2. 江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028
2. Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028, China
Ⅱ型心肾综合征(type-Ⅱ cardio-renal syndrome, type-Ⅱ CRS)是由长期性的心功能异常(例如慢性充血性心力衰竭)导致的慢性进行性肾病[1]。心肾共同的功能失调，存在多个级联的反馈机制，两者的病理状态紧密联系，最终结果表现为心肾均发生不同程度的纤维化[2]。脏器纤维化的直接原因是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积。ECM的出现，意味着成纤维细胞或肌成纤维细胞的堆积，即实质细胞丢失，而间质细胞堆积，发生组织重构过程。研究表明，心脏血管内皮细胞和肾小管上皮细胞是成纤维细胞的重要来源，这一转变过程称为内皮/上皮间质转化(EndMT/EMT)[3-4]。当心脏发生纤维化时，约有1/3成纤维细胞来源于心脏血管内皮细胞的EndMT，2/3来源于造血细胞、巨噬细胞和成纤维细胞自身的增殖等[5]；当肾脏发生纤维化时，36%的成纤维细胞来源于局部的EMT，即由炎症刺激下的肾小管上皮细胞转化而来，14%~15%来源于骨髓，49%~50%来自成纤维细胞自身的增殖[6]。瓜蒌薤白汤(Gualou Xiebai Decoction，GXD)属于汉代经典名方，早在汉代医圣张仲景的《金匮要略》中记载治疗胸痹证，胸痹证也称“胸痹心痛”，范畴包括现代医学的冠心病和心肌梗死等心血管疾病[7]。该类疾病诱因复杂，机制错综，干预多靶点的中药复方在治疗此类疾病方面具有独特的优势，GXD作为经典名方，具有很大的挖掘价值。本课题组已有的研究结果证实，GXD对胸痹症大鼠有明显的治疗作用，本研究立足于脏器纤维化的共同机制——EndMT/EMT，以慢性心肌缺血引起的Ⅱ型心肾综合征大鼠模型为研究对象，观察GXD对心、肾组织纤维化的干预作用，探讨GXD改善心肾功能及保护心肾的可能作用靶点，为丰富其临床应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物8周龄雄性SPF级Wistar大鼠50只，体质量(250~300) g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK(沪)2017-0005，饲养于南京中医药大学附属中西医结合医院，许可证号SYXK(苏)2021-0025，温度(22±2) ℃，湿度50%~70%，12 h光照，适应性喂养1周。本研究符合动物实验伦理学标准，得到伦理委员会批准。
1.2 药品与试剂瓜蒌皮饮片、薤白饮片(200611、200721，江苏华洪药业科技有限公司)；盐酸贝那普利片(X3176，北京诺华制药有限公司)；羟脯氨酸试剂盒(A030-2-1，南京建成生物工程研究所)；SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)，特超敏ECl化学发光试剂盒(P0015L，P0018AS，碧云天生物技术研究所)；CD31(Ab-AF6191，Affinity公司)，α-SMA蛋白一抗(NBP2-33006，Novus公司)，GAPDH(AB0037，Abways TECHNOlOGY公司)，E-cadherin、Vimentin、TGF-β1(ab231303，ab92547，ab92486，Abcam公司)。
1.3 仪器小型动物呼吸机(ALC-V8S，上海奥尔科特生物科技有限公司)；小动物高频彩色超声系统(Vevo 2100，加拿大Visual Sonics公司)；Leica倒置生物显微镜(Model DMi8 manual，Leica公司)；蛋白电泳仪(PowerPac Basic，美国Bio-Rad公司)。
1.4 方法 1.4.1 GXD的制备瓜蒌皮、薤白(1 ∶ 1)用8倍量的50%乙醇回流提取3次，3倍量的正丁醇萃取，回收正丁醇直至流浸膏状态，即得GXD正丁醇部位，得率为7.950 g生药·g-1[8]。
1.4.2 模型的制备及给药参考文献[9]的方法，建立Ⅱ型CRS模型。取(250~300) g大鼠，术前禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)以麻醉。仰卧位固定动物，气管插管后接入小型动物呼吸机，呼吸机的参数设置：潮气量5 mL，呼吸频率70次·min-1，吸呼比为1 ∶ 1。左前胸碘伏消毒，于第3、4根肋骨间隙切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露心脏，迅速结扎左冠状动脉前降支，结扎完成即对大鼠行心电图，出现ST段明显上抬即视为造模成功，之后逐层缝合胸壁。术后将大鼠置于恒温电热毯待其苏醒，24 h禁食不禁水，连续3 d每只肌注青霉素40万单位以预防感染。假手术组穿线不结扎。
术后72 h，将成模大鼠随机分为模型组、盐酸贝那普利组和GXD低、高剂量组，盐酸贝那普利组灌胃给予0.85 mg·kg-1，给药容积为10 mL·kg-1，GXD低、高剂量组分别灌胃给予GXD正丁醇部位生药6 g·kg-1和12 g·kg-1，给药容积为10 mL·kg-1，假手术组和模型组给予等体积生理盐水，连续给药10周。
