2. 甘肃中医药大学中西医结合学院，甘肃 兰州 730000
2. School of Integrated Traditional Chinese and Western Medcine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China
神经病理性疼痛在普通人群中的发病率为10%左右，其特点是反复、持续发作[1]。迄今，传统的镇痛药物治疗效果很差、副作用大。资料显示，外周神经系统和中枢神经系统的病变都可引发神经病理性疼痛，具体表现为痛觉过敏(hyperalgesia)、痛觉超敏(allodynia) 和自发性疼痛等。神经病理性疼痛不仅严重影响人的生活质量(食欲、睡眠等)，还会增加精神类疾病的发生率。然而，目前，诱发神经病理性疼痛的机制仍不清楚。
脊髓背角作为痛觉信息从外周向中枢传递的初级整合中枢，在神经病理性疼痛的发生发展中具有重要的作用。脊髓背角中的抑制性中间神经元在痛觉传递中发挥“刹车”作用，而抑制性受体介导的抑制性突触传递负责其“刹车”作用[2-3]。外周神经损伤之后，抑制性突触传递减弱；而提高抑制性突触传递，则能够缓解痛敏症状[3-4]，突触可塑性参与了痛觉调控，我们以往的研究表明，抑制小鼠海马组织ChAT活性，提高ChAT活性、升高ChAT蛋白的表达从而促进脑内乙酰胆碱的合成，可能是增强突触可塑性的重要机制之一[5]。Collybistin是一种鸟嘌呤交换因子，与突触可塑性密切相关[6-7]，有文献报道，collybistin表达于抑制性突触传递中，与抑制支架蛋白gephyrin相互作用，稳定抑制性受体在突触后的表达[8-10]。Collybistin可能参与癫痫、焦虑等病理过程的发生、发展[8-9]，但是否参与神经病理性疼痛，仍不清楚。因此，本研究利用免疫组织化学、行为学和电生理等技术，探究collybistin在神经病理性疼痛发生发展中的作用。这一研究极有可能为神经病理性疼痛的预防、治疗提供新的干预靶点。
1 材料和方法 1.1 实验动物SPF级C57BL/6小鼠，♂，6~8周龄，(18~22) g，购买于兰州大学动物中心。每笼饲养3~5只，自由进水、食，控制饲养环境温度(22~26) ℃、相对湿度40%~60%。
1.2 主要试剂shRNA-collybistin和scrambled shRNA购买于上海吉玛制药技术有限公司；抗collybistin抗体(SAB4500963) 和河豚毒素(tetrodotoxin; TTX) 购买于sigma；CNQX和DAP-5购买于爱必信生物科技有限公司；CY3和Alexa Fluor 488标记的荧光二抗以及辣根过氧化物酶标记的二抗均购买于Abcam。
1.3 主要方法 1.3.1 坐骨神经分支损伤(spared nerve injury, SNI)模型的制备手术器械和手术台面消毒完成后，腹腔注射戊巴比妥钠(45~60 mg·kg-1) 麻醉成年小鼠，乙醚辅助麻醉。剪开皮肤、钝性分离肌肉，充分暴露坐骨神经及其分支(胫神经、腓总神经、腓肠神经)；玻璃分针慢慢分离腓肠神经，结扎胫神经和腓总神经，并在离结扎处2 mm的位置将神经剪断；对肌肉和皮肤依次缝合，术后用碘伏进行消毒。对照侧暴露坐骨神经，腓总神经和胫神经不进行结扎手术。确保造模成功后即可进行实验。
1.3.2 行为学测试 1.3.2.1 50%机械缩足阈值(paw withdrawal thresholds, PWTs)检测实验采用“Up-Down”法测试小鼠的机械缩足阈值。测试前将小鼠放置于底部有铁丝网的行为笼中，适应30 min，待小鼠处于安静状态(停止探索行为及梳理毛发)后。用von Frey纤维垂直刺向小鼠足底掌心区域，使其弯曲至30°，单次刺激时间控制在3~5 s，间隔应不少于2 min。观察小鼠的反应，若小鼠出现缩足、舔足或甩腿反应，记为阳性反应；反之，则记为阴性反应。通过以下公式计算50%缩足阈值(PWT): 50% PWT=10[Xf+Kδ]/10 000。xf为最后一个使用的Von Frey纤维的力度值，k值查表可得，δ为0.26。
