2. 徐州医科大学研究生学院，江苏 徐州 221004;
3. 徐州医科大学药学院，江苏 徐州 221004
2. Graduate School, Xuzhou Medical University, Xuzhou, Jiangsu 221004, China;
3. School of Pharmacy, Xuzhou Medical University, Xuzhou, Jiangsu 221004, China
巨噬细胞浸润和促炎表型的M1型巨噬细胞极化与心脑血管等慢性疾病的发生发展密切关，M1型巨噬细胞活化过程中释放多种促炎因子、诱导活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生和激活NF-κB等信号通路等[1-2]。近年来研究显示，糖酵解途径(或称warburg效应)是M1型极化巨噬细胞获取能量的主要代谢方式[3]。多项研究结果也表明，糖酵解在M1型巨噬细胞炎性激活中发挥关键作用，而阻断糖酵解途径可有效抑制M1型巨噬细胞极化[4-5]。低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)作为机体缺氧反应的主要调节因子，其与糖酵解途径和巨噬细胞炎症表型的转化有密切关系[6-7]。有研究报道，动脉粥样硬化斑块进展与HIF-1α介导的糖酵解效应和释放炎性表型巨噬细胞相关[8]。因此，阻断HIF-1α有可能成为抑制细胞糖酵解和M1型巨噬细胞活化的有效手段。
木犀草素(luteolin)作为一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤生成等多种药理活性[9-10]。我们课题组前期研究发现，木犀草素通过上调细胞自噬水平，抑制ox-LDL诱导泡沫巨噬细胞形成和巨噬细胞凋亡[11], 以及抑制NLRP3炎症小体激活和巨噬细胞极化[12]。木犀草素是否通过糖酵解途径调控M1型巨噬细胞极化目前尚无报道，本实验就此开展研究，为今后木犀草素临床治疗心脑血管疾病提供新的理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞株小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海细胞库。
1.2 主要材料与试剂木犀草素(美国Sigma公司，L9283)；脂多糖(LPS)(美国Sigma公司，L4391)、干扰素γ(IFN-γ)(美国Peprotech公司，300-02-20)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(中国Affinity公司，AF0199)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)(中国Affinity公司，AF1009)和GAPDH抗体(中国Affinity公司，AF7021)；精氨酸酶-1(Arg-1)(美国CST公司)；β-actin抗体(美国Abcam公司，ab179467)；FITC染CD86抗体(美国Biolegend公司，10500)；PE染CD206抗体(美国Thermo Scientific公司，12206180)；2-脱氧葡萄糖(2-DG)(美国APExBIO公司，HY-13966)；TRIzol试剂(美国MCE公司，15596-026)；SYBR Premix Ex Taq II(日本TaKaRa公司，RR820A)；DMEM培养基(美国Hyclone公司，SH30243.01)；胎牛血清(美国Gibco公司，10099141)。
1.3 主要仪器Light Cycle 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；164-5052型电泳仪，170-3940型半干转印槽(美国Bio-Rad公司)；Elx808酶标仪(美国BioTek公司)；FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)。
1.4 细胞培养和M1型巨噬细胞炎症模型建立小鼠RAW264.7细胞常规培养于DMEM细胞培养液中(含有10%胎牛血清)，在5%的CO2，37 ℃条件下，恒温培养并传代。参照课题组既往方法[13]，100 μg·L-1 LPS联合20 μg·L-1 IFN-γ刺激RAW264.7细胞建立M1型巨噬细胞模型。
1.5 细胞分组与给药细胞随机分为对照组(常规培养细胞，不给予任何干预处理)(M0)和M1型巨噬细胞模型组(100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1 IFN-γ诱导)(M1)；之后将M1组分为Luteolin治疗组(16 μmol·L-1)、2-DG组(0.5 mmol·L-1，糖酵解抑制剂)、Luteolin+2-DG组、Luteolin+DMOG组(10 μmol·L-1，HIF-1α激活剂)。上述各组分别药物处理完毕后24 h收集细胞。
1.6 MTT法检测细胞活性将木犀草素与LPS+IFN-γ诱导的RAW264.7细胞共孵育24 h，并设置对照组。每组设6个复孔，每孔加入10 μL MTT溶液避光培养细胞4 h，在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光值，计算药物对细胞活性的影响。
1.7 流式细胞仪检测巨噬细胞标记物将6孔板中的细胞5% CO2孵育箱中37 ℃培养，离心吹打细胞后，然后用100 μL PBS重悬细胞。收集各组细胞，预冷PBS清洗各组细胞，离心、弃上清，100 μL PBS重悬细胞，分别加入5 μL FITC标记CD86抗体和CD206抗体4 ℃避光孵育30 min，100 μL PBS洗涤及重悬标记的细胞，用流式细胞仪检测分析。
1.8 Western blot检测提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每组样品30 μg蛋白SDS-PAGE电泳分离，转膜，封闭(5% BSA)1 h。分别加入一抗(1 ∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入二抗(1 ∶1 000)，室温下孵育1 h，TBST洗膜后，使用ECL化学发光法显色，利用ImageJ软件(美国国家卫生研究院)分析各组蛋白质的相对表达含量。
1.9 Real-time PCR检测TRIzol法提取细胞总RNA，取1 μg反转录成cDNA，上海生工生物工程技术公司合成引物，引物序列见Tab 1。按照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明进行Real-time PCR操作，反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45个循环，最后延伸10 min。2-ΔΔCT值定量分析目的基因表达数据。
| Gene | Primer sequence(5′-3′) |
