砷是一种自然环境中广泛存在的非金属元素[1]。人类在自然环境和工业活动中长期接触受砷污染的水、空气和食物而中毒，造成组织器官损伤、甚至癌变。此外，砷引起神经系统损害也受到人们越来越多的关注[2]。但目前砷引起神经损伤的具体机制仍不是十分明确。Hippo信号通路是一条在进化上高度保守的激酶级联信号通路，主要控制器官大小、组织稳态和组织再生[3]。本课题组已经证实，NaAsO2可通过激活Hippo信号通路，诱导PC12细胞凋亡。突触后致密蛋白95(post synaptic density protein，PSD95)、突触素蛋白(synaptophysin，SYN)作为神经突触功能相关蛋白，其表达和缺失在神经系统疾病中十分重要[4]。因此，本实验在前期研究的基础上探讨Hippo通路是否参与NaAsO2对PC12细胞活性、形态以及PSD95、SYN神经突触相关蛋白表达的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞PC12细胞株(中科院昆明细胞库)
1.1.2 试剂亚砷酸钠(Sigma)，DMEM培养基、青霉素/链霉素(Gibco)，胎牛血清(BI)，CCK-8(碧云天)，PSD95、SYN(武汉三鹰)，XMU-MP-1(MCE)、抗兔IgG-HRP二抗(中杉金桥)，ECL曝光液(Millipore)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养PC12细胞的培养使用DMEM全培养基，培养在5% CO2、37 ℃环境的培养箱中。
1.2.2 细胞处理及分组细胞毒性实验分别用0、10、20、30、40、50、60 μmol·L-1 NaAsO2处理24和48 h，筛选NaAsO2浓度后分为Control组、XMU-MP-1组、NaAsO2组、XMU-MP-1+NaAsO2组。
1.2.3 CCK-8法检测细胞存活率CCK-8检测不同浓度NaAsO2处理24和48 h、XMU-MP-1处理和XMU-MP-1+NaAsO2处理后的细胞存活率。
1.2.4 倒置显微镜观察细胞形态、检测细胞数量、细胞平均长度利用ImageJ软件计数。对40 μmol·L-1 NaAsO2、XMU-MP-1和XMU-MP-1+NaAsO2处理24 h的细胞随机选取50个细胞进行长度测定。
1.2.5 Western blot检测PSD95、SYN蛋白表达提取各组蛋白并用BCA法定量。经电泳，转膜，封闭后，孵育一抗、二抗，经ECL曝光。
1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 19.0行统计学分析。数据以x±s表示。两个独立样本采取t检验，多组数据间的比较则使用单因素方差分析。
2 结果 2.1 NaAsO2对PC12细胞活力的影响CCK-8检测表明，与对照组相比，不同浓度NaAsO2处理24或48 h均使PC12细胞活力降低(P < 0.05)。
2.2 Hippo通路参与NaAsO2对PC12细胞活力的影响与对照组相比，NaAsO2(40 μmol·L-1)组细胞活力降低(P < 0.01)；XMU-MP-1组细胞活力无影响；与NaAsO2组比较，XMU-MP-1+NaAsO2组细胞活力明显增加(P < 0.01)。
2.3 Hippo通路参与NaAsO2对PC12细胞形态的影响与对照组相比，NaAsO2组细胞形态由长梭形变为椭圆形；XMU-MP-1组细胞形态无影响；与NaAsO2组比较，XMU-MP-1+NaAsO2组细胞总数量和平均长度均增加(P < 0.05)。
2.4 Hippo通路参与NaAsO2对SYN、PSD95突触相关蛋白表达水平的影响与对照组相比，NaAsO2组SYN、PSD95蛋白表达明显降低(P < 0.05)；MU-MP-1组SYN、PSD95蛋白表达无影响(P>0.05)；与NaAsO2组比较，XMU-MP-1+NaAsO2组SYN、PSD95蛋白表达明显增加(P < 0.01)。
3 讨论砷可通过抑制神经前体细胞的增殖、成熟和神经元迁移导致中枢和周围神经系统损伤[5]。本实验染砷组细胞数量变少、细胞间距变大、形态由长梭形变为圆形或椭圆形。CCK-8实验也显示砷处理的活细胞数量呈时间、剂量依赖性下降。
突触形成是突触可塑性的一个重要指标，突触丢失可导致认知缺陷[6]。SYN和PSD95作为突触相关蛋白，在维持突触的正常功能和突触可塑性中起着重要作用。研究发现，在患有阿尔茨海默病大鼠脑组织中，PSD95、SYN蛋白的表达下调[7]，本实验中，NaAsO2导致PC12细胞中PSD95、SYN蛋白的表达降低，伴随神经突起缩短，形态呈圆形或者扁圆形改变。提示，NaAsO2影响突触蛋白PSD95、SYN的表达，损伤神经突起，细胞活性降低，影响神经生长发育。
Hippo通路抑制剂XMU-MP-1抑制MST1/2活性从而抑制下游蛋白LATS1的磷酸化。在本实验中，XMU-MP-1预处理可以逆转NaAsO2诱导的PSD95、SYN蛋白水平的下调、细胞长度、活力降低，提示Hippo通路参与NaAsO2对PC12细胞活力、形态和突触蛋白的影响。然而，NaAsO2是如何通过Hippo通路下调突触蛋白PSD95、SYN的表达从而造成PC12细胞损伤的，仍需进一步的探讨。
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