1.4.3 超声心动图监测末次给药前1 d，剃除大鼠胸前区毛，异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定，利用小动物高频彩色超声系统行M型超声心动图，检测左室后壁舒张期厚度(left ventricular posterior wall diastolic thickness, LVPWd)、左室后壁收缩期厚度(left ventricular posterior wall systolic thickness, LVPWs)、左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter, LVIDd)、左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter, LVIDs)、室间隔舒张末期厚度(interventricular septum diastolic thickness, IVSd)、室间隔收缩末期厚度(interventricular septum systolic thickness, IVSs)。射血分数(ejection fractions, EF)、缩短分数(fractional shortening, FS)、左心室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume, LVEDV)和收缩末期容积(left ventricular end systolic volume, LVESV)。
1.4.4 血清样本收集腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)，麻醉后腹主动脉采血，室温下静置全血2 h，3 500 r·min-1离心10 min，取上清液，血清于全自动生化分析仪进行分析，血清检测指标包括天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase, AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes, CK-MB)、尿酸(uric acid, UA)、肌酐(creatinine, Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)。
1.4.5 组织样本采集解剖动物前称量大鼠体质量(body weight，BW)，采血后取心、肾组织，心脏取下后立即用4 ℃保存的生理盐水灌注清洗，擦去心肾表面多余水分，去除心耳与多余血管组织，分别称量心脏的质量(heart weight，HW)和双肾的质量(kidney weight，KW)，分别计算脏器指数，HWI=HW/BW，KWI=KW/BW。部分心、肾组织用10%福尔马林固定，其余组织-80 ℃冰箱冻存。
1.4.6 HE和Masson染色心、肾组织在10%甲醛浸泡24 h以上，取出后梯度酒精脱水，石蜡包埋，常规HE和Masson染色，封片，光学显微镜下观察心、肾组织的病理组织变化和胶原沉积情况，采集图像分析。
1.4.7 羟脯氨酸检测分别称取心、肾组织各80~100 mg于玻璃试管中，按照羟脯氨酸试剂盒(碱水解法)说明书进行操作测定，测定心、肾组织中羟脯氨酸含量。
1.4.8 免疫荧光检测EndMT/EMT相关蛋白的表达心、肾组织冰冻切片，室温放置5 min后，多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100破膜，5% BSA室温封闭1 h，一抗4 ℃过夜，荧光二抗室温孵育1 h，DAPI复染，利用荧光显微镜于×10、×40镜下进行观察并拍照。
1.4.9 Western blot法检测EndMT/EMT相关蛋白的表达分别称取心、肾组织样本各60~80 mg，按1 ∶ 9加入RIPA裂解液(含100×PMSF)，匀浆机充分研磨组织，于4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min，取上清液，按1 ∶ 4加入RIPA裂解液，利用蛋白浓度测定仪测定浓度，根据蛋白浓度调整稀释液总量，再按1 ∶ 4加入上样缓冲液，最后煮样机中100 ℃煮样10 min以变性，待样品冷却后加入到10%的SDS-PAGE中进行电泳，结束后转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭，4 ℃孵育一抗过夜，室温孵育二抗1 h，ECL显色，天能凝胶成像系统发光显影，TanonImage软件分析各条带灰度值，以GAPDH为内参，结果以目的蛋白相对表达量表示。
1.4.10 统计学处理采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，分别采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和双因素方差分析(Two-way ANOVA)比较各组间差异，结果均以x±s表示。
2 结果 2.1 GXD对Ⅱ型心肾综合征模型大鼠一般状况的影响Wistar大鼠行左冠状动脉结扎术，术后3 d内是死亡高发时间段，因手术操作死亡2只，麻醉苏醒后部分大鼠出现心动过速或心动过缓现象，死亡2只；术后因鼻头和眼角出现渗血，死亡3只；因出现张口呼吸、端坐呼吸症状，死亡3只。将造模成功的32只大鼠，随机分为模型组(n=8)、盐酸贝那普利组(n=8)和GXD低剂量组(n=8)和GXD高剂量组(n=8)。假手术组开胸未结扎，全部存活。术后72 h开始给药，造模周期为10周。
