胃肠道动力是消化系统胃肠功能的重要组成部分，受神经系统、平滑肌细胞、Cajal间质细胞等因素协同调控，任一因素的结构或功能异常，均可导致胃肠道动力障碍[1]，胃肠动力异常是肠易激综合征、腹泻等多种胃肠道疾病的病理基础之一。研究发现，腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)患者血浆和腹泻大鼠模型的小肠组织中的兴奋性神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)水平显著升高，给予药物治疗后明显降低[2-3]。如今，高发病率的胃肠道疾病严重影响患者的身心健康，目前已有的治疗手段尚不完善，还需寻求更多更加安全有效的药物去治疗。
胃肠安丸(Weichang 'an pill, WCA)是源自清宫廷御方的经典复方制剂，由木香、沉香、檀香、人工麝香、大黄、巴豆霜、枳壳、厚朴、川芎、大枣组成[4]，药方中木香、沉香、檀香具有行气导滞，升清降浊的功效，与具有开窍醒神功效的麝香共为君药。大黄、巴豆霜寒热同调，具有行气宽中、消痞除满的功效，配伍功效为消痞化湿、芳香行散的厚朴、枳壳共为臣药。佐使药川芎活血行气，配以大枣益气和中，使全方补而不滞。诸药相合，祛邪不忘扶正，攻补兼施，达到健脾和胃、清热导滞、行气止痛的功效[5]。临床上可用于治疗IBS-D、功能性腹泻、溃疡性结肠炎[6]等消化道疾病。
课题组前期研究发现，WCA明显改善了IBS-D大鼠的腹泻、腹痛症状，延长小肠推进率，并且显著抑制了ACh诱导的大鼠离体胃肠道平滑肌痉挛性收缩，改善胃肠道动力[7]。为进一步探讨WCA及其不同提取物调节胃肠道动力的药效和物质基础，本研究采用离体组织浴实验探究WCA、胃肠安丸醇提物(ethanol extract of Weichang 'an pill，EE)、胃肠安丸水提物(water extract of Weichang 'an pill，WE)及其活性成分对ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩的影响及机制，之后通过分子对接的方法分析WCA中活性成分与毒蕈碱型ACh M3受体蛋白的结合亲和力，为后期WCA的临床使用提供实验依据，并为研究胃肠道动力异常兴奋相关疾病新药治疗的开发奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级SD大鼠(160~180)g，雌雄不限，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号: SCXK(京)2016-0006。本研究所有动物实验已通过天津中医药大学的动物实验伦理审查(TCM-LAEC2021232)。
1.2 仪器及软件八通道离体恒温平滑肌浴槽、张力换能器、BL-420 PowerLab生物信号采集处理系统由澳大利亚埃德公司提供，恒温水浴锅[英国Grant仪器(剑桥)有限公司]；高速多功能粉碎机(铂欧五金制品有限公司)；Discovery Studio 2020 Client(DS)虚拟筛选软件。
1.3 试剂WCA由天津乐仁堂中新药业集团有限公司提供。氯化乙酰胆碱(美国Sigma公司，BCBX5660)；二甲基亚砜(DMSO，北京索莱宝科技有限公司，710N0311)；木香烃内酯(costunolide，Cos，AF20052305)、去氢木香内酯(dehydrocostus lactone，Deh，AF20081756)、沉香四醇(agarotetrol，Aga，AF20081513)、檀香醇(santalol，San，AF20051804)、麝香酮(muscone，Mus，AF20121105)、芦荟大黄素(aloe emodin，Aloe，AF20021623)、大黄酸(rhein，AF20020521)、大黄素(emodin，AF20021621)、大黄酚(chrysophanol，Chr，AF21022853)、大黄素甲醚(physcion，Phy，AF20051502)、巴豆苷(crotonoside，Cro，AF21031309)、柚皮苷(naringin，Nar，AF0022321)、新橙皮苷(neohesperidin，Neo，AF20062954)、厚朴酚(magnolol，Mag，AF21012010)、和厚朴酚(honokiol，HK，AF21020863)、阿魏酸(ferulic acid，FA，AF21021753)，标准品均购于成都埃法生物科技有限公司，均以DMSO为溶剂溶解，配成100 mmol·L-1的母液备用，实验时按所需浓度稀释。
