2. 江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏 南京 210023
2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine, Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
人参皂苷是人参中的主要活性成分，具有抗多种疾病的药理作用，也是主要的抗肿瘤物质。Rg3是人参皂苷中的一种组成成分，是一种四环三萜皂苷[1]。作为一种甾体皂苷，具有比其他人参皂苷更广泛的药理活性。多项研究表明，Rg3具有多种生物学活性，包括抗癌作用和免疫调节能力。Rg3的抗肿瘤作用已在各种实验中得到证实，并已在临床上应用多年。前期的研究表明，Rg3在结肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌等多种癌症中，通过抑制癌细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制血管生成以及癌细胞的侵袭转移活性，产生抗肿瘤作用[2]；可增加HLA-ABC、HLA-DR、CD56等分子表达，促进脾淋巴细胞增殖，使Th1/Th2及CD4+ /CD8+向免疫增强方向转移，增强外周淋巴细胞的免疫功能; 还可提高IL-2和NK细胞的活性，并通过IL-2激活T淋巴细胞，产生细胞因子和正向免疫调节作用，提高机体的特异、非特异性免疫和抗肿瘤能力[3]。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路将外部的丝裂原信息传递给免疫细胞，导致细胞分化和代谢机制的调节，使细胞为效应功能做好准备。在肿瘤微环境中，持续的有丝分裂刺激诱导效应细胞过度分裂，产生一种衰竭的表型，显示出效应功能减弱，也损害免疫记忆的产生。据报道，MAPK整合了各种细胞内信号通路，以响应不同的外界刺激，并在NK细胞介导裂解肿瘤细胞中发挥关键作用[4]。
人参皂苷Rg3有很强的免疫增强作用，但其与MAPK通路的关系及其是否可能通过影响MAPK通路进而调节T淋巴细胞的免疫，目前并不清楚。本文将对这一问题展开研究。
1 材料 1.1 细胞小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞株由江苏省中药药效与安全性评价重点实验室细胞库提供，RPMI 1640+10%FBS常规培养，培养箱条件为5% CO2，37 ℃。
1.2 试剂与药物人参皂苷Rg3(上海源叶生物科技有限公司；批号：B21759;纯度≥98%)；EdU-555细胞增殖检测试剂盒(碧云天公司，C0075S); Annexin V-FITC细胞凋亡双染试剂盒(碧云天公司，批号：C1062S)；APC anti-mouse CD197(CCR7)(Biolegend，120107); APC anti-mouse CD62L(Biolegend，104411); FITC anti-mouse CD95(Biolegend，152605); FITC anti-mouse CD44(Biolegend, 103005); PE anti-mouse CD8a(Biolegend，162304);FITC anti-mouse CD3(Biolegend，100204)；GAPDH抗体(32233, Santa)；ERK1/2抗体(AF0155，Affinity)；Phospho-ERK1/2抗体(AF1015，Affinity)；MEK1/2抗体(AF6385，Affinity)；p38 MAPK抗体(AF6456，Affinity); Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11，CST); c-Jun (60A8，CST); Phospho-p38 MAPK抗体(AF4001，Affinity)。
1.3 实验动物C56BL/6小鼠，雌性，6~8周龄，18~22 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证编号：20170005056292，许可证编号: SCXK(沪)2017-0005。饲养条件：所有小鼠随机分组后饲养于鼠筐中，环境温度保持在(21±2)℃，避免各类环境噪音。另外室内保证12 h白昼/黑夜循环灯光，自由饮水食。同时，实验过程严格遵守动物福利和动物实验伦理。
1.4 仪器电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；Synergy 2多功能酶标仪(美国Biotek公司)；ECO超净工作台(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Real-Time实时定量PCR仪(美国ABI公司)；倒置荧光显微镜、体式显微镜(德国Zeiss公司)；组织脱水机、组织包埋机、石蜡切片机(德国徕卡公司)。
2 方法 2.1 细胞培养及分组37 ℃水浴加热解冻B16F10细胞，置于RPMI 1640培养基(10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素-链霉素) 中，PBS洗涤后胰酶消化，置于5% CO2、37 ℃饱和湿度培养箱中培养，2 d左右传代1次，共培养2~3代，取对数生长期的细胞进行实验。
