2. 昆明医科大学第一附属医院，云南 昆明 650031
2. First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming Medical University, Kunming 650031, China
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是全球发病率和死亡率最高的慢性病之一[1]。作为一种常见的可预防和治疗的疾病，COPD主要表现为持续的呼吸症状和气流受限，其发病机制复杂且尚未完全阐明，主要病理机制包括氧化应激、蛋白酶失衡、线粒体功能障碍、气道炎症等之间的相互作用[2]。目前，COPD主要的治疗方式为药物治疗、氧疗，以改善患者呼吸困难、咳痰、气喘、胸闷等症状。然而，临床上用于防治COPD的药物均有许多不良反应。目前用于防治COPD的药物仍然十分有限，且尚无有效的治疗方法可以阻止疾病的进展。近年来的研究显示，调控环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)通路在呼吸系统疾病的防治中具有潜在的应用价值。cAMP是普遍存在的第二信使之一，主要在细胞内参与物质代谢的调节，在松弛气道平滑肌细胞、减轻炎症中起着关键作用，提高细胞内cAMP水平有助于缓解哮喘、COPD、特发性肺纤维化等肺部疾病症状[3]。通过激活腺苷酸环化酶(adenylyl cyclases，ACs)或抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)可增加细胞内cAMP浓度，从而改善肺功能障碍，是防治COPD的有效策略。本文主要对细胞内调控cAMP的蛋白酶、调控cAMP通路防治COPD的机制及相关药物进行综述，为基于cAMP通路防治COPD的药物研发提供参考。
1 cAMP概述 1.1 cAMPcAMP首次被发现于1957年，是第一信使作用于靶细胞后产生的信息分子。cAMP在许多生物系统中发挥作用，如激素分泌、糖原分解、平滑肌松弛、心脏收缩以及学习和记忆等。经典的cAMP信号通路是细胞外激动剂与G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)结合并诱导构象变化，Gs蛋白刺激ACs，诱导AC催化腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)生成cAMP，细胞内cAMP的升高会同时诱导蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和cAMP直接激活的交换蛋白(exchange proteins directly activated by cAMP，Epac)，从而发出信号控制下游反应[4]。GPCRs、ACs和PDE动态调节cAMP信号传递。细胞内cAMP的水平受到PDE作用控制，PDE将cAMP降解为5′-腺嘌呤核苷酸(adenosine 5′-monophosphate，5′-AMP)，从而终止其信号传导[5]。此外，A-激酶锚定蛋白(A-kinase anchoring proteins，AKAP)通过形成复合体来维持细胞cAMP的区室化，进而调控特定的细胞反应。早期的研究表明，cAMP升高后，激活PKA和Epac，随后通过不同途径激活效应器，诱导气道平滑肌松弛，抑制气道平滑肌增殖，调节细胞因子的分泌[6]。
1.2 调控cAMP的蛋白酶 1.2.1 PDEsPDEs可以催化水解cAMP和环磷酸鸟苷，如今在哺乳动物中发现了PDEs的11种亚型(PDE1~PDE11)，且具有不同的同工酶，其中主要水解cAMP的是PDE4。PDE4又分为PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D四种亚型，其广泛分布于各种组织，参与炎症调节、微血管通透性和纤维化、血管和气道平滑肌收缩和增殖等生理过程[7]。PDE4与cAMP水平之间的负相关是各种病理生理疾病如气道炎症、COPD、哮喘、银屑病和类风湿性关节炎等的关键机制。在肺部，PDE4主要表达于肺结构细胞，包括平滑肌细胞、气道上皮细胞和炎症细胞，调节并引起气道平滑肌的舒张，参与多种细胞生命活动[8]。