实验过程观察发现，假手术组的大鼠毛发光滑且色泽洁白，行动敏捷活跃；模型组的大鼠毛发干枯且色泽欠佳，行动缓慢迟钝；与模型组相比，Benazepril组和GXD低、高剂量组上述的症状均有所减轻改善。与假手术组相比，模型组心、肾脏器指数明显上升(P < 0.05，P < 0.01)，说明出现心肌肥厚和肾脏肥大；与模型组相比，GXD高剂量组心、肾脏器指数明显降低(P < 0.01)，见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of GXD on cofficients of heart and kidney in rats with type Ⅱ cardiorenal syndrome (x±s, n=4) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Sham, ##P < 0.01 vs Model. |
经前期研究证实，超声心动图是衡量大鼠心功能变化的最直观、准确的指标之一。在药物干预终止前，对大鼠进行超声心动图监测，见Fig 2A。如Fig 2B所示，与假手术组比较，模型组动物心脏的EF和FS明显降低(P < 0.01)，说明模型大鼠发生了明显的心功能障碍，与模型组比较，Benazepril组和GXD低、高剂量组EF、FS明显上升(P < 0.01)。与假手术组相比，模型组的LVPWd、LVPWs、IVSd、IVSs均明显下降(P < 0.01)，与模型组相比，Benazepril组和GXD低、高剂量组LVPWd、LVPWs、IVSd、IVSs都明显升高(P < 0.05，P < 0.01)。
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| Fig 2 Effect of GXD on cardiac function in rats with type Ⅱ cardiorenal syndrome (x±s, n=4) **P < 0.01 vs Sham, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Model. |
与假手术组比较，模型组大鼠的LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV明显升高(P < 0.01)。Benazepril组和GXD低、高剂量组的LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV分别明显降低，与模型组比较差异有统计学意义(P < 0.05，P < 0.01)。结果表明，GXD对Ⅱ型心肾综合征所致的心功能障碍有明显的改善作用。
2.3 GXD对Ⅱ型心肾综合征大鼠血清生化的影响与假手术组比较，Ⅱ型心肾综合征模型大鼠血清中AST、LDH、CK-MB、UA、Cr、BUN均出现明显上升(P < 0.01)；与模型组比较，Benazepril组和GXD低、高剂量组动物血清中AST、LDH、CK-MB、UA、Cr、BUN均明显下降(P < 0.01)。说明长期的慢性心肌缺血，造成心脏和肾脏的持续性灌注压不足，心肌供氧不足，舒张收缩功能受损；肾小球严重受损，肾功能出现障碍，血液中的各项特征指标出现异常，盐酸贝那普利、GXD分别给药后，各项指标得到明显改善。血清生化结果见Fig 3。
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| Fig 3 Effect of GXD on blood biochemical indicators in rats with type Ⅱ cardiorenal syndrome (x±s, n=8) S: Sham; M: Model; B: Benazepril; L: GXDL; H: GXDH. **P < 0.01 vs Sham, ##P < 0.01 vs Model. |
HE和Masson染色结果显示，假手术组的心肌细胞排列整齐，分布均匀，细胞核呈椭圆形或扁长形，大小形态正常；模型组的心肌细胞出现坏死，间隙扩大，肌纤维断裂溶解，有大量炎性细胞的浸润和大面积胶原沉积，细胞核紊乱呈无规则形状或部分。与模型组相比，盐酸贝那普利和GXD低、高剂量组心肌细胞坏死和炎性细胞浸润状况有不同程度的改善，胶原纤维沉积减少，部分细胞核形态趋于正常。假手术组的肾小球、肾小管结构清晰、排列紧密，细胞分布均匀，细胞核呈紧凑排列，呈圆形或椭圆形；模型组的肾小管间质水肿扩大，有大量炎性细胞浸润和大面积胶原沉积出现，肾小球萎缩，细胞核皱缩聚集，形态紊乱，有大量炎性细胞浸润，周边有纤维组织沉积。与模型组相比，盐酸贝那普利组和GXD低、高剂量组肾小管上皮细胞脱落和空泡变性减轻，肾小球萎缩和炎性细胞浸润有所改善，肾间质纤维化程度明显减轻。见Fig 4、5。
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| Fig 4 Effect of GXD on heart pathological changes of rats with type Ⅱ cardiorenal syndrome (×100) |