2.2 T细胞分离及培养在C57BL/6小鼠侧面皮下注射B16 F10黑色素瘤细胞(1×106 L-1细胞)。1周后处死小鼠。取其外周血脾脏及淋巴结。(无菌取脾，加PBS研磨，1 500 r·min-1离心5 min)消化成单细胞悬液。使用BD FACS AriaII细胞分选机(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)从外周血单个核细胞和淋巴细胞混合悬液中分选CD8+ T细胞。CD8+ T细胞在2 mg·L-1抗CD3 ε (Biolegend)、1 mg·L-1抗CD28 (Biolegend)和IL- 2(Biolegend)的刺激下活化24 h。其间，将分选后的CD8+ T细胞在RPMI 1640培养基中并置于5% CO2，37 ℃培养箱中培养孵育。
2.3 MTT法检测取分选后的CD8+ T细胞或B16F10细胞，制成细胞悬液，设置对照组(DMSO) 和给药组(Rg3浓度5、10、15、20 μmol·L-1)，每孔100 μL细胞悬液(约5×107L-1)接种于96孔板中，加药后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，每孔加入200 μL含MTT溶液(纯MTT ∶ RPMI 1640基础培养基=1 ∶ 10)，放入培养箱中孵育4 h左右，去上清(T细胞需离心)，每孔加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)。平板振荡器上振荡10 min。将处理好的培养板置于酶联免疫检测仪中，在450 nm波长处测定吸光度值(A)，生长抑制率/%=(1-A给药组/A对照组)×100%。
2.4 Western blot检测MAPK相关调控通路的蛋白表达[5]取“2.3”培养的T细胞，稳定生长时分组给药，对照组(不加Rg3)、Rg3组(5、10 μmol·L-1)继续培养24 h，离心后收集细胞，PBS漂洗3次，加入细胞裂解液RIPA进行细胞裂解，收集细胞总蛋白。取蛋白样品30 μg上样，SDS-PAGE电泳分离后至PVDF上转膜，于3%~5%脱脂牛奶中封闭后，分别加入ERK1/2抗体、Phospho-ERK1/2抗体、MEK1/2抗体、p38 MAPK抗体、Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)、c-Jun、Phospho-p38 MAPK抗体、GAPDH抗体(1 ∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜；加入兔二抗体，室温孵育1.5 h，使用ECL化学发光法显像，利用ImageJ软件进行蛋白条带灰度分析，计算蛋白相对表达，并绘制柱状图。
2.5 RNA提取和实时定量PCR(RT-qPCR)取分选出CD8+ T细胞1×106种于6孔板中，随后加入含Rg3的培养基，给药Rg3终浓度为5、10 μmol·L-1，于37 ℃培养箱中培养24 h；离心弃去上清，PBS洗涤后加入1 mL总TRIzol提取RNA，将模板RNA稀释为500 ng，加入2 μL的4×g DNA wiper Mix，再加入RNA-free dd H2O, 用移液枪轻轻吹打混匀，置于PCR仪中，42 ℃条件下加热2 min。使用HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ将提取的RNA反转录得到cDNA，设置条件(15 min→50 ℃，5 s→85 ℃)。随后使用荧光实时定量PCR专用管中沿壁依次加入相应试剂，轻轻吹打混匀，用密封膜封紧板面。将PCR检测板放入ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪中进行扩增。条件设置如下95 ℃-30 s；95 ℃-10 s; 60 ℃-30 s; 95 ℃-15 s; 60 ℃-60 s; 95 ℃-10 s. 分别读取内参和目的蛋白的CT值。计算相对变化，并进行统计分析。
2.6 流式细胞术分析为了进行流式细胞分析，将分选好的CD8+ T细胞以5×108 L-1的密度接种在24孔板中，加入不同浓度Rg3，在含20% FBS的RPMI 1640培养基中继续培养24 h。每孔收集CD8+ T细胞，1 500 r·min-1离心5 min，PBS洗涤3次，用小鼠流式抗体在4 ℃下染色30 min。细胞内细胞因子染色时，用1 mL·L-1 PMA、1 ml·L-1 ionomycin (Sigma)、1 ml·L-1 brefeledin (Sigma)刺激CD8+ T细胞4 h，然后按照固定/通透性试剂盒(eBioscience)的制作方案进行染色.利用流式细胞仪进行分析。数据由FlowJo软件分析。
2.7 细胞凋亡检测按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(碧云天)步骤进行实验。按“2.3”项下方法处理(CD8+ T/B16F10)细胞，给药结束时，离心后弃上清，PBS清洗3遍，加入含5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI染色液的500 μL结合缓冲液重悬细胞，室温避光染色20 min，利用流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞凋亡情况。