1.2.2 ACs在1989年第一个哺乳动物AC在牛脑中被发现后纯化克隆，随后又发现了9种AC亚型，目前已确定哺乳动物AC共有10个亚型，9个跨膜AC亚型(membrane adenylate cyclase，mAC)和一种可溶型AC(soluble AC，sAC)。sAC作为一个可溶性酶，不同于哺乳动物中其它AC亚型，sAC不受G蛋白的调节，钙和碳酸氢盐的刺激是影响它的主要因素，主要与精子运动和神经元突起的生长有关[9]。
mAC由1个氮端(N-端)、2个跨膜结构域、其通过C1a和C1b区域连接，并在细胞内通过C2a和C2b与碳端(C-端)相连组成，N-端和C-端伸入胞质中，C1和C2是两个具有高度同源性的胞浆区，是AC的催化结构域，影响AC的活性，而N-端的序列和长度在不同的ACs具有明显差异[10]。大多数组织和许多细胞类型都表达不止一种AC亚型，且不同物种间各个亚型的表达也是不一致的。AC1在大脑中高表达，主要影响神经功能，是慢性疼痛的合适的神经元特异性药物靶点。AC8主要在大脑中表达，被认为在学习和记忆中起作用；AC3在嗅觉上皮中含量最丰富，在嗅觉中起作用；而AC5和AC6在心脏中占主导地位，与心脏收缩有关；AC4、AC7、AC9则普遍存在哺乳动物组织中；AC2分布较为广泛，在脑、肺、骨骼肌、心脏均有表达，而在肺中高表达的亚型是AC2、AC6、AC8、AC9[11]。
2 cAMP与COPDcAMP在调节细胞内复杂反应信号传导有巨大作用，通过识别并放大信号，作用于依赖cAMP的酶或蛋白质，调节相应的生理效应。细胞受到外界刺激后，影响AC、PDE酶活性，调节胞内cAMP浓度，从而影响下游PKA、Epac和AKAP，进而影响核因子κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)、cAMP效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的表达，进而增强气道平滑肌舒张，减轻炎症和气道纤维化，因此，调控cAMP通路在防治COPD等慢性呼吸系统疾病中有巨大潜力。
2.1 cAMP与气道平滑肌松弛COPD患者呼吸道表现出明显的气道壁重塑和黏液滞留等气流受限症状，其中气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)异常增生与肥大是COPD气道重塑最显著特征之一。β2-肾上腺素能受体激动剂是治疗COPD气流阻塞的关键药物之一，其支气管松弛效应部分归因于细胞内cAMP的增加，随后cAMP主要效应因子PKA、Epac被激活，参与促进气道平滑肌松弛[12]。Epac通过ERK抑制气道平滑肌表型转换，调节ASMCs的收缩和舒张功能，使Ras同源基因家族成员A与Ras相关C3肉毒素底物(Ras related C3 botulinum toxin substrate，Rac)的平衡向Rac移动从而抑制肌球蛋白轻链磷酸化，最终诱导松弛气道平滑肌[6]。另有研究证实[13]，通过增加气道平滑肌和支气管上皮内cAMP浓度，可协同减少上皮内乙酰胆碱释放，改善支气管症状。最新的研究发现[14]，抑制或下调ATP结合盒亚家族C成员1可明显减少ASMCs中β2受体引发的cAMP释放，从而使胞内cAMP升高，松弛气道平滑肌细胞，从多种途径防止COPD气道平滑肌重构。
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| Fig 1 The signaling pathway of cAMP in treatment of COPD cAMP activates or inhibits multiple downstream effectors, thereby resisting airway remodeling, anti-inflammatory, and bronchiectasis, thus having significance in the prevention and treatment of COPD. Roflumilast, Tanimilast, Ensifentrine, Cilomilast, Tetomilast, GSK256066 are PDE inhibitors. Forskolin, Isoforskolin are AC agonist. GPCRs: G protein-coupled receptors. ATP: adenosine triphosphate. cAMP: cyclic adenosine monophosphate. 