2. 常州大学生物医学工程与健康科学研究院，江苏 常州 213164
2. Institute of Biomedical Engineering and Health Sciences, Changzhou University, Changzhou Jiangsu 213164, China
原发性肝细胞癌(hepatic cell carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都非常高。HCC的发病是由多种因素及多个步骤共同演变而来的繁杂过程，同时也受到内外环境的双重影响，但其病因及确切的分子机制尚未清楚[1]。临床上常采用手术切除、化疗、放疗等手段进行肿瘤治疗，但由于耐药和不良反应，大部分HCC治疗药物效果不佳，因此，寻找更有效的抗HCC药物迫在眉睫[2]。
丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA, Tan ⅡA)是中草药丹参的主要有效活性成分之一，具有多方面的药理活性，如Tan ⅡA对多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒性作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖活力，诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制细胞内相关DNA合成、阻滞细胞周期过渡、激活凋亡基因以及上调原癌基因的表达水平等有关[3-4]。近年来[5-6]，丹参酮调控线粒体功能也屡有报道，认为丹参酮ⅡA可引起细胞线粒体膜透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)开放，释放大量活性氧，降低跨膜电位，从而诱导细胞凋亡。
MPTP是与线粒体凋亡途径有关的重要结构，由线粒体外膜的电压依从性阴离子通道、内膜的腺苷酸转运蛋白以及转位分子蛋白(translocator protein, TSPO)等共同构成[7]。TSPO调节离子通道的开放，在线粒体凋亡过程中起着关键作用[8]。但目前有关转位蛋白TSPO及线粒体途径在Tan ⅡA诱导肝癌细胞凋亡中的研究较少，本实验选用人肝癌细胞HepG2作为实验对象，观察Tan ⅡA对肿瘤细胞HepG2的作用及相关线粒体凋亡途径的调控，探讨其可能存在的作用机制，为肝癌的预防和治疗提供新的分子靶标和实验支持，为未来临床应用提供理论依据和新思路。
1 材料与方法 1.1 材料人肝癌细胞HepG2(中国科学院上海细胞库)；Tan ⅡA(质量分数≥ 98%)(中国药品生物制品检定所，批号110766-200619)；DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司，货号12100046、25200-056)；新生牛血清(杭州四季青，货号22011-8612/22011-8615)；荧光素酶-ATP检测试剂盒(南通碧云天，货号S0026)；JC-1试剂盒(美国BD公司，货号551302)；Annexin V PE/7-氨基-放线菌素D细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号CA1030)；噻唑蓝MTT(美国Amresco公司，货号0793)；兔抗TSPO多克隆抗体(美国CST公司，货号70358S)；兔抗线粒体内细胞色素C(mitochondrial cytochrome C, Cyto C)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, caspase-3)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9, caspase-9)多克隆抗体(美国Abcam公司，货号ab133504、ab32351、ab32539)；鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，货号sc-47724)；超敏显影液ECL(美国Millipore公司，货号WBKlS0100)。其余未注明试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器超净台(苏州净化设备总厂)；CO2细胞培养箱(上海Heal Force公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；超纯水机(成都超纯科技有限公司)；电子分析天平(德国赛多利斯公司)；酶标仪、电泳仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(南京麦高德生物科技公司)；冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司)；荧光显微镜(德国Carl Zeiss公司)；超声波粉碎机(新芝生物科技公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。
1.3 方法 1.3.1 细胞培养及药物处理将HepG2细胞培养于含10%新生牛血清、1×105 U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的高糖DMEM中，然后置于含5% CO2和95%空气的培养箱中，待单层细胞生长至80%后传代。实验用细胞均处于指数生长期。
