2. 青海省高原医学应用基础重点实验室(青海-犹他高原医学联合重点实验室);
3. 教育部高原医学重点实验室，青海 西宁 810001
2. Qinghai Province Key Lab of Applied Foundation for High Altitude Medicine(Qinghai-Utah Joint Research Lab for High Altitude Medicine);
3. Key Lab for High Altitude Medicine, Ministry of Education, Xining 810001, China
高原肺动脉高压(high altitude pulmonary hypertension，HAPH)是高原地区常见的一种疾病，是由于长期低氧刺激诱发肺血管结构重建，血管阻力增加，肺动脉压持续升高，继而引起右心室结构和功能改变的一种慢性疾病，严重者会导致右心衰或肺水肿而危及生命。由于机制不清，HAPH的有效治疗仍是当前医学难题，寻找有效的药物作用靶点和挖掘中藏药潜在的药效价值是当前研究的主要方向之一。
中藏药所具有的机体调理作用、多靶点作用和副作用小等特点，在治疗慢性高原病方面独具优势。HAPH病理生理特点是由于肺血管平滑肌细胞增厚，管腔狭窄，血管内阻力增大，使得心脏和血管收缩产生的推动力受阻，其乃为“气滞”现象，“气滞”结果是使血液流动缓慢而不通畅，产生“血瘀”。藏药四味黄芪散中的四味药材主要来源于高寒缺氧地区，具有补气和活血化瘀的药效，该药在前期研究中已发现有比较好的抗低氧效果[1]，但作用机制仍然不清楚。
HAPH主要病理特征是肺动脉平滑肌过度增殖，这也是肺动脉压持续升高，药物效果不佳的关键环节。细胞的自噬活动具有修复受损细胞的能力，在一定程度上具有保护组织的作用，而低氧在造成细胞损伤的同时也会促进自噬活动的增强，而自噬活动的增强又可抑制平滑肌细胞的增殖，从而减缓低氧性肺动脉压的升高[2]，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)自噬信号通路，是能量代谢的“调节器”，一方面其可促进ATP生成，另一方面抑制组织对ATP的消耗。AMP/ATP比值升高可激活AMPK信号通路，而缺氧会引起AMP/ATP比值升高。因此，本文通过藏药四味黄芪散对AMPK诱导的自噬信号通路相关蛋白水平的影响，探讨该信号通路是否参与低氧下肺动脉高压的形成机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物和分组动物由西安交通大学动物中心提供(SCXK(陕)2017-003)，该研究获得青海大学医学院动物实验伦理委员会批准。110只SPF级别SD大鼠(160~200) g，均为雄性，随机分成低氧对照组(50只)和低氧药物组(50只)，两组又根据暴露低氧时间分别细分为5个小组，即低氧1 d组、低氧3 d组、低氧7 d组、低氧15 d组和低氧30 d组，每小组10只大鼠，放置于模拟海拔5 000 m低压氧舱，另有10只作为常氧对照组(西宁地区，海拔2 260 m)。
1.1.2 仪器与试剂青海大学低压氧舱DYC-3000(中航风雷)，MP150用生理信号采集系统(美国Biopac)；Bio-Rad垂直电泳仪(美国伯乐公司)；Tecnai Spirit Bio TWIN FEI投射电子显微镜(美国FEI公司)；LEICA EM UC7超薄切片机(德国徕卡公司)；p-AMPK(EPR3051(ab92701，Abcam公司)；ULK-1(ab240916，abcam公司)；LC3重组抗体(EPR18709)。辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216，碧云天生物技术公司)和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(A0208，碧云天生物技术公司)。
1.2 方法 1.2.1 动物模型构建将100只SD大鼠置于低压氧舱内，以2 m·s-1的速度升至模拟海拔5 000 m，舱内温度(22±2) ℃，湿度50%~60%，采用慢性低压低氧来模拟高原低氧环境(暴露低氧≤7 d为急性低氧，>7 d为慢性低氧暴露)，大鼠自由取食水。
1.2.2 药物及给药方法藏药四味黄芪散水提液以备用。藏黄芪(内蒙古)，川芎(四川)，沉香(甘肃)，藏红花(伊朗)四味药，多用于治疗脑中风等疾病，按临床已明确的方剂量比例(40 g : 20 g : 20 g : 1 g)称重，再按物料比1 : 12的比例加入水，用旋转仪蒸煮，每次2 h，共3次，提取液浓缩至终浓度为0.84 kg·L-1。根据2015版中国药典对复方中各饮片中活性成分进行含量测定，其中黄芪中黄芪甲苷含量为0.11%，川芎中阿魏酸含量为0.15%、沉香中沉香四醇含量为0.14%，西红花苷中西红花苷Ⅰ、Ⅱ含量分别为8.5%、3.1%。低氧药物组给予藏药四味黄芪散水剂灌胃(根据人和大鼠等效剂量换算，大鼠药量为0.42 g/100 g体重)，每天1次；低氧对照组用0.9%生理盐水灌胃。
