2. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012
2. School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China
大量饮酒会加速酒精性脂肪肝向酒精性肝炎的转变，同时产生氧化应激及炎症损伤[1]。肝脏脂肪变性是酒精暴露的早期反应，也是酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的初始阶段。乙醇的消耗增加了细胞活性氧和其他促氧化剂的过度产生，并消耗内源性抗氧化剂，导致肝脏的氧化应激[2]。氧化应激会导致炎症因子的产生，肝脏炎症在ALD的发病机制中具有极其重要的作用，特别是从肝脏脂肪变性发展到以持续性肝脏炎症为特征的酒精性肝炎。目前，除了戒酒外，临床上还没有有效治疗ALD的手段。国内外研究发现，持续摄入过量酒精会促进肝脏枯否细胞中的Toll样受体4识别脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，导致促炎细胞因子分泌，从而进一步发展成ALD，促炎因子IL-6导致非受体酪氨酸激酶(janus kinase; JAK)的激活，而后介导信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)的磷酸化，进而介导炎症反应的发生[3-4]。但JAK/STAT信号通路对ALD的作用机制尚不明确，故本实验为此做出初步机制探讨。
丹皮酚是从毛莨科芍药属植物芍药、牡丹的根皮及萝藦科植物徐长卿的干燥根或全草中提取的活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血脂等功效[5-7]。丹皮酚可降低大鼠血清中TNF-α、IL-6等炎症因子水平[8]。本课题组前期研究表明，丹皮酚对小鼠酒精性肝损伤有改善作用[7, 9]。肝损伤时会通过IL-6、TNF-α等细胞因子激活JAK/STAT信号通路引起炎症反应，细胞因子信号抑制物3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)蛋白是JAK/STAT信号通路的反馈负调控因子，特异性负反馈抑制JAK/STAT通路激活[10-12]。研究发现[13]，丹皮酚可通过调控JAK/STAT信号通路抑制巨噬细胞的M1型极化发挥抗炎作用。因此，本实验通过建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，基于JAK2/STAT3信号通路探讨丹皮酚对酒精性肝损伤小鼠的作用及机制，以积累有关氧化应激和炎症作用的相关知识，这将有助于建立最佳的实验性ALD模型，可用于快速筛选潜在治疗药物和进行药理研究。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级C57BL/6小鼠42只，♂，7周龄，20 g±2 g，从杭州子源实验动物科技有限公司购买，饲养在安徽中医药大学中西医结合学院动物实验中心，所有操作均在标准实验室条件下进行，22 ℃±3 ℃，60%±5%相对湿度，12 h明暗循环。动物许可证号：SCXK(浙)2019-0004，实验所用动物皆符合安徽中医药大学动物伦理审查标准，动物伦理号：AHUCM-mouse-2022041。
1.2 主要试剂与仪器丹皮酚购自上海源叶生物科技有限公司(批号：X21A11S111651)，水飞蓟宾胶囊购自天津天士力圣特制药有限公司(批号：050710059)，Lieber-DeCarli酒精液体饲料、对照液体饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司(代码：TP4030D，TP4030C)，三酰甘油(TG)(批号：20220310)、总胆固醇(TC)(批号：20220409)、谷丙转氨酶(ALT)(批号：20220309)、天冬氨酸转氨酶(AST)(批号：20220310)、还原型谷胱甘肽(GSH)(批号：20220103)、超氧化物歧化酶(SOD)(批号：20210617)、丙二醛(MDA)(批号：20210616)、过氧化氢酶(CAT)(批号：20211230)测试盒购自南京建成生物工程研究所，ELISA检测试剂盒购自江苏酶免实业有限公司，苏木精-伊红(HE)染色液购自北京Leagene生物科技有限公司(批号：0911A19)，油红O染液购自武汉Servicebio公司(批号：CR2012044)，JAK2抗体(批号：LL0223)、STAT3抗体(批号：LL0303)、p-STAT3抗体(批号：LL0107)、SOCS3抗体(批号：LL0429)、山羊抗兔免疫球蛋白IgG/HRP二抗(批号：LL0105)购自成都正能生物技术有限责任公司，p-JAK2抗体购自美国Affinity公司(批号：AF3022)。
H1-16KR型冷冻离心机(湖南可成仪器设备有限公司)；OLYMPUSBX51正置显微镜(上海富莱光学科技有限公司)；37 ℃恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；K3酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)；电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；LEICA CM1950冷冻切片机(德国徕卡)。