1.3.2 MTT比色法检测细胞存活率将细胞按5×107 L-1密度接种于96孔板中，加入不同浓度的Tan ⅡA，使其终浓度分别为2.5、5、10 μmol·L-1，对照组中加入相应体积的溶剂。
药物处理结束后，在每孔中加入MTT(终浓度为0.5 g·L-1)，37 ℃下反应4 h，弃去培养液，在每孔加入100 μL DMSO，待完全溶解后，于490 nm处测定各孔吸光度。按公式：细胞增殖抑制率/%=(1-处理组OD值/对照组OD值)×100%，计算抑制率。
1.3.3 细胞形态学检测用终浓度为2.5、5、10 μmol·L-1的Tan ⅡA处理HepG2细胞24 h后，将培养皿置于普通光学倒置显微镜下，记录细胞形态和变化并拍照。
1.3.4 细胞凋亡检测药物作用24 h后，加入Hoechst 33342染色液于室温下反应5 min，用荧光酶标仪检测荧光强度，在倒置显微镜下观察细胞的核变化，并计算细胞核凋亡小体的数量。
同时，将细胞离心重悬于100 μL的缓冲液中，分别加入5 μL Annexin-V-PE和7-氨基-放线菌素D荧光染料，避光孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.3.5 荧光素酶发光法检测ATP的生成加入ATP裂解液进行细胞裂解，收集细胞裂解液，置于冷冻离心机中离心10 min，取上清液，加入100 μL/孔的ATP检测试剂，常温下反应2~3 min后放于化学发光酶标仪上检测细胞荧光强度，同时测定各组ATP浓度和蛋白含量，计算每毫克蛋白中ATP的量。
1.3.6 Clark氧电极法检测细胞耗氧率将细胞悬液收集于离心管中，在37 ℃记录每组细胞的耗氧率[nmol · (min · mL)-1]的变化。根据各组细胞耗氧率和细胞密度分别计算细胞耗氧率[nmol O2 · (min · 104细胞)-1]。
1.3.7 JC-1染色检测线粒体膜电位以每孔4×103个密度将细胞接种于24孔培养板中，药物处理24 h结束后，加入2.5 mg·L-1的JC-1染色工作液，37 ℃负载探针40 min，PBS洗涤2次后，倒置荧光显微镜观察并拍照，同时用荧光酶标仪检测和记录线粒膜电位的变化。
1.3.8 细胞内TSPO的表达定位检测将HepG2细胞接种于放置玻璃片的培养皿中，用冰甲醇固定细胞，0.3% Triton X-100透化，羊血清封闭半小时后，滴加抗TSPO抗体(1 ∶300)，4 ℃摇床反应过夜；后加入Cy3标记的二抗(1 ∶600)常温下避光反应1 h，加入Hoechst 33258染液于室温下染色10 min，置荧光显微镜下观察。
1.3.9 细胞TSPO、Cyto C、caspase-3、caspase-9蛋白的表达检测HepG2细胞经不同浓度Tan ⅡA处理24 h后，收集细胞，提取总蛋白并测定蛋白浓度。各组按比例以30 μg总蛋白上样，电泳分离后转膜，脱脂奶粉封闭后加入TSPO(1 ∶1 000)、Cyto C(1 ∶1 000)、caspase-3(1 ∶1 000)、caspase-9(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶7 000)抗体，于4 ℃反应过夜。PBS洗涤后，将膜和对应的二抗(1 ∶5 000)在常温下孵育1 h，洗涤后加入显影剂并在凝胶成像系统下进行拍照，以Image J软件分析各条带灰度值。以GAPDH条带灰度值作参照，进行半定量分析。
1.3.10 统计学处理数据均以x±s表示，应用SPSS 16.0统计软件进行分析，多组间均数采用单因素方差分析，两组间比较用Bonferroni检验法。
2 结果 2.1 Tan ⅡA对HepG2细胞形态及增殖的影响如Fig 1A所示，对照组中HepG2细胞形态完整且饱满，2.5 μmol·L-1的Tan ⅡA处理24 h后，HepG2细胞数量减少，并开始出现死亡；而10 μmol·L-1 Tan ⅡA处理过的HepG2细胞形态发生明显变化，细胞胞体皱缩成圆形，细胞数量明显减少。
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| Fig 1 Treatment with Tan ⅡA induced cell death and morphological changes of HepG2 cells(n=5) A: Representative micrographs showed that HepG2 cells exhibited decreased cellular processes and cell viability after the treatment with Tan ⅡA for 24 h. Scale Bar = 20 μm; B: After the treatment with Tan ⅡA for 12 h, 24 h, 48 h, the viability of HepG2 cells was significantly reduced, *P < 0.05, **P < 0.01 vs control Group. |
以终浓度为2.5、5、10 μmol·L-1的Tan ⅡA作用于HepG2细胞12 h、24 h和48 h后，如Fig 1B所示，2.5 μmol·L-1的Tan ⅡA即能引起细胞损伤，10 μmol·L-1的Tan ⅡA抑制率达到70.26%，说明Tan ⅡA可抑制HepG2细胞的增殖，并且具有时间-浓度梯度依赖性。经计算，不同浓度的Tan ⅡA作用HepG2细胞24 h，引起细胞损伤的的IC50为(5.8±1.83) μmol·L-1。