1.2.3 肺动脉压(Ppa)和左右心室比重测定(RV/(LV+S))将大鼠给予25%乌拉坦(125 mg/100 g)麻醉，麻醉平稳后，仰卧位固定，分离出右侧颈外静脉，用肝素化的弯头聚次亚乙烯管(内径0.28 mm)沿颈外静脉向向心端插入，通过显示器观察压力波形变化，出现典型的肺动脉压力波形后，固定好导管，用16导生理信号采集系统(MP150，美国Biopac公司)进行肺动脉压进行测定，保存和分析；取出心脏，剪去左右心房组织，确定好右心室，沿右心室壁与心间隔连接处剪下整个右心室壁，采用电子秤对大鼠右心室质量和左心室+室间隔质量进行测定，求出比值。
1.2.4 免疫印迹法取适量冰冻肺组织，用适量裂解液处理至完全裂解，离心机离心，取上清液，用BCA试剂进行蛋白定量，根据标准曲线蛋白浓度符合要求后，进行蛋白质电泳(120 V电压)、转移、显影等一系列处理之后，封闭并加已稀释p-AMPK，ULK-1和LC3单克隆抗体(1 : 1 000~3 000)，置于4 ℃环境16 h过夜，次日加羊抗兔二抗(1 : 10 000)于室温下进行摇床孵育1 h，然后洗膜3次，加ECL发光试剂，再在光化学发光成像仪曝光、拍照。用ImageJ软件进行灰度值分析。
1.2.5 光镜观察将固定于4%多聚甲醛溶液中的肺组织取出，通过梯度浓度酒精脱水、二甲苯浸透、浸蜡包埋一系列过程，然后再通过切片、粘片、脱蜡、醇化和苏木精、伊红染色，最后在显微镜下观察、拍片；电镜观察：取在2.5%戊二醛固定的1×1 ×3 mm3肺组织，磷酸缓冲液清洗后，用1%锇酸固定，再经过脱水、置换、浸润、树脂聚合包埋、修块，切片。染色，最后在电镜下观察、拍片。
1.2.6 统计学方法应用SPSS 12软件包进行统计学处理，计量资料数据以x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较用q检验。
2 结果 2.1 藏药四味黄芪散对暴露于低压低氧下大鼠肺动脉压的影响低氧对照组大鼠暴露于低压低氧环境后，随暴露低氧时间的延长，肺动脉压力逐渐升高，特别是于暴露低氧d 7出现明显的变化(28.5±7.25) mmHg，于低氧30 d，肺动脉压升高更加明显，达到(34.8±4.30) mmHg(P < 0.01)。药物对照组大鼠暴露于低氧后，肺动脉压也会随暴露低氧时间的延长而升高，但与低氧对照组相比，其升高速率明显减缓(P < 0.05)，于低氧15 d，出现肺动脉压的改变(24.2±2.68) mmHg，低氧30 d后其平均肺动脉压为(26.2±3.03) mmHg，明显低于同期低氧对照组大鼠水平(Fig 1，2)。
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| Fig 1 Pulmonary artery pressure curves of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group exposed to hypoxic at different time points |
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| Fig 2 Comparison of mean pulmonary artery pressure of rats between hypoxic control group and hypoxia drug group at different time points of exposure to hypoxia *P < 0.05 vs Hypoxic control group |
低氧对照组大鼠左右心室比值变化趋势同肺动脉压变化，即随暴露低氧时间延长，左右心室比值逐渐升高，暴露低氧d 7为(0.41±0.05)，与暴露低氧d 1的0.24±0.03相比，变化最为明显(P < 0.05)，随后增加相对比较缓慢，至低氧30 d，其比值为0.45±0.04。而药物组暴露低氧d 7，其左右心室比值为0.31±0.04，而暴露低氧30 d，其比值为0.38±0.03，即其右心室肥厚程度明显低于低氧对照组(P < 0.05)
2.3 藏药四味黄芪散对暴露于低压低氧下大鼠肺动脉壁结构的影响与常氧组相比，随着暴露于低压低氧时间的延长，低氧对照组和低氧药物组大鼠肺动脉壁均有逐渐增厚的趋势，然而药物组大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖明显低于低氧对照组(P < 0.05)(Fig 4A)。
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| Fig 3 Comparison of left and right ventricular mass ratio between hypoxic control group and hypoxic drug group at different time points of exposure to hypoxic *P < 0.05 vs hypoxic control group |