1.4 WCA溶液的制备WCA用粉碎机粉碎成细粉状(过100目筛)，实验前用Krebs Henseleit(K-H)溶液溶解，使组织浴槽中的终浓度为1、2和4 g·L-1(4 g·L-1等效于WCA的临床剂量)。
1.5 EE和WE溶液的制备精密称取两份WCA，用粉粹机粉碎成细粉状(过100目筛)置于锥形瓶，分别加入60倍量70%乙醇或超纯水，超声提取2次，每次1 h，抽滤，得到澄清暗红色乙醇提取液或混浊红褐色水提取液，蒸发浓缩，浓缩液于-80 ℃低温冷藏12 h后制成冻干粉，最终EE冻干粉提取率为30.46%；WE冻干粉提取率为42.56%，置于干燥箱中保存。实验前将EE和WE用K-H溶液稀释，使组织浴槽中的最终药物浓度折合为WCA的药物浓度分别为1、2和4 g·L-1。
1.6 实验方法 1.6.1 大鼠离体回肠平滑肌的制备实验前大鼠禁食约24 h，自由饮水。颈椎脱臼法处死大鼠，切开腹腔，迅速取出回肠，置于盛有95% O2和5% CO2充分饱和且预冷的K-H溶液(mmol·L-1: 118 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，2.5 CaCl2和11 glucose)中，将回肠段分为1.5 cm左右长，清除肠内容物，用眼科镊去除肠系膜和脂肪。使回肠平滑肌一端连接L型通气钩，悬挂于组织浴槽中，一端连接张力换能器，张力换能器与BL-420 PowerLab生物信号采集系统相连，记录回肠平滑肌的收缩活动和张力变化。调整初始负荷为1.5 g左右，平衡约30 min，恒温(37±1) ℃水浴，且持续通入95% O2和5% CO2的混合气。
1.6.2 WCA、EE、WE对ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩的影响待回肠平滑肌平衡约30min表现出自主节律性收缩后，将回肠随机分为WCA或EE或WE低剂量组(1 g·L-1)、中剂量组(2 g·L-1)、高剂量组(4 g·L-1)。各组加入ACh(10 μmol·L-1)诱导回肠平滑肌兴奋性收缩，当稳定约2 min达到收缩平衡后，加入不同浓度的WCA或EE或WE，记录加入ACh前(即Con组)、加入ACh平衡时(即ACh组)及加入药物5 min时回肠平滑肌的收缩张力。
1.6.3 溶剂DMSO对ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩的影响待回肠平滑肌平衡约30 min表现出自主节律性收缩后，加入ACh(10 μmol·L-1)诱导回肠平滑肌兴奋性收缩，约2 min达到收缩平衡后，加入溶剂DMSO(0.02%)，记录加入ACh(即Con组)、加入ACh平衡时(即ACh组)及加入DMSO 5 min时回肠平滑肌的收缩张力。
1.6.4 WCA活性成分对ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩的影响待回肠平滑肌平衡完成表现出自主节律性收缩后，将回肠随机分为WCA各活性成分组。选用活性成分为WCA中各味中药材在2020版《中国药典》中的代表成分。实验过程中，加入ACh(10 μmol·L-1)诱导回肠平滑肌兴奋性收缩达到平衡后，分别加入Cos、Deh、Aga、San、Mus、Aloe、Rhein、Emodin、Chr、Phy、Cro、Nar、Neo、Mag、HK、FA，终浓度皆为20 μmol·L-1；记录加入ACh前时(即Con组)、加入ACh平衡时(即ACh组)及加入各活性成分5 min时回肠平滑肌的收缩张力。
1.6.5 WCA活性成分与M3受体蛋白的分子对接 1.6.5.1 WCA活性成分和M3受体蛋白结构的准备通过UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库检索获得靶点蛋白M3受体(PDB ID: 4U15，分辨率: 2.8Å)，在Protein Data Bank (PDB，https://www.rcsb.org/)数据库下载其晶体结构；采用Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)网站下载WCA活性成分和ACh的3D结构，作为M3受体的小分子配体。采用DS软件中的Clean protein及Prepare protein菜单对M3受体蛋白进行结构优化，加氢，去水，补全结构；而后运用Prepare ligand及Full minimization对小分子配体进行加氢、产生异构体、结构优化。