2.8 EDU细胞增殖检测以每孔6×105个细胞接种于6孔板中，置于培养箱中培养24 h，弃去培养液，PBS清洗，在给药组加入已在浓度为5、10 μmol·L-1 Rg3中培养24h后的CD8+ T细胞，另外设置对照组(不加Rg3)，设3个复孔，培养箱培养24 h后参照EdU试剂盒(碧云天)步骤进行细胞清洗、固定、EDU染色等操作，结束后将培养板置于倒置荧光显微镜下，观察并随机拍摄荧光图像，运用ImageJ软件进行定量计数。
2.9 酶联免疫吸附试验ELISA将经过筛选的CD8+ T细胞以5×108 L-1的密度接种于24孔板中，并在含有或不含Rg3的RPMI 1640培养基中5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。每孔收集上清，3 500 r·min-1离心10 min。按照产品说明书使用小鼠IL-2 ELISA试剂盒(南京翼飞雪生物技术有限公司)和小鼠IFN-γ ELISA试剂盒(南京翼飞雪生物技术有限公司)检测CD8+ T细胞分泌的总IL-2和IFN-γ。
2.10 统计学方法使用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，先使用单因素方差分析ANOVA)，有差异后两组之间的比较使用Student′s-t检验，两组以上比较使用Dunnett′s test检验。
3 结果 3.1 人参皂苷Rg3一定浓度范围内不影响CD8+ T细胞增殖及凋亡体外实验中为了排除Rg3对肿瘤细胞及T淋巴细胞增殖的直接影响，需确定其无影响浓度。经流式细胞术定量分析，结果显示，在5、10、15 μmol·L-1 Rg3处理后诱导的T细胞凋亡，与正常对照组相比差异无统计学意义(Fig 1A)。另一方面，通过MTT实验检测CD8+ T细胞存活率，观察在5、10、15 μmol·L-1 Rg3处理24 h后，Rg3对CD8+ T细胞增殖的无抑制作用(Fig 1B, C)。上述结果表明，此浓度范围内不会诱导T细胞凋亡并且不影响其增殖。因此，我们选取此范围下浓度作为后续研究。
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| Fig 1 Ginsenoside Rg3 did not affect apoptosis and proliferation of CD8+ T cells within a certain concentration range (x±s, n=3) A: Flow cytometry images showed apoptosis ratio; B: Morphological images of CD8+ T cells were observed microscopically (× 200); C: Effects of Rg3 on proliferation of CD8+ T cells. |
利用MTT检测在5、10、15 μmol·L-1 Rg3处理后的CD8+ T细胞与B16F10共培养24 h，B16F10细胞的生长情况及存活能力，结果显示，Rg3干预下的T细胞明显抑制了B16F10细胞的生长，IC50值为7.43 μmol·L-1(Fig 2A, B)。并且共培养24 h后，利用荧光显微镜拍摄B16F10细胞，观察到对照组绿色及红色荧光显示均较弱，说明细胞维持在正常状态; 5 μmol·L-1 Rg3处理后T细胞共培养下的B16F10细胞，绿色荧光逐步增强，表明开始发生早期凋亡; 10 μmol·L-1Rg3组绿色和红色荧光显示均较强，表明了细胞处于晚期凋亡状态(Fig 2C, D)。另外，EDU增殖检测结果显示，5 μmol·L-1 Rg3处理后T细胞影响B16F10细胞增殖(P＜0. 05)，而10 μmol·L-1 Rg3处理后T细胞显著抑制了B16F10细胞的增殖(P＜0. 01)(Fig 2E, F)。流式细胞术及ELISA检测显示，Rg3处理后的CD8+ T细胞分泌的IL-2和IFN-γ含量升高(Fig 3A, B)。上述结果表明，Rg3处理的的CD8+ T细胞比正常培养的CD8+ T细胞对B16F10细胞具有更强的杀伤能力。
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| Fig 2 Ginsenoside Rg3 enhanced antitumor effect of CD8+ T cells in vitro (x±s, n=3) A: Microscopic observation of B16F10 cell morphology imaging (×200); B: Inhibition of B16F10 cell proliferation after treatment of CD8+ T cells with different concentrations of Rg3; C: CD8+ T cells were treated with different concentrations of Rg3 and co-cultured with B16F10 cells for 24 h. Apoptosis of B16F10 cells was observed by fluorescence microscope(×200); D: Quantification of fluorescent images; E: CD8+ T cells were treated with different concentrations of Rg3 and co-cultured with B16F10 cells for 24 h. The proliferation of B16F10 cells was observed by fluorescence microscope (×200); F: Quantitative map of positive cells in fluorescence image; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
