其具有较高的BBB通透性，这可能是因为其疏水性即分子的极性越低，脑组织的吸收越好[2]。
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| Fig 1 Chemical structure of EGCG |
近年来，EGCG在治疗神经系统疾病中的作用引起药理学家们的关注。首次证实EGCG在PD中具有神经保护作用以来，EGCG在PD中的应用研究越来越多[12]。EGCG可以在PD的多种体内外模型中具有神经保护作用，而且可通过多种机制发挥神经保护作用，我们归纳如下。
2.1 抗凋亡作用帕金森病神经元死亡的主要机制之一是细胞凋亡。帕金森病患者和实验模型中大量证据支持内在凋亡在多巴胺能神经元退变中的作用，而抑制凋亡成为治疗PD的重要靶点之一。200 μmol·L-1 EGCG能在PC12细胞中通过抗凋亡作用抑制6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导的细胞损伤，这是首次证实EGCG在PD中具有神经保护作用的研究[3]。后续的系列深入研究也证实了EGCG的抗凋亡作用[4-5]。6-OHDA处理的人神经母细胞瘤SH-SY5Y中，EGCG(0.1~10 μmol·L-1)预处理SH-SY5Y细胞可显著减轻6-OHDA诱导的细胞死亡。1 μmol·L-1 EGCG可完全阻止6-OHDA诱导的STAT3活性下降，并且可刺激有道神经细胞的增殖。这表明，EGCG对神经元的保护作用可能是通过重新刺激STAT3信号通路实现的[6]。在过表达A53T-α-syn的SH-SY5Y细胞中，EGCG能抑制6-OHDA诱导的细胞凋亡[7]。
EGCG预处理N27细胞，能够抑制6-OHDA导致的二价金属转运体-1(divalent metal transporter-1，DMT1)表达增加、铁转运蛋白1(ferroportin 1，Fpn1)水平的降低，进而降低细胞内铁含量，这也同时表明EGCG具有调控铁代谢的功能，提示EGCG可能具有调控铁死亡的作用[8]。铁死亡是一种由细胞膜中含有磷脂的多不饱和脂肪酸的过氧化损伤驱动的、铁依赖性的调节性细胞死亡[9]。于此同时EGCG可抑制6-OHDA诱导的caspase-3活性增加，在原代中脑神经元中，EGCG能够抑制6-OHDA诱导的TH+细胞计数减少和增加轴突长度[8]。在6-OHDA诱导的SK-N-AS细胞中，EGCG抑制6-OHDA引起的α-synuclein蛋白表达增加，免疫组化结果显示EGCG可减弱模型细胞中6-OHDA引起的caspase-3免疫反应性[10]。经瘦素(leptin，Lep)修饰的包裹白藜芦醇(resveratrol，Res)和EGCG组成的脂质体(Lep/RES-EGCG-PA)具有通过血脑屏障的功能，Lep/RES-EGCG-PA能够抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中凋亡促进蛋白Bax蛋白的表达，增加Bcl-2抑制细胞凋亡的发生[11]。EGCG也能抑制由百草枯(paraquat)诱导的PC12细胞凋亡，其机制可能与维持线粒体膜电位、抑制caspase-3活性和下调胞质中促凋亡蛋白Smac的表达有关[12]。同时EGCG也能够在动物模型中通过抗凋亡机制在PD中发挥神经保护作用。在鱼藤酮诱导的大鼠PD模型中，EGCG可显著减弱鱼藤酮诱导的纹状体caspase-3激活[13]。综上所述，EGCG能够在PD体内外模型中通过抑制神经毒素诱导的凋亡而发挥神经保护作用。但是其抑制凋亡的分子机制仍有待于深入研究。
2.2 抗氧化损伤作用氧化应激损伤是PD的重要特征之一，抑制氧化应激成为治疗PD的重要靶点之一。在细胞水平上，100 μmol·L-1 EGCG能够抑制L-DOPA诱导的ROS生成，降低组织硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)生成，同时上调细胞内GSH水平，这些结果表明，EGCG对左旋多巴诱导的PC12细胞氧化凋亡具有保护作用[14]。EGCG能够增加PC12细胞中SIRT1和PGC-1α蛋白表达，10 μmol·L-1 EGCG抑制MPP+诱导ROS生成增加，细胞活力增加，而EGCG上调PGC-1α mRNA、SOD1和GPX1 mRNA，这表明，SIRT1/PGC-1α通路是EGCG抑制MPP+诱导的PC12细胞氧化损伤的机制之一[15]。