1.6.5.2 M3受体活性中心的定义及验证根据文献报道和配体扩张法[9-10]，运用DS软件中的From current selection菜单定义后，选择M3受体结构中已定义的活性位点，删除该活性中心的小分子配体，以保持定义的活性中心位点处于空腔状态。第二步打开优化处理好的ACh结构，采用CDOCKER方法对ACh和M3受体进行半柔性对接，以对接结果的均方根误差(RMSD)≤ 2Å为标准，逐一确认所定义的活性中心的可靠性。研究最终确定M3受体蛋白的活性位点氨基酸残基为Cys532、Asp147、Tyr506、Trp503、Phe499、Ser151、Tyr148、Asn507、Val510、Ser154、Val155、Asn152、Phe239、Trp199、Ala235、Ala238、Thr234、Pro242。
1.6.5.3 WCA活性成分与M3受体蛋白模拟对接运用DS软件菜单Receptor-Ligand Interactions中的Dock ligands，点击CDOCKER，对接参数Receptor和Ligands项分别选择已定义好活性中心的M3受体和优化处理好的WCA活性小分子，Top hits设置值为10，Pose Cluster Radius为0.5，其他参数默认，点击Run项执行分子对接。分析WCA活性成分与M3受体蛋白结合的相互作用能和相互作用力。
1.6.6 统计学处理采用SPSS 26.0软件统计分析数据，实验数据以x±s表示，数据分析先进行正态性检验和方差齐性检验，服从正态分布，采用单因素方差分析，多重比较方差齐时采用LSD-t检验，不齐时采用Tamhane′s T2检验；若不服从正态分布则采用秩和检验进行分析。两组间比较采用配对t检验。相关指标如下所示: 收缩张力(g): Lab chart 8软件中的平均张力值；以Con组的收缩张力为100%，其余为与其相比的相对值。
2 结果 2.1 WCA、EE、WE对ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩的舒张作用当回肠平滑肌在恒温组织浴中平衡约30 min后，Con组显示出稳定的自发节律性收缩；加入ACh后，肠平滑肌运动波形明显增强(Fig 1A)，平滑肌收缩张力明显增加(P < 0.01)；而加入WCA后，对肠平滑肌的运动波形具有明显的抑制作用，并表现出一定的浓度依赖性，如Fig 1B所示，WCA低、中、高剂量组对肠平滑肌的收缩张力均有明显的抑制作用(P < 0.01)，高剂量组效果尤佳。EE也对肠平滑肌的运动波形具有明显的抑制作用，如Fig 1C所示，EE低、中、高剂量组可明显抑制肠平滑肌的收缩张力(P < 0.01)，中剂量组效果更好。同样，WE低、中、高剂量组也可明显抑制肠平滑肌的运动波形，对肠平滑肌的收缩张力有明显的抑制作用(P < 0.01)(Fig 1D)。
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| Fig 1 Effects of WCA, EE and WE on ACh-induced excitatory contraction of isolated rat ileum smooth muscles (x ±s, n=5) ##P < 0.01 vs Con group; **P < 0.01 vs ACh group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs WCA group: aP < 0.05, aaP < 0.01 vs WE group |
由Fig 1E结果显示，当WCA、EE和WE皆为低、中剂量时，经组间比较，EE对ACh诱导的回肠平滑肌兴奋性收缩的抑制作用明显强于WCA和WE(P < 0.05)。当三者皆为高剂量时，组间比较发现，WCA和EE对ACh诱导的回肠平滑肌兴奋性收缩的抑制作用明显强于WE(P < 0.05)。
结果表明，WCA、EE、WE对ACh所致回肠平滑肌的兴奋性收缩均具有明显的抑制作用；较WCA和WE而言，EE对ACh诱导的肠平滑肌兴奋性收缩的抑制作用更强。
2.2 WCA中活性成分对ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩的舒张作用当回肠平滑肌平衡约30 min后，加入ACh刺激收缩，达到兴奋性收缩平衡后，如Fig 2A，B所示，加入0.02% 的DMSO对ACh所致回肠平滑肌兴奋性收缩的运动波形无影响，对回肠平滑肌的收缩张力差异无显著性(P>0.05)，表明研究所采用的DMSO溶剂对回肠平滑肌的收缩舒张没有影响，因此，可以用0.02% 的DMSO溶解WCA活性成分。