1.3 方法 1.3.1 小鼠酒精性肝损伤的建立与分组给药酒精性肝损伤模型的建立[14]是基于NIAAA(国家酒精滥用和酒精中毒研究所)使用的方法，对照液体饲料采用等热量喂养的方式给予对照组小鼠食用，其他各组小鼠自由饮用Lieber-DeCarli酒精液体饲料。将小鼠随机分为6组，即对照组、模型组、阳性对照水飞蓟宾(36.8 mg·kg-1)组、丹皮酚低、中、高(120、240、480 mg·kg-1)剂量组[9]，每组7只。将药物溶于0.5% 羧甲基纤维素钠中，给药时，对照组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液。每日观察小鼠状态，造模期间每2天称取小鼠体质量，计算饮用量并更换液体饲料，造模次日起给药，连续10 d，统一按照10 mL·kg-1灌胃；第11天，小鼠口服单剂量31.5%乙醇或等热量糊精溶液(20 mL·kg-1灌胃)。禁食9 h后麻醉小鼠，采集血液，取肝组织备用。
1.3.2 血脂、肝功能测定麻醉小鼠后，眼球取血，静置30 min，4 ℃离心机3 500 r·min-1，10 min。吸取上层血清，-20 ℃保存。根据试剂说明书对TG、TC、ALT、AST等进行含量测定。
1.3.3 ELISA检测血清炎症因子根据说明书进行血清检验，检测并计算出血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量。
1.3.4 肝组织氧化应激水平测定研磨肝组织，离心后取上层匀浆，用BCA测蛋白浓度，然后根据相应测试盒说明书进行CAT、GSH、SOD、MDA的含量检测。
1.3.5 肝组织病理检查用生理盐水迅速清洗肝组织，滤纸滤干，置于4%多聚甲醛中固定，取出，放在包埋盒中，流水冲洗2 h，而后进行脱水包埋，切片，HE染色，正置显微镜观察。
1.3.6 肝脏油红O染色取小鼠肝组织包埋于OCT包埋剂中，-80 ℃冰箱保存。冷冻切片，4%多聚甲醛固定15 min，进行油红O染色，显微镜下观察。
1.3.7 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测蛋白表达水平提取肝组织总蛋白，应用BCA试剂对其进行蛋白定量，转移上清液，按体积加入5×上样缓冲液，100 ℃水浴5 min使得蛋白变性，自然冷却备用。SDS-PAGE电泳分离，切胶，转膜，使得蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后，TBST洗膜×3次，每次10 min，分别加入相应抗体SOCS3(1 ∶1 000)、JAK2(1 ∶1 000)，p-JAK2(1 ∶1 000)，STAT3(1 ∶1 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次后放入二抗中，孵育1 h，用TBST洗膜，3次，每次10 min。应用ECL法显色，用ImageJ分析蛋白灰度值并计算出目的蛋白的表达量。
1.3.8 免疫组化法检测酒精性肝损伤小鼠肝组织中p-JAK2、p-STAT3、SOCS3蛋白表达水平取厚5 μm石蜡切片，经脱蜡水化，用柠檬酸盐缓冲液修复抗原，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，PBS洗涤3次，3% BSA封闭20 min，滴加一抗SOCS3(1 ∶100)、p-JAK2(1 ∶100)、p-STAT3(1 ∶100)4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次，二抗37 ℃孵育20 min，DAB显色，复染，脱水，封片，光学显微镜观察并拍照，用ImageJ软件分析蛋白表达量。
1.3.9 统计学方法采用SPSS 25.0软件分析本实验所得数据，以x±s表示，单因素方差分析用于多组间比较，LSD检验用于方差齐者，Games-Howell检验用于方差不齐者。
2 结果 2.1 丹皮酚对血脂和肝功能的治疗效果相对于对照组，模型组小鼠血清中TG、TC、ALT、AST水平明显上升(P<0.01)；相对于模型组，丹皮酚中、高剂量组与水飞蓟宾组血清TG、TC、ALT、AST水平明显降低(P<0.01或P<0.05)。表明丹皮酚具有调节小鼠血脂，改善肝功能损伤的作用，且中、高剂量组疗效更好(Fig 1)。
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| Fig 1 Blood lipid and liver function levels in each group of mice (x±s, n=7) 1:Con; 2:ALD; 3:ALD+SIL; 4:ALD+H; 5:ALD+M; 6:ALD+L. A-B: Determination results of serum lipid-related indicators in each group of mice; C-D: Determination results of serum liver function-related indicators in each group of mice. Con: Control group; ALD: ALD model group; ALD+H: ALD+Paeonol high concentration group; ALD+M: ALD+Paeonol middle concentration group; ALD+L: ALD+Paeonol low concentration group; ALD+SIL: ALD+silibinin. **P<0.01 vs Control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs Model group. |