同时在动物模型水平上EGCG也能够通过抗氧化机制在PD中发挥神经保护作用。在MPTP诱导的PD小鼠模型中，MPTP治疗使小鼠从旋转体下降的潜伏期缩短16%，而纹状体多巴胺浓度降低58%，二羟苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid)浓度降低35%，血清蛋白羰基(serum protein carbonyls)含量增加71%，EGCG抑制MPTP诱导的神经毒性。EGCG可上调小鼠的黑质Fpn1表达，但没有发现对铁调节蛋白(hepcidin)和DMT1的表达的影响，这表明EGCG调节黑质铁输出蛋白和降低氧化应激[16]。在鱼藤酮诱导的SD大鼠PD模型中，EGCG腹腔注射(100或300 mg·kg-1)21 d可预防鱼藤酮诱导的运动损伤，降低脂质过氧化产生，该研究是关于EGCG对鱼藤酮诱导的运动损伤的神经保护作用的首次报道[13]。EGCG能够改善6-OHDA诱导的Wistar大鼠行为变化，表现为旋转行为减少、运动活动增强、抗抑郁作用增强和认知功能障碍改善，而EGCG可逆转纹状体氧化应激和免疫组织化学改变[17]。另外，在PD转基因黑腹果蝇模型中也而观察到了EGCG具有抗氧化作用[18-19]。综上所述，EGCG能够在PD体内外模型中抑制神经毒素诱导的氧化应激损伤。但目前抗氧化防御体系，如Nrf2/ARE通路在EGCG抑制PD相关神经毒素介的神经导损伤中作用不清楚，值得深入研究。
2.3 抗炎作用PD患者脑内受累区内小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，小胶质细胞和星形胶质细胞激活产生的促炎性因子导致突触丢失和功能障碍，而慢性炎症也可以促进路易体形成进而参与PD发病机制，在PD患者脑内、脑脊液和血液中存在高浓度的促炎性因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的水平升高，表明慢性神经炎症在PD的进展过程中发挥重要作用，因此抑制慢性炎症成为PD潜在的治疗靶点。在6-OHDA诱导的SK-N-AS细胞中，EGCG能够减弱6-OHDA诱导的IL-1β染色增强，表明EGCG具有抗炎作用[10]。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的BV-2小胶质细胞中，装载EGCG的脂质体可被BV-2细胞吞噬，EGCG脂质体改善了LPS诱导的BV-2小胶质细胞一氧化氮(nitrogen oxide，NO)和TNF-α的产生，表明EGCG具有抑制LPS诱导的神经炎症发生，同时黑质内注射EGCG脂质体可减轻LPS诱导的促炎细胞因子并恢复运动损伤，这表明EGCG脂质体通过调节小胶质细胞的激活发挥神经保护作用[20]。而EGCG抑制鱼藤酮引起的黑质内炎性因子标志物NO、IL-1β和TNF-α的升高[13]，同样证实了在鱼藤酮诱导的大鼠PD模型中EGCG具有抗炎作用。综上所述，EGCG能够在PD体内外模型中通过抑制神经炎症从而发挥神经保护作用。
2.4 调控DA神经递质系统帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。因此恢复纹状体DA含量成为治疗PD的重要靶点。在服用左旋多巴/卡比多巴后2 h，口服400 mg·kg-1 EGCG略微增加了纹状体多巴胺水平[16]。LPS腹腔注射诱导的雄性SD大鼠PD模型中，4、24 h、3和7 d中脑TNF-α、NO含量增加，DA水平降低，而EGCG(10 mg·kg-1)预处理7 d可降低TNF-α和NO，并提高了脑内DA水平[21]。在MPTP诱导的PD小鼠模型中，EGCG能提高纹状体多巴胺及其代谢产物3, 4-二羟基苯乙酸(3, 4-dihydroxyphenylacetic acid)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的水平[22]。另一项在MPTP诱导的PD小鼠模型中同样证实了EGCG具有提高纹状体多巴胺浓度的能力[16]。综上所述，EGCG具有升高脑内DA的性能，但其具体机制是否与抑制DA降解仍不清楚，有待进一步深入研究。