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| Fig 2 Effects of active components in WCA on ACh-induced excitatory contraction of isolated rat ileum smooth muscles (x ±s, n=5) ##P < 0.01 vs Con group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs ACh group |
当ACh刺激回肠平滑肌收缩平衡后加入WCA各活性成分，Fig 2C结果显示，Cos、Deh、San和Mus均可明显降低回肠平滑肌的收缩张力(P < 0.01，P < 0.05)；但Aga对ACh导致的肠平滑肌的收缩张力无明显影响。Aloe和Rhein对肠平滑肌的收缩张力也无明显影响；而Emodin、Chr和Phy均可明显降低肠平滑肌的收缩张力(P < 0.01，P < 0.05)(Fig 2D)。此外，Cro、Mag和HK可以明显降低ACh诱导的肠平滑肌收缩张力(P < 0.01，P < 0.05)；而Nar、Neo和FA对肠平滑肌的收缩张力没有明显影响(Fig 2E)。
结果表明，WCA君药木香中的Cos、Deh，檀香中的San以及麝香中的Mus；臣药大黄中的Emodin、Chr和Phy以及臣药巴豆中的Cro、厚朴中的Mag和HK对ACh诱导的回肠平滑肌兴奋性收缩有明显的抑制作用。
2.3 分子对接结果分析生理条件下，肠道神经系
统的主要兴奋性神经递质ACh与胃肠道平滑肌上的M3受体结合后，通过钙离子通道使细胞外钙离子内流，促进胃肠平滑肌细胞收缩，调节胃肠道动力。故研究根据文献报道和配体扩张法[8-9]定义了M3受体蛋白中的活性位点，然后通过与ACh对接来确认该活性中心的可靠性(Fig 3)。如Tab 1所示，ACh与M3受体蛋白结合的RMSD值小于2Å，表明M3受体蛋白的活性部位可靠，并且ACh与M3受体蛋白具有良好的结合亲和力(Tab 1)。
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| Fig 3 Schematic diagram of binding of ACh to M3 receptor active site and key amino acid residues of active site |
| Compound CID | CDOCKER INTERACTION ENERGY/kJ·mol-1 | Binding amino acid | RMSD (Å) | |
| ACh | 6060 | -37.44 | Asp 147、Tyr 529、Ser 151 | 1.40 |
研究采用上述可明显抑制ACh诱导的回肠平滑肌兴奋性收缩的WCA活性成分作为小分子配体与M3受体蛋白进行分子对接，根据受体-配体相互作用能评价其潜在结合能力，CDOCKER INTERACTION ENERGY表示小分子配体与受体结合时需要的能量。一般来说，相互作用能越低，化合物与M3受体形成稳定络合物的结合亲和力越高。Cro、Mus、Phy、HK和Mag的相互作用能较低，均优于ACh(-37.44 kJ·mol-1)(Tab 2)，表明它们与M3受体形成稳定络合物的结合亲和力较好；San、Chr、Cos等活性成分与M3受体的结合亲和力相对较弱。排名前4的活性成分与M3受体蛋白结合的相互作用力分析如Fig 4所示，他们与M3受体蛋白活性中心附近的Trp503、Asn507、Cys532、Tyr148、Ala238等关键氨基酸残基形成氢键、pi-烷基疏水键及碳氢键等相互作用力，以稳定配体和受体的结合。
| Active component | Compound CID | CDOCKER INTERACTION ENERGY/kJ·mol-1 |
| Cro | 65 085 | -66.10 |
| Mus | 10 947 | -44.73 |
| Phy | 10 639 | -41.29 |
| HK | 72 303 | -40.00 |
| Mag | 72 300 | -39.71 |