5′-AMP: adenosine 5′-monophosphate. ACs: adenylyl cyclases. PDEs: phosphodiesterases. PKA: protein kinase A. Epac: exchange proteins directly activated by cAMP. AKAP: A-kinase anchoring proteins. ERK: extracellular signal-regulated kinase. NF-κB: nuclear factor-kappa B. CREB: cAMP-response element binding protein. TNF-α: tumor necrosis factor. IL-6/8: interleukin-6/8. |
慢性炎症是COPD的核心发病机制，其气道炎症以中性粒细胞、肺泡巨噬细胞和淋巴细胞增多为特征。cAMP的抗炎作用是多样的，调节着广泛的生物过程，其调节作用也因细胞类型而异。
在COPD的炎症发病进程中，中性粒细胞通过释放炎症介质和蛋白酶发挥了作用。Dunne等[15]发现，COPD患者的中性粒细胞异常迁移，对趋化物白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)、趋化因子CXC配体1(chemokine C-X-C motif ligand 1，CXCL1)的迁移活性增加，且发现升高细胞内cAMP浓度可抑制中性粒细胞对CXCL1和LTB4的趋化作用。
肺部主要存在支气管巨噬细胞、间质巨噬细胞和肺泡巨噬细胞，其中肺泡巨噬细胞的作用尤为重要。研究发现，在肺泡巨噬细胞中，经香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)或其他刺激物刺激活化后巨噬细胞释放细胞因子和趋化因子，而cAMP信号可抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和趋化因子C-C配体3(C-C motif chemokine 3，CCL3)等促炎介质的产生，促进IL-10等抗炎细胞因子的产生[16]。
Oldenburger等[17]研究发现，在ASMCs上CSE减弱cAMP信号导致了白介素-8(interleukin-8，IL-8)的释放，而Epac和PKA则分别抑制NF-κB和ERK，减少IL-8的分泌，发挥抗炎作用。
在免疫系统中，cAMP另外一通路则是通过激活下游核转录因子CREB，通过PKA与NF-κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-kappa B，IκB)分子相连形成复合体，引起IκB降解的信号激活PKA催化亚基，进而磷酸化p65分子。磷酸化的CREB可以通过与活化的NF-κB结合，抑制NF-κB与相应基因的结合，抑制基因转录，从而有效控制炎症发生。
2.3 cAMP与上皮间质转化在过去研究中，上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)在COPD发病机制中发挥作用的证据越来越多。香烟烟雾和环境污染物使肺部暴露于过量的氧化剂，特别是活性氧，增加氧化应激负担，诱导EMT，导致COPD的严重恶化，且COPD患者气道、肺上皮细胞、支气管上皮细胞间充质转化显著增加[18]。Zuo等[3]研究表明，cAMP定位于特定的亚细胞微区，调节下游效应蛋白PKA和Epac的活性，AKAP则通过短的α-螺旋结构与PKA结合，调节EMT。最近的证据也表明[19]，在Beas-2b细胞上CSE诱导转化生长因子β释放使EMT进程加重，使Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ，COLⅠ)上调，上皮细胞标志物E-钙黏蛋白下调，而升高cAMP或破坏AKAP-PKA直接的相互作用能够明显减少COLⅠ的上调，影响COPD中的上皮细胞间质转化，进而缓解COPD症状。
3 调控cAMP通路的药物在COPD中的应用研究临床上用于防治COPD的药物主要包括吸入性糖皮质激素、长效β2-肾上腺素受体激动剂和长效M受体拮抗剂，但均有许多不良反应，用于防治COPD的药物仍然十分有限，尚无有效的治疗方法阻止疾病的进展。目前，调控cAMP通路的药物在COPD中的应用研究主要集中在PDE4抑制剂和AC激动剂。