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| Fig 3 Ginsenoside Rg3 promoted differentiation of CD8+ T cells into memory T cells (x±s, n=3) A: Flow cytometry was used to detect the positive rate of IL-2 and IFN-γ in CD8+ T cells. B: The secretion of IL-2 and IFN-γ in CD8+ T cells treated with Rg3 was detected by ELISA. C: Flow cytometry was used to detect the quantitative analysis of CD44+CD62L+cells (TCM) after 24 h treatment of CD8+ T cells with Rg3. D: Quantitative analysis of CD95+CDR7+cells (TCM) after 24 h treatment with Rg3 by flow cytometry; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
通过流式细胞术定量分析，CD44、CD62L在T细胞活化后上调，在记忆细胞和效应细胞中均为阳性。分析了5、10 μmol·L-1 Rg3干预和正常培养的CD8+ T细胞，发现Rg3以剂量依赖性的方式增加了CD8+ T细胞中CD44+CD62L+亚群的比例，表明Rg3促进了共表达CD44+和CD62L+的TCM细胞的富集(Fig 3C)。并且，Rg3干预培养诱导CD8+ T细胞表达更高水平的记忆标记物(CCR7和CD95)。结果显示，Rg3以剂量依赖性的方式增加了CD8+ T细胞中CDR7+、CD95+亚群的比例(Fig 3D)。进一步说明人参皂苷Rg3促进记忆性T细胞TCM的产生，由此达到增加抗肿瘤能力的作用。
3.4 人参皂苷Rg3增强CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫记忆作用的机制研究Western blot检测人参皂苷Rg3对CD8+ T细胞MAPK通路蛋白表达的影响，结果显示，与对照组相比，5、10 μmol·L-1 Rg3处理后的CD8+ T细胞，虽然MEK、p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK蛋白表达及mRNA水平均显示无明显变化。但Rg3可以显著影响ERK蛋白磷酸化以及其相关mRNA变化(Fig 4A-C)。并且在使用ERK抑制剂0.1 μmol·L-1 PD0325901后，观察到与对照组相比，Rg3处理后的CD8+ T细胞产生的记忆功能细胞比例无明显变化(Fig 4D)。上述结果推断，人参皂苷Rg3可以通过激活MAPK/ERK促进T细胞记忆功能，增强抗肿瘤效果。
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| Fig 4 Ginsenoside Rg3 affected memory function of CD8+ T cells through ERK signaling pathway (x±s, n=3) 1:Control; 2:PD0325901 0.1 μmol·L-1; 3:5 μmol·L-1 Rg3; 4:5 μmol·L-1 Rg3+PD 0.1 μmol·L-1; 5:10 μmol·L-1 Rg3; 6:10 μmol·L-1 Rg3+PD 0.1 μmol·L-1. A: Western blot was used to determine the effect of Rg3 on the expression of molecular proteins related to MAPK pathway in CD8+ T cells. B: ImageJ software was used for protein strip gray scale analysis to quantify the ratio of p-ERK /ERK, p-p38/p38 and p-JNK/JNK. C: qRT-PCR was used to detect the effect of Rg3 on mRNA expression levels of related molecules in MAPK pathway of CD8+ T cells. D: Flow cytometry was used to determine the proportion of CD44+CD62L+cells (TCM) in CD8+ T cells treated with PD0325901 0.1 μmol·L-1 and Rg3 for 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