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| Fig 4A Comparison of pulmonary vascular wall thickness between hypoxic drug group and hypoxic control group at different time points of exposure to hypoxia *P < 0.01, **P < 0.001 vs hypoxic control group. |
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| Fig 4B Comparison of type Ⅱ cell substructure changes in lung tissues of rats in different groups at different time points of hypoxic exposure(×12 000) |
电镜观察发现随着暴露低氧时间的延长，低氧对照组大鼠肺组织细胞线粒体出现肿胀、溶解、嵴断裂和脱颗粒现象，也可见肺泡Ⅱ型细胞板层结构呈现空泡样状，于低氧d 3、7、15最为明显。然而，低氧药物组大鼠肺组织细胞亚结构损伤相对减轻。
2.4 藏药四味黄芪散对暴露于低压低氧下大鼠肺组织AMPK蛋白及其信号通路的影响从Fig 5A和Fig 5B可以看出，暴露低氧3 d和7 d时，低氧对照组大鼠肺组织磷酸化AMPK蛋白水平明显升高，而在暴露低氧d 15、30时，该蛋白表达水平逐渐降低。相比于低氧对照组，低氧药物组大鼠肺组织磷酸化AMPK蛋白表达在整个低氧暴露期均呈现更高的水平，随着暴露低氧时间的延长，其磷酸化AMPK蛋白虽有降低的趋势，但仍比低氧对照组高。同样，Fig 5A和Fig 5C显示，无论低氧对照组或是低氧药物组ULK-1蛋白水平呈现表达增加的现象，并随暴露低氧时间的延长而进一步增加，低氧30 d后突然降低，但低氧药物组仍高于低氧对照组。Fig 5A和Fig 5D显示，自噬蛋白LC3Ⅱ表达水平随暴露低氧时间的延长而增加，尤以药物干预组增加更为明显。
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| Fig 5A Changes of p-AMPK, ULK-1 and LC3Ⅱ protein level in lung tissues of rats in different groups under hypoxic C: Normoxic control group; D: Hypoxic control group; S: Hypoxic drug group; 1, 7, 15 and 30:respectively represent the 1st day, 7th day, 15th day and 30th day of exposure to hypoxic |
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| Fig 5B Comparison of p-AMPK/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group C: Normoxic control group; D: Hypoxic control group; S: Hypoxic drug group; 1, 7, 15 and 30:respectively represent the 1st day, 7th day, 15th day and 30th day of exposure to hypoxic; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Hypoxic control group |
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| Fig 5C Comparison of ULK-1/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group C: Normoxic control group; D: Hypoxic control group; S: Hypoxic drug group; 1, 7, 15 and 30:respectively represent the 1st day, 7th day, 15th day and 30th day of exposure to hypoxic; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Hypoxic control group |