相对于对照组，模型组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明显升高(P<0.01)；相对于模型组，丹皮酚各剂量组与水飞蓟宾组血清IL-6、IL-1β、TNF-α明显降低(P<0.01或P<0.05)。表明丹皮酚具有改善肝脏炎症作用，其中，中、高剂量组疗效强于低剂量组(Fig 2)。
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| Fig 2 Serum IL-6, IL-1β and TNF-α levels in each group of mice (x±s, n=6) 1:Con; 2:ALD; 3:ALD+SIL; 4:ALD+H; 5:ALD+M; 6:ALD+L. A-B: Serum inflammatory factor levels. **P<0.01 vs Control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs Model group. |
相对于对照组，模型组小鼠肝组织CAT、GSH、SOD水平明显降低(P<0.05或P<0.01)；相对于模型组，丹皮酚高剂量组与水飞蓟宾组肝组织CAT、GSH、SOD水平明显上升(P<0.05或P<0.01)。相对于对照组，模型组小鼠肝组织MDA水平明显上升(P<0.01)；相对于模型组，丹皮酚各剂量组与水飞蓟宾组肝组织MDA水平明显降低(P<0.01)。表明丹皮酚具有调节机体氧化应激水平的作用(Fig 3)。
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| Fig 3 Measurement of oxidative stress-related indexes in various groups of mice (x±s, n=7) 1:Con; 2:ALD; 3:ALD+SIL; 4:ALD+H; 5:ALD+M; 6:ALD+L. A: CAT content of liver tissue in each group of mice; B: GSH content of liver tissue in each group of mice; C: SOD content of liver tissue in each group of mice; D: MDA content of liver tissue in each group of mice. *P<0.05, **P<0.01 vs Control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs Model group. |
正常组肝小叶具有完整结构，细胞索排列有序，无明显脂滴形成，无炎性细胞浸润；模型组肝小叶结构遭到破坏，肝细胞索无序排列，肝细胞有小而密的圆孔形成，脂滴积累，并伴随大量炎细胞浸润；与模型组相比，各给药组小鼠肝组织病理情况有明显改善，切片染色结果表明，丹皮酚与水飞蓟宾用药组可以在不同水平上减少肝组织的脂肪变性和炎性浸润，且丹皮酚中、高剂量组治疗效果优于低剂量组(Fig 4)。
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| Fig 4 Histopathological pictures of liver tissues in various groups of mice (HE staining, ×200) |
显微镜下观察，正常组几乎无脂肪滴空泡红染；模型组有大面积脂肪滴红染，水飞蓟宾组几乎无脂肪滴，丹皮酚中、高剂量组仅小部分小泡型脂肪滴红染，低剂量组红染情况较模型组有所减少，进一步说明丹皮酚能改善肝脏脂肪病变(Fig 5)。
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| Fig 5 Pathological pictures of liver oil red O staining in various groups of mice (oil red O, ×200) |
与对照组比较，模型组小鼠肝组织p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平升高(P<0.01)，SOCS3蛋白表达水平降低(P<0.01)；与模型组比较，丹皮酚高剂量组与水飞蓟宾组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平降低(P<0.01)，SOCS3蛋白表达水平升高(P<0.05)。结果表明丹皮酚可通过调节JAK2/STAT3通路蛋白表达从而减轻炎症反应(Fig 6)。