T细胞参与许多不同类型的免疫反应，发生在感染、癌症、自身免疫和过敏性疾病中. 细胞毒性CD8+ T细胞和CD4+ T辅助性细胞(TH1)是免疫系统对抗癌症的主要武器.细胞毒性CD8+ T细胞是抗肿瘤免疫的主要效应细胞，在肿瘤的过继细胞免疫治疗(ACT)中通常被用作治疗细胞[6]。通过将CD8+ T细胞转移到荷瘤小鼠体内，发现中枢记忆T细胞(central memory T cell, TCM)比效应记忆T细胞(effect memory T cell, TEM)或分化效应T细胞(differentiation effect T cell, TEF)具有更高的抗肿瘤活性[7]。在早期分化阶段，TCM细胞治疗B16荷瘤小鼠的疗效至少是TEF的100倍。虽然TCM、TEM、TEF能产生效应细胞因子IFN-γ、TNF-α，但只有TCM能产生IL-2, IL-2能促进其在再次暴露于抗原后迅速扩张，具有更有效的免疫力[8]。更重要的是，TCM具有很强的自我更新能力，在体内可以存活一个多月。因此，TCM细胞作为一种具有长期有效抗肿瘤记忆的记忆毒性T细胞亚群，是免疫治疗成功的关键[9]。
Rg3是一种甾体皂苷，具有广泛的药理活性抗癌功效[10]。研究表明，Rg3具有较强的抗癌特性和免疫调节能力等多种生物学活性。并且其抗肿瘤作用已利用实验加以证明，并在临床上得到实践应用。此外，Rg3还通过激活脾细胞增殖和IFN-γ的产生发挥增强免疫功能的作用。有研究证实，Rg3通过Akt/p53通路刺激DDX3表达，通过TBK1/ IKKepsilon/IRF3信号通路激活先天免疫反应和IFN-β的表达[11]。通过MAPK/ERK信号通路增加激活受体表达，增强自然杀伤细胞活性[12]。虽然已有报道表明，Rg3具有抗肿瘤和免疫调节活性，但这些作用的机制以及Rg3是否直接增强CD8+T细胞的功能及抗肿瘤活性仍有待进一步研究。
本研究首先验证了人参皂苷Rg3在一定浓度内对于肿瘤细胞以及T细胞的增殖凋亡没有影响。但可以通过促进细胞毒性T细胞分泌IL-2以及IFN-γ杀伤因子增强其抗肿瘤的能力。而已有研究表明原始的CD8+ T细胞受到抗原刺激后，根据分化状态不同主要分为中央记忆性T细胞(TCM)、效应记忆性T细胞(TEM)、分化效应T细胞(TEF)，TCM高表达淋巴归巢分子CD62L，而TEF却不表达[13]。进一步分析发现，TCM、TEM和TEF都可以产生效应细胞因子IFN-γ与TNF-α，但是只有TCM能够生产IL-2。研究证实，IL-2能够使TCM其具有更有效的免疫能力，促进TCM在二次接触抗原时快速扩增。并且IL-2使得TCM具有自我不断的更新与增殖能力，在体内的存活时间显著提高，从而产生更有效的抗肿瘤免疫[14]。
MAPK通路有4种主要的分支路线：ERK、JNK、p38MAPK和ERK5。其中，JNK和p38功能相似，跟炎症、凋亡、生长都有关；ERK主要负责细胞生长、分化，其上游受Ras/Raf蛋白调控。而MEK和ERK1/2都参与广泛的生物过程，如细胞生存、增殖和分化，所有这些过程都分别依赖于MEK和ERK1/2的磷酸化。大多数实体肿瘤的明显特征是信号通路的RAS/RAF/MEK/ERK基因突变。已有研究说明激活ERK信号通路，可促进树突状细胞中IL-12p70的分泌，增强CTL的细胞毒性，从而增强抗肿瘤效果。另外ERK、JNK和p38 MAPK活性的特异性抑制也可降低TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌[15]。研究揭示了ERK信号主要功能是控制激活T细胞表达的转录因子、细胞因子和细胞因子受体。ERK1/2控制的T细胞蛋白，虽然数量相对较少，但包含许多已知的对T细胞分化和获得效应功能至关重要的关键分子[16]。例如ERK2的激活对TCR诱导的T细胞增殖和分化具有重要作用，ERK1/2活性控制活化CD8+ T细胞中效应分子、细胞因子和细胞因子受体的表达[17]。因此，我们研究了Rg3处理后，MAPK/ERK通路在T细胞活性及功能中的作用。研究结果发现，Rg3诱导MAPK/ERK磷酸化; 然而，并不影响p38或JNK通路的磷酸化。这些结果支持Rg3通过激活MAPK/ERK信号通路增加T细胞记忆功能的观点。
综上，本研究通过体外实验研究发现人参皂苷Rg3增加CD8+ T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，通过增加功能性记忆T细胞的转化影响其免疫功能。Rg3增加T细胞释放杀伤因子IL-2及IFN-γ及其mRNA的表达。并且功能性T细胞TCM的比例增加，Rg3通过激活MAPK/ERK通路促进功能性T细胞分化进而促进T细胞杀伤活性增强抗肿瘤效果。
通过中药活性成分对TME中免疫细胞功能进行干预，进而提高体内抗肿瘤活性，是中药成分抗肿瘤免疫方面新的开拓点。同时对利用过继性免疫疗法治疗癌症具有潜在的指导意义。
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