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| Fig 5 Effect of GXD on renal pathological changes of rats with type Ⅱ cardiorenal syndrome (×100) |
结缔组织的大量增生，也是胶原沉积的结果。羟脯氨酸是胶原中特有的氨基酸，也是主要成分之一。对心、肾组织中羟脯氨酸含量的测定，可以分析体内胶原蛋白分解代谢情况，作为衡量胶原含量的特定指标。结果如Fig 6所示，与假手术组比较，模型组大鼠心、肾组织的胶原纤维大量沉积，差异具有统计学意义(P < 0.01)；与模型组比较，GXD低、高剂量组大鼠心、肾组织的胶原纤维沉积明显减轻(P < 0.01)。
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| Fig 6 Effect of GXD on hydroxyproline level in heart and kidney of rats with type Ⅱ cardiorenal syndrome (x±s, n=8) S: Sham; M: Model; B: Benazepril; L: GXDL; H: GXDH. **P < 0.01 vs Sham, ##P < 0.01 vs Model. |
免疫荧光法结果见Fig 7，8。大鼠心脏组织内皮细胞标志物为CD31(绿色荧光)，而间质细胞的标志物为α-SMA(红色荧光)。与假手术组相比，模型组大鼠心脏组织中α-SMA阳性表达明显增加，而CD31表达明显减少且分布范围缩小，出现α-SMA和CD31共表达细胞，提示内皮细胞向间质细胞转化；与模型组比较，GXD低、高剂量组大鼠心脏组织中α-SMA和CD31共表达细胞较少，α-SMA阳性表达明显降低，CD31表达明显增加及分布范围明显扩大。结果提示，GXD能够抑制心脏血管内皮细胞转化为间质细胞，减缓大鼠心脏组织的EndMT进程。
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| Fig 7 Effect of GXD on EndMT in heart of rats with type Ⅱ CRS (×100, ×400) |
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| Fig 8 Effect of GXD on EMT in kidney of rats with type Ⅱ CRS (×100, ×400) |
大鼠肾小管上皮细胞标志物为E-cadherin(绿色荧光)，而间质细胞标志物为α-SMA(红色荧光)。与假手术组相比，模型组大鼠肾脏组织α-SMA阳性表达明显增加，E-cadherin表达明显减少，出现α-SMA和E-cadherin共表达细胞，说明有大量间质细胞由上皮细胞转化生成；与模型组相比，GXD低、高剂量组大鼠肾脏组织中α-SMA和E-cadherin共表达细胞较少，α-SMA阳性表达明显降低，E-cadherin阳性表达明显增加。结果表明，GXD能够抑制肾脏组织中上皮细胞向间质细胞转化，减缓Ⅱ型心肾综合征大鼠肾脏组织的EMT进程。
Western blot所得结果与免疫荧光结果一致。与假手术组比较，模型组间质细胞标志物α-SMA、Vimentin表达明显上升，而内皮/上皮细胞标志物CD31、E-cadherin表达明显减少(P < 0.01)；与模型组比较，GXD低、高剂量组间质细胞标志物α-SMA、Vimentin表达明显下调，而内皮/上皮细胞标志物CD31、E-cadherin表达明显上调(P < 0.05, P < 0.01)，表明GXD对Ⅱ型心肾综合征大鼠心、肾组织中的EndMT/EMT有一定的抑制作用，心、肾纤维化得到改善，见Fig 9。
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| Fig 9 Effect of GXD on EndMT/EMT related proteins in heart and kidney of rats with type Ⅱ CRS (x±s, n=4) S: Sham; M: Model; B: Benazepril; L: GXDL; H: GXDH. **P < 0.01 vs Sham, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Model. |
目前，心血管相关疾病有着高发病率和病死率，被列为世界上最大的健康问题，约2/3的心衰患者同时患有慢性肾衰疾病[10]，最终发展为终末期的纤维化状态，这属于临床上心肾综合征的特征之一。经研究，发达国家45%的死亡率归因于慢性纤维增生疾病[11]，而EndMT/EMT参与了心、肾的纤维化进程[3, 12]。大量的成纤维细胞分泌ECM，形成胶原沉积，作为组织纤维化的基础。同时，炎症反应释放的炎症因子TGF-β负责调控相关转录因子，由转录因子调控间质标志物，从而促进EndMT/EMT进程。最终表现为内皮/上皮细胞失去其特定内皮/上皮标志而获得间质细胞表型，发生心、肾脏器纤维化[13]。通过抑制EndMT/EMT进程，从而延缓心肾纤维化进程，恢复心肾功能。目前尚未发现能够同时有效防治心肾纤维化并且保护心肾功能的药物。GXD属于汉代经典名方，瓜蒌清热化痰，薤白行气导滞，常用于胸痹心痛[14]，古今中外多位医学者深信不疑并常常应用于实践。研究发现，主要有效成分包括：皂苷类、黄酮类和含氮及其他类化合物[15]。其中报道最多的是具有抗心肌缺血能力的皂苷类，本课题组前期研究发现[16]，瓜蒌薤白的醇提物主成分是甾醇皂苷，对心肌缺血大鼠模型起到抗心肌缺血及抗纤维化作用，但GXD对心肾纤维化的同步防治作用及其具体机制尚未报道。