2.2 Tan ⅡA对HepG2细胞凋亡的影响Hoechst 33342是一种常用于检测细胞凋亡的荧光染料。细胞膜在正常情况下常保持完整性，荧光染料极少能透过细胞膜，因此只能产生微弱的蓝色荧光；而当细胞发生凋亡时，细胞膜的通透性会随之增强，从而进入膜内里的荧光染料逐渐增多，因此凋亡细胞的荧光强度要比正常细胞明显。如Fig 2A所示，不同浓度的Tan ⅡA处理细胞24 h后，对照组中的HepG2细胞核凋亡小体较少，呈现出相对较弱的蓝色荧光，5 μmol·L-1的Tan ⅡA导致HepG2细胞的胞核皱缩碎裂，出现较多凋亡小体，蓝色荧光加强；而10 μmol·L-1的Tan ⅡA则导致大量细胞出现凋亡，蓝色荧光进一步增强。
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| Fig 2 Tan ⅡA induced cell apoptosis in HepG2 cells(n=4) After the treatment with Tan ⅡA for 24 h, the HepG2 cell apoptosis was determined by Hoechst 33342 staining and flow cytometry. A: Representative micrographs showing cell apoptosis in HepG2 cells. Scale bar = 20 μm; B: The increased ratio of condensed nuclei of the cells; C: Representative flow cytometry dot plots showing the induction of cell apoptosis in the Tan ⅡA-treated cells after labelling with annexin V-PE and 7-amino-actinomycin D; D: The quantification of apoptotic ratio determined by flow cytometry. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
以Tan ⅡA处理HepG2细胞24 h后，将细胞以Annexin V PE/7-氨基放线菌染色，经流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果如Fig 2C所示，对照组细胞凋亡率为(0.88±0.83)%，终浓度为2.5、5、10 μmol·L-1的Tan ⅡA处理后，细胞凋亡率分别为(5.34±2.38)%、(20.85±5.40)%和(47.04±3.11)%，表明Tan ⅡA可诱导HepG2细胞凋亡，且呈浓度依赖性。
2.3 Tan ⅡA对HepG2细胞ATP含量及耗氧率的影响荧光素-荧光素酶法检测细胞中ATP的含量，结果如Fig 3A所示，与对照组相比，2.5~10 μmol·L-1浓度Tan ⅡA能明显降低HepG2细胞中的ATP水平；用Clark氧电极检测各组HepG2细胞的耗氧率。结果如Fig 3B所示，与空白对照组相比，Tan ⅡA(5~10 μmol·L-1)作用于HepG2细胞24 h后，细胞耗氧率明显降低，且随着Tan ⅡA浓度的增加，HepG2细胞耗氧率不断降低。
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| Fig 3 Tan ⅡA inhibited ATP production and decreased oxygen consumption rate in HepG2 cells(n=5) After challenge with Tan ⅡA for 24 h, the intracellular ATP levels and oxygen consumption rate of the cells were determined. A: Tan ⅡA reduced ATP production in a concentration-dependent manner; B: The decreased oxygen consumption rate of the cells after Tan ⅡA treatment. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
JC-1染色法检测结果如Fig 4所示，对照组JC-1呈聚合体形式存在于细胞中，表明细胞的线粒体膜电位比较高。当不同终浓度的Tan ⅡA作用于HepG2细胞后，图中JC-1的红色荧光逐渐减弱，绿色荧光随JC-1的单体增多而逐渐增强，说明细胞线粒体膜电位的降低呈剂量依赖性；从定量结果中分析发现，各浓度Tan ⅡA处理后，细胞中线粒体膜电位也随之下降，尤其10 μmol·L-1的Tan ⅡA处理后线粒体膜电位下降明显。
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| Fig 4 Tan ⅡA decreased mitochondrial membrane potential in HepG2 cells(n=4) After the treatment with Tan ⅡA for 24 h, the mitochondrial membrane potential of the HepG2 cells significantly decreased. The fluorescence intensity ratio (Red/Green) was reduced. Scale bar = 50 μm. **P < 0.01 vs Control group. |