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| Fig 5D Comparison of LC3Ⅱ/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxia drug group C: Normoxic control group; D: Hypoxic control group; S: Hypoxic drug group; 1, 7, 15 and 30:respectively represent the 1st day, 7th day, 15th day and 30th day of exposure to hypoxic; *P < 0.05, **P < 0.001 vs Hypoxic control group |
另外，对电镜下自噬小体的观察，无论是低氧对照组还是低氧药物组，其共同点就是暴露低氧d 1，均观察不到自噬小体，但从d 3起，两组均出现自噬小体，并且以急性低氧期为明显。不同点是，随着暴露低氧时间的延长，低氧对照组自噬体减少，而低氧药物组自噬体仍然维持在较高的数量，见Fig 5E。
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| Fig 5E Observation and comparison of autophagy corpuscles in lung tissues of rats exposed to hypoxic at different time points(×6 000) |
高原低氧环境对肺组织的影响是十分复杂的，特别是自噬活动对肺组织细胞的影响存在两面性：损伤(或增殖)和修复(抑制)。两者之间的转换机制并不十分清楚，但自噬活动最初的目的就是对已经损伤的细胞进行修复，而对于无法修复的细胞通过过度激活的自噬活动将进一步触发凋亡程序[3]。另一方面，自噬活动可具有抑制干细胞增殖[4]和平滑肌细胞增殖[5]的作用。本研究的生理、形态学结果显示，藏药四味黄芪散能够明显缓解低氧引起的大鼠肺动脉压升高及右心室肥厚，尤其减缓了血管平滑肌层的厚度。这种作用机制是否与自噬活动有关？通过对AMPK自噬信号通路各蛋白测定，发现无论是低氧或是药物均能增强自噬活动，而且与暴露低氧时间密切相关。虽然，低氧会促进AMPK蛋白的上调[6-7]，但本研究结果发现，急性低氧期磷酸化AMPK蛋白水平增加十分明显，但在慢性低氧期，其水平略有降低趋势，其原因可能与急性低氧损伤启动了以自噬等修复功能为主的代偿反应，随着慢性低氧对机体损伤的减弱，其自噬活动也出现相应的改变，也或许出现了自噬活动的“钝化”现象。而四味黄芪散可以进一步上调磷酸化AMPK蛋白的表达，能够保持AMPK在一定水平以维持其适宜的自噬活动，有助于对细胞损伤的修复和平滑肌细胞增殖的抑制，该药的抗慢性低氧效果要比抗急性低氧的效果明显。同样，对AMPK自噬信号通路中的下游蛋白ULK-1和自噬蛋白LC3I和LC3Ⅱ水平进行分析发现，无论是低氧对照组或是药物干预组，ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表达水平均随暴露低氧时间的延长而增加，低氧药物组肺组织中的ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表达水平在低氧初期虽高于常氧对照组，但仍低于低氧对照组。然而，随着暴露低氧的延长，特别是在低氧15 d以后，四味黄芪散上调ULK-1和LC3Ⅱ的作用明显提高。急性期ULK-1和LC3Ⅱ蛋白增高，表明组织受急性低氧损伤的同时，自噬修复能力也增强。但自噬活动不是越强越好，过度自噬会触发凋亡程序[8-9]，甚至加重细胞的死亡[10-11]。因此，急性低氧期，四味黄芪散能够适当降低其自噬水平，可能与其防止平滑肌细胞自噬的过度活动有关，而慢性低氧下，低氧诱导的自噬活动逐渐减弱，但平滑肌细胞增殖逐渐增强，其时药物能够增强自噬活动发挥预防肺动脉平滑肌的过度增殖，该药物所具有的的两面性可能与其所特有的调理作用有关。研究的结果还表明，急、慢性低氧下磷酸化AMPK、ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表达水平并非完全一致，可能与该信号通路的调节复杂性有关，如mTOR蛋白水平，一种抗凋亡因子，因为ULK-1蛋白可以被mTOR蛋白所抑制[12-13]。另外，自噬活动并非AMPK-ULK-1这一条途径调控，还受其他自噬信号通路或自噬蛋白、抗凋亡蛋白的调节，如Becline-1、Bcl-2等。有研究认为磷酸化AMPK和总AMPK蛋白对下游蛋白皆有调节，只是调节的程度存在差异[14-15]，甚至有研究[16]认为，药物激活AMPK不仅仅使ɑ亚基的磷酸化，也可以使AMPK复合物全部被激活的可能，这些因素也导致磷酸化AMPK水平与其下有游蛋白存在不一致。当然，大量的研究发现，自噬活动与平滑肌细胞的增殖活动仍然存在矛盾的地方，而本研究所表现出药物对自噬活动的干预能否阐明低氧下肺血管重构有关？仍值得关注。
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