本实验通过LAD结扎10周模拟Ⅱ型CRS模型，这种减弱心肌收缩力的方法认可度和相似度高，较好地模拟人类Ⅱ型CRS疾病发展进程[17]，从而基于EndMT/EMT探讨GXD对Ⅱ型CRS的治疗作用及潜在的作用机制。研究结果表明，造模后大鼠的心肌前壁梗死泛白严重，收缩性肌纤维丢失，导致舒张功能发生障碍。肾小球过滤能力下降，肾小管明显扩张。病理组织切片染色结果显示，GXD能够减少心肌和肾间质的炎性细胞聚集浸润，降低组织中的胶原沉积。同时恢复心、肾功能，减少心肾组织中羟脯氨酸的含量，提示GXD明显干预Ⅱ型心肾综合征中心肾纤维化的进程。心脏、肾脏成纤维细胞的活化是心脏、肾脏纤维化最主要的启动因子。已有研究[3-4]证实，心脏血管内皮细胞、肾小管上皮细胞是成纤维细胞的主要转化来源。炎症反应促进TGF-β1的大量分泌，促进EndMT/EMT的发生发展，E-cadherin、CD31等内皮细胞标志物减少，Vimentin、α-SMA等间质细胞标志物增多，内皮细胞功能明显下降，心脏、肾脏异常的ECM沉积，组织纤维化明显增生。本实验验证了GXD可以从蛋白水平下调Vimentin、α-SMA和TGF-β1蛋白的表达，上调E-cadherin、CD31蛋白的表达，这表明GXD可以明显抑制EndMT/EMT，减轻心肾组织的纤维化程度。
综上所述，GXD对结扎LAD造成的心肾纤维化有明显干预作用，其机制可能与GXD能够下调间质细胞标志物蛋白Vimentin、α-SMA和TGF-β1的表达和上调内皮细胞标志物蛋白E-cadherin、CD31的表达。通过延缓Ⅱ型CRS中的EndMT/EMT过程，恢复心肾功能。但GXD对心脏、肾脏内皮细胞转分化的确切作用及相互间联系还需要验证，有待对其中具体作用机制的深入探讨。
| [1] |
Ronco C, Bellasi A, Di Lullo L. Cardiorenal syndrome: an overview[J]. Adv Chronic Kidney Dis, 2018, 25(5): 382-90. doi:10.1053/j.ackd.2018.08.004 |
| [2] |
Kumar U, Wettersten N, Garimella P S. Cardiorenal syndrome: Pathophysiology[J]. Cardiol Clin, 2019, 37(3): 251-65. doi:10.1016/j.ccl.2019.04.001 |
| [3] |
Li Y, Lui K O, Zhou B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases[J]. Nat Rev Cardiol, 2018, 15(8): 445-56. doi:10.1038/s41569-018-0023-y |
| [4] |
Wang J, Zhu H, Huang L, et al. Nrf2 signaling attenuates epithelial-to-mesenchymal transition and renal interstitial fibrosis via PI3K/Akt signaling pathways[J]. Exp Mol Pathol, 2019, 111: 104296. doi:10.1016/j.yexmp.2019.104296 |
| [5] |
Travers J G, Kamal F A, Robbins J, et al. Cardiac fibrosis: The fibroblast awakens[J]. Circ Res, 2016, 118(6): 1021-40. doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.306565 |
| [6] |
Yuan Q, Tan R J, Liu Y. Myofibroblast in kidney fibrosis: Origin, activation, and regulation[J]. Adv Exp Med Biol, 2019, 1165: 253-83. |
| [7] |
王阶, 刘超, 惠小珊, 等. "通法"内涵及其在冠心病的临床应用[J]. 中国实验方剂学杂志, 2022, 28(1): 1-6. Wang J, Liu C, Hui X S, et al. Connotation and clinical application of Tong (Dredging) method in treatment of coronary heart disease[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2022, 28(1): 1-6. |
| [8] |