免疫荧光染色可准确检测TSPO在细胞内的表达位置。如Fig 5所示，在正常细胞中，TSPO几乎不表达；2.5~5 μmol ·L-1的Tan ⅡA处理HepG2细胞24 h后，细胞内TSPO出现表达；经10 μmol·L-1的Tan ⅡA处理后，细胞核内TSPO的表达明显增加，表明Tan ⅡA可诱导HepG2细胞TSPO的表达，并且使TSPO进入细胞核内。
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| Fig 5 Tan ⅡA induced nucleic TSPO expression in HepG2 cells HepG2 cells exhibited induced accumulation of TSPO in the nuclei after the treatment with Tan ⅡA for 24 h. Scale bar = 100 μm. |
采用免疫印迹法检测Tan ⅡA对HepG2细胞中TSPO、Cyto C、caspase-3、caspase-9的蛋白表达。如Fig 6所示，与对照组相比，HepG2细胞经不同浓度(2.5~10 μmol·L-1)Tan ⅡA处理后，细胞内TSPO、Cyto C、caspase-3以及caspase-9蛋白的表达水平随Tan ⅡA剂量的增加而明显上调。
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| Fig 6 Tan ⅡA induced expressions of TSPO, Cyto C, caspase-3, caspase-9 in HepG2 cells(n=4) After the challenge with Tan ⅡA in HepG2 cells for 24 h, the expression levels of TSPO, Cytochrome C, caspase-3, caspase-9 were determined by immunoblotting. Tan ⅡA induced the expressions of TSPO, Cytochrome C, caspase-3, caspase-9. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
中药提取物Tan ⅡA是从丹参中提取的脂溶性菲醌类化合物，具有多种药理学作用，如Tan ⅡA可保护肝脏损伤，抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡[9-10]。本研究结果显示，Tan ⅡA(2.5~10 μmol·L-1)对HepG2细胞有增殖抑制作用，并呈时间-剂量依赖性。同时，Tan ⅡA作用于HepG2细胞24 h后，细胞形态缩小，细胞发生核皱缩，流式细胞仪检测也表明Tan ⅡA可诱导细胞出现凋亡性死亡。
细胞凋亡是一种复杂的生化过程，主要经外源性和内源性两种途径发生，外源性途径常由细胞表面的死亡引发，而内源性途径则与线粒体相关。通常认为后者是细胞凋亡主要的途径[11]。线粒体功能障碍引起细胞膜电位下降，继而引发线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)开口，使Cyto C从线粒体释放到胞质中，促使caspase-9原型活化，启动半胱氨酰天冬氨酸酶从而激活下游caspase-3[12]，最终导致核染色质的皱缩，基因组的片段化以及凋亡小体的产生。本实验中，Tan ⅡA(2.5~10 μmol·L-1)作用于HepG2细胞24 h后，凋亡相关蛋白caspase-9与caspase-3的表达均上调，从而促使HepG2细胞发生早期凋亡。
同时，Tan ⅡA作用于HepG2细胞24 h后，胞质中Cyto C表达上调、细胞ATP产生减少、耗氧能力降低，以及线粒体膜电位下降，表明细胞线粒体功能受损。细胞线粒体膜电位是产生ATP的前提[13-14]，也是线粒体维持氧化磷酸化，保持功能正常所必需的。本实验中，随着Tan ⅡA浓度的增加，JC-1染色结果从红色到绿色荧光的转变，表明HepG2细胞膜电位下降，线粒体功能发生障碍，提示Tan ⅡA诱导HepG2细胞凋亡可能为药物抑制了线粒体功能。
TSPO主要定位于线粒体的外膜，是mPTP的主体成分，具有多种生理功能，如参与mPTP的开放、细胞凋亡与增殖调控、甾体生成、免疫应答等，其聚集于细胞核内时可导致线粒体功能障碍[15-16]。研究表明，TSPO的蛋白表达和TSPO mRNA的转录在肝癌、前列腺癌、肾癌和脑癌中显着增加，在结肠癌和肺癌中明显下降[17]；而在小鼠乳腺肿瘤模型实验中，TSPO配体PK-11195可抑制肿瘤细胞的增殖，侵袭和迁移[18]。本实验中，Tan ⅡA抑制HepG2细胞增殖时，TSPO的蛋白表达提高，表明转位蛋白TSPO可能参与Tan ⅡA诱导HepG2细胞凋亡过程。
综上所述，本研究证明了Tan ⅡA可诱导HepG2细胞发生凋亡的同时，提高凋亡相关蛋白Cyto C、caspase-3、caspase-9的表达，减少细胞内ATP含量和细胞耗氧量，诱导线粒体膜电位下降，同时诱导TSPO蛋白表达，表明Tan ⅡA具有潜在的治疗肝脏肿瘤的作用，其作用机制可能与诱导细胞线粒体转位蛋白TSPO及线粒体功能障碍有关。
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