| GLUT1 | F：CCGCTTCCTGCTCATCAATCGTAAC |
| R：GCCGACCCTCTTCTTTCATCTCCTG | |
| HK2 | F：TTTTAGGTCAGTCGGCGTTTCAG |
| R：ACATTGGTGTCTTCCCGTTCTTC | |
| PFK1 | F：AAGGATCCAATCTCAAGATTCATGC |
| R：TTGGATCCTTTTGCTTAACTTA AAC | |
| PK | F：GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG |
| R：CCGGGA GCTGCATGTGTCAGAGG | |
| HIF-1α | F：TCAAGTCAGCAACGTGGAAG |
| R：TATCGAGGCTGTGTCGACTG | |
| β-actin | F：AGAGGGAAATCGTGCGTGACATCAA |
| R：ATACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAA |
收集各组细胞，离心取上清，按照检测试剂盒说明书操作，96孔板每孔取200 μL进行检测，于505和530 nm波长处分别检测葡萄糖和乳酸吸光度值。
1.11 ELISA检测收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6和IL-10。
1.12 数据统计与处理实验数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 M1型巨噬细胞模型的构建及验证与对照组相比，100 μg·L-1 LPS+20 μg·L-1 IFN-γ诱导刺激RAW264.7细胞24 h后高表达M1型巨噬细胞标记物iNOS和CD86(Fig 1)，表明RAW264.7来源的M1型巨噬细胞成功建立。
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| Fig 1 Expression of M1 macrophage markers in LPS/IFN-γ-induced RAW264.7 cells(x±s, n=3) A: The protein expression of CD86 measured by flow cytometry; B: The protein expression of inducible NOS (iNOS) detected by Western blot. **P < 0.01 vs control group. |
不同浓度的木犀草素(1、2、4、8、16、32和64 μmol·L-1)分别处理LPS+IFN-γ诱导的巨噬细胞24 h，MTT结果显示32 μmol·L-1木犀草素抑制了M1型巨噬细胞活性，故本研究使用16 μmol·L-1的木犀草素用于后续试验。
2.3 各实验组M1型巨噬细胞糖酵解关键基因表达变化的比较与M0组比较，LPS+IFN-γ诱导的M1型巨噬细胞糖酵解关键分子GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表达明显增加；加入16 μmol·L-1木犀草素处理后，GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表达明显降低。与M1组相比，糖酵解阻断剂2DG处理组和木犀草素联合2DG组GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表达也明显降低(Fig 2)。
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| Fig 2 The mRNA expression levels of genes related to glycolysis in each group(x±s, n=3) A: The mRNA expression level of GLUT1;B: The mRNA expression level of HK2;C: The mRNA expression level of PFK1;D: The mRNA expression level of PK. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group. |
同M0组比较，M1组巨噬细胞葡萄糖消耗减少，乳酸分泌量增加；给予木犀草素干预后，M1型巨噬细胞葡萄糖消耗增加，乳酸分泌量减少，差异有统计学意义。同M1组相比，单独使用糖酵解阻断剂2DG组以及木犀草素联合2DG组M1型巨噬细胞葡萄糖消耗增加、乳酸分泌量也减少(Fig 3)。
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| Fig 3 Result of glucose consumption and lactic acid test in each group (x±s, n=3) A: Level of glucose consumption; B: Level of lactic acid. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group. |
与M0组比较，M1组细胞高表达M1表型标记物iNOS蛋白。而木犀草素治疗组、糖酵解阻断剂2DG处理组和木犀草素联合2DG组iNOS蛋白的表达水平均降低；M2表型标记物Arg-1蛋白的表达水平均增高(Fig 4)。
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| Fig 4 The protein expression of macrophage polarization markers in each group(x±s, n=3) A: The protein expression of iNOS, and the histogram is protein quantification normalized to GAPDH; B: The protein expression of Arg-1, and the histogram is protein quantification normalized to GAPDH. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group. |
流式细胞仪检测数据分析显示，与M0组比较，M1组细胞M1表型标记物CD86比例增加，而M2型标记物CD206比例无明显差异。与M1组相比，木犀草素治疗组、糖酵解阻断剂2DG处理组和木犀草素联合2DG组CD86的表达水平均降低；而CD206的表达水平均增加(Fig 5，6)。试验结果进一步说明，木犀草素通过抑制糖酵解水平影响M1型巨噬细胞向M2型转化。