丁永芳. 基于内皮-间质转化的心肌纤维化细胞模型的建立和瓜蒌薤白白酒汤的应用[D]. 南京: 南京中医药大学, 2014. Ding Y F. Establishment and application of myocardial fibrosis cell model based on endothelial-mesenchymal transition[D]. Nanjing: Nanjing Univ Chin Med, 2014. |
| [9] |
Qiu Q, Cao J, Wang Y, et al. Time course of the effects of Buxin Yishen decoction in promoting heart function and inhibiting the progression of renal fibrosis in myocardial infarction caused type 2 cardiorenal syndrome rats[J]. Front Pharmacol, 2019, 10: 1267. doi:10.3389/fphar.2019.01267 |
| [10] |
Harrison J C, Smart S D G, Besley E M H, et al. A clinically relevant functional model of type-2 cardio-renal syndrome with paraventricular changes consequent to chronic ischaemic heart failure[J]. Sci Rep, 2020, 10(1): 1261. doi:10.1038/s41598-020-58071-x |
| [11] |
Henderson N C, Rieder F, Wynn T A. Fibrosis: From mechanisms to medicines[J]. Nature, 2020, 587(7835): 555-66. doi:10.1038/s41586-020-2938-9 |
| [12] |
Sun Y B, Qu X, Caruana G, et al. The origin of renal fibroblasts/myofibroblasts and the signals that trigger fibrosis[J]. Differentiation, 2016, 92(3): 102-7. doi:10.1016/j.diff.2016.05.008 |
| [13] |
张均田, 杜冠华. 现代药理实验方法[M]. 第2版. 北京: 中国协和医科大学出版社, 2012: 1925-39. Zhang J T, Du G H. Modern pharmacological experiment methods[M]. 2nd edition. Beijing: Chin Union Med Coll Press, 2012: 1925-39. |
| [14] |
张腾, 张艳军, 庄朋伟, 等. 瓜蒌对心梗后心衰大鼠心功能及心肌细胞凋亡的影响[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(8): 1183-4. Zhang T, Zhang Y J, Zhuang P W, et al. Effects of Gualou on cardiac function and cardiomyocyte apoptosis in heart failure following myocardial infarction in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(8): 1183-4. |
| [15] |
何祥久. 穿心莲内酯大鼠体内代谢产物及瓜萎薤白白酒汤活性成分研究[D]. 沈阳: 沈阳药科大学, 2002. He X J. The metabolites research of andrographolide in rats and the active constituents research of Gualou-Xiebai-Baijiu-Tang[D]. Shenyang: Shenyang Pharm Univ, 2002. |
| [16] |
Ding Y F, Peng Y R, Li J, et al. Gualou Xiebai decoction prevents myocardial fibrosis by blocking TGF-beta/Smad signalling[J]. J Pharm Pharmacol, 2013, 65(9): 1373-81. doi:10.1111/jphp.12102 |
| [17] |
查玉玲, 孔淼, 周育平, 等. Ⅱ型心肾综合征动物模型研究进展[J]. 中国实验动物学报, 2021, 29(4): 535-41. Zha Y L, Kong M, Zhou Y P, et al. Advances in the study of animal models of cardiorenal syndrome[J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2021, 29(4): 535-41. |