罗氟司特(Roflumilast，RF)作为第2代PDE4抑制剂，其主要抑制PDE4A和PDE4B。RF于2010年被批准上市用于防治COPD急性加重，是临床上目前唯一被批准用于治疗COPD的选择性PDE4抑制剂，可以抑制气道炎症，改善COPD患者的肺功能，减少病情恶化。在体内，其可减轻与COPD相关的关键疾病机制，如烟草烟雾引起的肺部炎症、黏液纤毛功能障碍、肺纤维化和肺气肿重塑、氧化应激、肺血管重塑和肺动脉高压；在体外，RF可影响多种细胞的功能，包括中性粒细胞、单核/巨噬细胞、CD4+和CD8+ T细胞、内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞，这些细胞产生的效应能够减轻病情恶化和改善肺功能，被认为是RF对COPD疾病产生有益影响的原因[20]。
由于口服治疗剂量的RF会导致胃肠道的副作用，如腹泻、恶心、食欲下降、体质量减轻等，更多的PDE抑制剂被研究用于治疗COPD。Tanimilast(国际非专有名称：CHF6001)，是一种新型吸入PDE4抑制剂，目前正在开展Ⅲ期临床试验(ClinicalTrials.gov identifier: NCT04636801)，其对PDE4抑制作用约为RF的10倍，肺部抗炎特性明显。在对广泛PDEs的检测中发现，其对PDE4具有高度选择性。Tanimilast作为三联疗法的补充，用于降低患有慢性支气管炎和有加重病史的COPD患者的加重风险。在体外对巨噬细胞和树突状细胞进行试验时，Tanimilast减少了促炎症细胞因子(TNF-α和IL-6)、趋化因子(CXCL8、CCL3和CXCL10)的释放[21]。
Ensifentrine(国际非专有名称：RPL554)是PDE3和PDE4双重抑制剂，具有强效的舒张气管和抗炎作用，目前处于Ⅲ期临床试验(ClinicalTrials.gov identifier: NCT04535986)[22]。Ensifentrine对PDE3的选择性比PDE4强，PDE3作为气道平滑肌中的主要同工酶，对气道张力有影响。因此，在COPD患者中的早期临床试验集中在吸入Ensifentrine的支气管扩张作用上。
目前仍有多种PDE4抑制剂处于临床试验阶段，主要包括以下：GSK256066(ClinicalTrials.gov identifier: NCT00549679)处于Ⅱ期临床试验，Cilomilast(ClinicalTrials.gov identifier: NCT00103922)处于Ⅲ期临床试验，HPP737(ClinicalTrials.gov identifier: NCT04714294)则还在Ⅰ期临床试验。Tetomilast(ClinicalTrials.gov identifier: NCT00917150)目前正在进行其用于COPD的Ⅱ期试验。
针对AC激动剂用于防治COPD的研究仍处于临床前。其中佛司可林(Forskolin，FSK)是一种典型的AC激动剂，它从印度植物毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)的根部提取的二萜类物质，高度激活除AC9以外的所有膜结合AC亚型，且对肝脏、肺等其他器官有很好的抗纤维化作用[23]，可减轻缺血/再灌注引起的微血管通透性增高和肺毛细血管损伤[24]。FSK具有潜在的抗COPD作用，可以诱导哮喘患者的支气管扩张[11]。而异佛司可林(isoforskolin，ISOF)是云南特有植物毛喉鞘蕊花中提取分离到的二萜类活性成分，化学结构上，FSK和ISOF为同分异构体，两者在C6、C7位上存在乙酰基与羟基位置的差异。研究发现，ISOF可以激活AC 1、2和5，改善COPD模型大鼠的肺通气功能，减轻急性、慢性肺损伤，下调促炎细胞因子并减轻炎症反应，提示ISOF可能是一种潜在的防治COPD的药物[24-25]。
4 结语和展望综上，cAMP是多条通路的中心节点之一，参与COPD的发生发展。激活AC或者抑制PDE均可升高cAMP水平，进而增强气道平滑肌松、减轻炎症反应，拮抗COPD。鉴于AC和PDE均有多种亚型、其在不同组织细胞上的分布不同，cAMP在细胞内存在区室化的调控机制，因此，调控cAMP通路用于COPD的防治也面临挑战。一方面需要进一步研究阐明cAMP信号在不同细胞中区室化的分子机制，另一方面需要寻找选择性的AC亚型激动剂或PDE亚型抑制剂用于防治COPD的新药研发。目前，针对cAMP的防治COPD药物虽已有多种处于临床研究，但仍处于发展阶段，还需要更加深入的探索，为其真正应用于临床提供科学依据。
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