2.5 调控α-突触核蛋白错误折叠的α突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)异常聚集，是PD病人脑内多巴胺能神经元内路易小体的主要成分，编码α-syn的SNCA基因突变突变参与家族性早发PD的发病机制。EGCG已被证明是一种有效的抗淀粉样蛋白制剂[23-24]。系列研究显示EGCG可以抑制α-syn淀粉样变性[25-26]，并保护大鼠PC12和神经母细胞瘤细胞免受聚集诱导的细胞毒性[25]。EGCG使淀粉样蛋白聚集途径被重新定向为形成稳定的球形低聚物(spherical oligomers)，这些低聚物被鉴定为无毒的无定形物种，在变性条件下不能促进播种和分解[27]。EGCG与α-syn蛋白质特异性结合，阻止无规线圈结构(random-coil structures)转化为β-折叠。EGCG与天然结构蛋白质α-syn蛋白中的柔性区域相互作用，结合在整个蛋白质序列中均匀发，也有数据显示EGCG可以通过氧化α-syn来减少其聚集过程[28]。
新发现表明，EGCG直接与原纤维的β片层结构(β-sheets of fibrils)结合，改变α-syn淀粉样蛋白的构象，而不会将其分解为有毒的低聚物中间体[29]。EGCG重塑原纤维，减少α-syn淀粉样蛋白的沉积，并将其转化为无定形的非细胞毒性聚集体(amorphous non-cytotoxic aggregates)[29]。EGCG与β-环糊精协同作用增加了对α-syn淀粉样变性的抑制作用和预形成纤维(pre-formed fibrils)的解聚[30]。因此，我们可以得出结论EGCG能够在PD中阻止α-syn的聚集的作用，同时也能够重塑α-syn原纤维改的作用，减少α-syn淀粉样蛋白的沉积。
3 结语综上所述，EGCG通过多种机制在PD中发挥神经保护作用。其可以在PD的细胞模型和动物模型中具有神经保护作用，其机制总结见Fig 2。EGCG具有抗凋亡、抗氧化、抗炎，同时它们通过促进脑内多巴胺升高，调节脑内病变区的神经递质平衡，以及具有调控α-突触核蛋白的功能。虽然EGCG在PD中的药理作用多样，但是是否存在其它机制来参与其对PD损伤的抑制作用尚不清楚。有数据显示EGCG能够通过下调二价金属转运体-1和上调铁转运蛋白1(Fpn1)水平，而调控铁代谢，而铁是参与一种由细胞膜中含有磷脂的多不饱和脂肪酸的过氧化损伤驱动的、铁依赖性的调节性细胞死亡即铁死亡机制，提示EGCG可能通过抑制铁死亡发挥对PD的治疗作用，但目前尚缺乏详细实验验证，涵待进一步深入探索。
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| Fig 2 Schematic illustration of neuroprotective effects of EGCG in PD EGCG can inhibit oxidative stress, neuronal apoptosis, and neuroinflammatory responses. EGCG can attenuate α-synuclein aggregation, oligomerization, and fibrillation. EGCG also maybe inhibit ferroptosis in PD. |
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