| San | 5 281 531 | -36.83 |
| Chr | 10 208 | -36.46 |
| Emodin | 3 220 | -35.39 |
| Cos | 5 281 437 | -33.25 |
| Deh | 73 174 | -31.88 |
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| 图 4 Analysis of interaction bond between active components and active site of M3 receptor A: Cro; B: Mus; C: Phy; D: HK |
因此，这些活性成分可能都通过竞争抑制ACh与M3受体的结合，进而促进回肠平滑肌舒张。
3 讨论小肠主要有紧张性收缩、蠕动和分节运动三种运动形式，其自主节律性收缩易受到神经、激素、体液等因素的调控，其中兴奋性神经递质ACh可使大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩，收缩活动加强[10]，本研究通过观察回肠平滑肌收缩张力的变化来判断回肠的兴奋性。研究发现，在ACh诱导的离体大鼠回肠平滑肌兴奋性收缩的状态下，WCA浓度依赖性的抑制了肠平滑肌的收缩活动；EE和WE也显著抑制了回肠平滑肌的兴奋性收缩，但并未呈现出明显的量效关系。此外，较低、中剂量组的WCA和WE而言，低、中剂量组的EE对ACh诱导的肠平滑肌兴奋性收缩的抑制作用更强；高剂量组的EE与WCA作用相当，总体而言，EE对回肠平滑肌的抑制作用更加有效。
木香作为WCA的君药，前期研究结果发现[11-12]其在WCA抗腹泻治疗中有着至关重要的作用，木香提取物可以明显延迟小鼠肠道运输，抑制肠道运动，对离体大鼠空肠平滑肌具有浓度依赖性的解痉作用。同样，本研究发现木香中的活性成分Cos和Deh可以明显降低ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩的张力，对其兴奋性收缩有明显的抑制作用。Emodin作为WCA臣药大黄中的主要活性成分，高柳等[13]研究发现Emodin可能通过兴奋肾上腺素β受体、开放ATP敏感钾通道、阻断Ca2+内流介导对大鼠离体十二指肠平滑肌收缩的抑制作用。本研究中同样发现Emodin能够降低ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩的张力，且可能通过阻断M受体与ACh的结合导致肠平滑肌松弛。相关资料表明[14]WCA臣药厚朴中的活性成分Mag可以浓度依赖性地抑制大鼠结肠平滑肌的自发收缩及ACh和KCl诱导的兴奋性收缩，其通过抑制L型Ca2+通道发挥作用。与本文报道一致[15]，Mag可通过阻断M受体与ACh的结合抑制大鼠离体回肠平滑肌的收缩。此外，WCA君药檀香中的San、麝香中的Mus，臣药大黄中的Chr、Phy，巴豆中的Cro，厚朴中的HK也明显抑制了ACh诱导的回肠平滑肌兴奋性收缩。由此可知，以上活性成分可能是WCA缓解胃肠道痉挛的药效物质基础。
毒蕈碱型ACh受体为G蛋白偶联受体，在胃肠道中分布广泛，可分为M1-M5五个亚型，其中M3受体亚型在胃肠道平滑肌中大量表达，在维持胃肠道收缩运动中发挥重要作用。当肠道神经系统的副交感神经和固有神经元释放神经递质ACh时，通过激活肠平滑肌上的M3受体，使M3受体与下游Gq/G11偶联，刺激磷脂酶C活化，增加细胞内三磷酸肌醇和二酰甘油水平，诱导肌质网内储存的Ca2+的释放以及细胞外Ca2+内流，进而促进肠平滑肌收缩[16-17]。因此，研究通过分子对接的方法探究WCA活性成分与M3受体蛋白的结合亲和力发现，Cro、Mus、Phy、HK、Mag、San、Chr、Emodin、Cos、Deh均与M3受体蛋白有良好的结合亲和力，故其机制可能是通过阻断M受体与ACh的结合导致肠平滑肌松弛。
综上所述，WCA、EE和WE均可明显抑制ACh诱导的大鼠离体回肠平滑肌兴奋性收缩，较WCA和WE而言，EE的效果更好。WCA中Cos、Deh、San、Mus、Emodin、Chr、Phy、Cro、Mag、HK也明显抑制了ACh诱导的回肠平滑肌的过度收缩，它们可能是WCA调节胃肠道动力，缓解胃肠道痉挛的药效物质基础。本研究为胃肠道动力异常兴奋引起的相关疾病如IBS-D、腹泻、腹痛等治疗提供了实验依据，为后续新药的研究和开发提供了新的思路。
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