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| Fig 5 Proportion of CD86 in each group measured by flow cytometry(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs LPS/IFN-γ group. |
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| Fig 6 Proportion of CD206 in each group measured by flow cytometry(x±s, n=3) #P < 0.05 vs LPS/IFN-γ group. |
为了验证木犀草素是否对M1型巨噬细胞中HIF-1α信号通路产生影响，我们采用Western blot和qRT-PCR检测细胞中HIF-1α蛋白和mRNA的表达。研究结果显示，与M1组相比，木犀草素降低M1型巨噬细胞中HIF-1α蛋白和mRNA表达。与木犀草素治疗组比较，M1组巨噬细胞在单独加入DMOG或者同时加入木犀草素和DMOG的检测结果显示，细胞中HIF-1α蛋白和mRNA表达水平均上调(Fig 7)。研究结果表明，木犀草素可能通过HIF-1α信号分子发挥作用。
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| Fig 7 The protein and mRNA expression of HIF-1α in each group (x±s, n=3) A: The protein expression of HIF-1α, and the histogram is protein quantification normalized to GAPDH; B: The mRNA expression level of HIF-1α.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group; & P < 0.05, & & P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group treated with luteolin. |
为了证实木犀草素通过HIF-1α信号通路影响M1型巨噬细胞糖酵解和极化状态，我们运用HIF-1α稳定剂DMOG干预巨噬细胞后，采用qRT-PCR和ELISA方法检测了木犀草素对糖酵解关键分子和巨噬细胞表型标记物的表达。qRT-PCR检测结果显示，与M1组相比，木犀草素减低M1型巨噬细胞中GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表达。与木犀草素治疗组比较，DMOG单独处理组以及木犀草素和DMOG共培养组GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表达上调(Fig 8)。该结果进一步证明，HIF-1α激活后，木犀草素抑制M1型巨噬细胞糖酵解作用减弱。
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| Fig 8 The expression levels of genes related to glycolysis in each group treated by DMOG(x±s, n=3) A: The mRNA expression level of GLUT1;B: The mRNA expression level of HK2; C: The mRNA expression level of PFK1;D: The mRNA expression level of PK. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group; &&P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group treated with luteolin. |
同时ELISA检测结果也显示，与M1组比较，木犀草素降低巨噬细胞M1型标记物IL-6浓度；增加M2型标记物IL-10浓度。而DMOG处理可拮抗木犀草素这一作用(Fig 9)。该结果也进一步证明HIF-1α激活影响木犀草素调控M1型巨噬细胞向M2型转化。
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| Fig 9 The expression levels of macrophage polarization markers in each group treated by DMOG(x±s, n=3) A: Level of IL-6;B: Level of IL-10. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group; & & P < 0.01 vs LPS/IFN-γ group treated with luteolin. |
木犀草素作为一种天然黄酮类化合物，具有抑制促炎因子表达和体内、体外保护细胞氧化应激损伤等多种药理活性。M1/M2型巨噬细胞比例失衡与动脉粥样硬化等慢性疾病的发生密切相关[14]。然而，木犀草素调控巨噬细胞极化表型的分子机制目前尚不清楚。
本研究结果显示，木犀草素预处理后M1型巨噬细胞中HIF-1α蛋白和mRNA表达下调，同时M1型巨噬细胞糖酵解关键分子GLUT1、HK2、PFK1和PK的mRNA表达下降。单用木犀草素或者联合糖酵解抑制剂2-DG处理均能降低CD86的表达，上调CD206的表达水平。而HIF-1α激活剂DMOG能够拮抗木犀草素上述作用。上述结果提示木犀草素负调控M1型巨噬细胞极化的机制可能与降低细胞中HIF-1α和糖酵解水平相关。
研究发现，巨噬细胞激活后HIF-1α通过GLUT1、HK2、PFK1和PK等基因促进糖酵解的发生；缺失HIF-1α的细胞表现出糖酵解速率及能量产生的降低[15-16]。说明HIF-1α对巨噬细胞具有代谢重编程的作用；除此以外，HIF-1α通过影响巨噬细胞的表型及功能影响相关疾病的发生发展。有研究报道，ω-炔基花生四烯酸通过干扰HIF-1α与糖酵解相关酶基因PKM之间的相互作用调控巨噬细胞向M2型极化来发挥减轻急性心肌损伤作用[17]。缺失巨噬细胞特异性的HIF-1α可减少LDLR-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块形成，其机制与减少巨噬细胞葡萄糖摄取、抑制M1型巨噬细胞生成和炎症相关基因表达相关[18]。以上HIF-1α介导糖酵解途径的研究对于进一步明确木犀草素调控M1型巨噬细胞极化的作用靶点提供了新的思路。
综上所述，本研究证实木犀草素能够减少M1型巨噬细胞中HIF-1α表达、抑制糖酵解和促进巨噬细胞向M2型极化。这些证据为木犀草素抗动脉粥样硬化治疗提供了新的分子机制和靶点。
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