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| Fig 6 Each group of mice liver tissue p-JAK2, p-STAT3, SOCS3 protein expression (x±s, n=3) A: Control group; B: ALD model group; C: ALD+silibinin; D: ALD+Paeonol high concentration group; E: ALD+Paeonol middle concentration group; F: ALD+Paeonol low concentration group. **P<0.01 vs Control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs Model group. |
与对照组比较，模型组小鼠肝组织p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平升高(P<0.01)，SOCS3蛋白表达水平降低(P<0.01)；与模型组比较，丹皮酚高剂量组与水飞蓟宾组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平降低(P<0.01)，SOCS3蛋白表达水平升高(P<0.01)(Fig 7)。
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| Fig 7 Immunohistochemical detection of liver p-JAK2, p-STAT3, SOCS3 protein expression in each group of mice (×200, x±s, n=3) **P<0.01 vs Control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs Model group. |
酒精引起的肝损伤机制复杂，主要涉及脂质代谢失衡、氧化应激、肝脏炎症等。丹皮酚药理作用广泛，对肝脏系统具有良好的保护作用，其机制主要与丹皮酚抗氧化、抗炎作用有关，因此有可能改善小鼠酒精性肝损伤症状。C57BL/6小鼠是对酒精厌恶程度较低的品系，不像其他品系小鼠那样需要较长的适应期。目前国内外多采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导建立ALD动物模型[14]。研究发现[15]，小鼠在喂养Liber-Decarli酒精液体饲料10 d后再灌胃一定剂量的乙醇，可达到比单独喂养急性或慢性乙醇更高的血乙醇浓度，且可协同诱导小鼠肝脏脂肪变性、炎症和肝损伤。本研究通过Lieber-DeCarli酒精液体饲料成功建立急性酒精性肝损伤模型，ALD组小鼠出现血清ALT、AST水平、肝脏氧化应激参数MDA、肝脏脂质积累和血清炎症细胞因子水平明显升高，提示小鼠ALD模型建立成功。
课题组前期研究显示[7]，减少肝脏中的脂质积累是阻止或延缓ALD进展的重要措施。本研究结果表明，丹皮酚可明显减轻肝脏脂质蓄积，降低血清TG、TC水平；明显降低ALT、AST、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平，减轻肝损伤及炎症反应；同时丹皮酚能升高ALD小鼠肝脏CAT、GSH、SOD等抗氧化物水平，有效缓解酒精引起的氧化应激损伤。
JAK/STAT信号通路是一种广泛表达的细胞内信号转导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节[16]。JAK2是炎症反应、细胞增殖分化等许多生理和病理过程的重要调控因子，其他信号分子如STAT1、STAT3和STAT5也受JAK2调控，特别是JAK2可以诱导STAT3磷酸化。STAT3作为一种胞质信号转录因子，在介导肝损伤的过程中发挥重要作用。JAK2的激活触发特定酪氨酸残基受体磷酸化，磷酸化的酪氨酸位点随后与周围的氨基酸序列形成特定的“对接位点”，STAT3蛋白被招募到此“对接位点”即刻被磷酸化，而后被激活的STAT3蛋白以二聚体的形式转到细胞核中与目的基因结合，并调节基因的转录控制。SOCS的表达是由触发JAK/STAT通路的相同细胞因子迅速诱导的，SOCS3可以直接与磷酸化的JAK相互作用，抑制JAK激酶的激活。本研究中，SOCS3作为JAK2/STAT3信号通路下游的靶基因发挥负反馈调节作用，其主要是通过与JAK2激酶和细胞因子受体结合来抑制STAT3的激活，减轻炎症反应。本实验中，丹皮酚用药组可以降低受酒精影响的p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平，升高SOCS3蛋白表达水平。由此可见，丹皮酚可通过调控JAK2/STAT3信号通路来减轻机体炎症反应。
综上所述，丹皮酚可明显减轻小鼠急性酒精性肝损伤，其机制可能是通过调控JAK2/STAT3信号通路减轻炎症损伤和氧化应激实现的。丹皮酚具有成为保肝护肝药物的潜力。但由于实验进度问题，本研究尚未在细胞水平开展实验，且鉴于国内外对ALD的细胞死亡、免疫反应和炎症的知识的扩展，ALD的各种致病因素之间关系的详细机制仍在继续被探讨，后续将在细胞水平验证并探讨其作用机制。
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