1.3.2.2 热缩足潜伏期(paw withdrawal latencies; PWLs) 检测实验前将小鼠置于仪器的透明玻璃板上方，适应30 min。测试时，将热刺痛仪上的“十”字形标记置于小鼠后足足底掌心，记录从开始照射到小鼠出现缩足回避的时间，单次测试时间上限为10 s，以免出现组织损伤。重复实验3次，求平均值作为小鼠的PWLs，测量间隔为5 min。测试期间及时清理小鼠在玻璃板上的排泄物，防止其影响实验结果。
1.3.3 鞘内转染首先将小鼠固定在实验台上，使其背部朝上，稳定小鼠脊椎，手持25 μL微量进样器从小鼠L5~L6棘突间隙进针，以空洞感及小鼠甩尾视为针尖到达蛛网膜下腔处。缓慢推注shRNA，待推注完后，针头稍作停留缓慢拔出，防止渗出。
1.3.4 Western blot实验实验小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液(80 mg·kg-1)。待小鼠麻醉后，行椎板切开术，分离L4~L5节段脊髓，转移至预冷的蛋白裂解液裂解30 min。离心(14 000 r·min-1, 4 ℃, 10 min) 后，取上清，加入4×Sample Buffer，振荡混匀、煮沸3 min，冷却上样。蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜。d2, 再用相对应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，ECL化学发光试剂盒显色。最后使用ImageJ软件对图像进行灰度分析。
1.3.5 免疫组织化学染色实验小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液(80 mg·kg-1)。待小鼠麻醉后，暴露心脏，经左心室灌流20 mL含肝素钠生理盐水，10 mL 4%多聚甲醛。分离小鼠脊髓转移4%多聚甲醛中后固定2 h，再移至30%蔗糖溶液脱水过夜。d2, 冰冻切片机(CM1860, Lecia) 切取厚40 μm的脊髓片。脊髓片转移至包含0.25% Triton X-100和10%山羊血清(normal goat serum, NGS) 的PBS中封闭过夜。一抗孵育脊髓片24 h。PBS溶液清洗脊髓片5次，每次20 min。脊髓片与相对应的荧光二抗室温避光孵育2 h。PBS清洗脊髓片切片5次，每次20 min。PVP封片液封片，激光共聚焦显微镜获取图像。
1.3.6 电生理记录实验小鼠麻醉后，行椎板切开术，分离脊髓快速转移至切片液中。剥离脊髓软硬脊膜后，利用震动切片机切取厚400 μm的脊髓片。电生理记录前先将脊髓片置于切片液中室温孵育至少1 h，持续通入95% O2和5% CO2恢复细胞状态。将脊髓片转移至操作台上，持续灌流氧饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)，以维持细胞的活性。在显微镜下挑选健康的II板层外侧神经元，记录微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents, mIPSCs)，记录过程中电压钳制在0 mv。在ACSF中加入10 μmol·L-1 CNQX和50 μmol·L-1 DAP-5、以阻断兴奋性突触传递，加入1 mol·L-1 TTX、以阻断钠通道电流。
1.3.7 统计学分析用统计软件SPSS 23.0分析实验数据，所有的数据用x±s表示。利用Mann-Whitney U test比较两组实验数据之间的差异。利用One-ANOVA检验后，再进行post hoc Bonferroni test检验，比较多组实验数据之间的差异。利用repeated measurement和Bonferroni post hoc tests检验随时间发生的多组数据之间的差异。
2 结果 2.1 Collybistin表达于脊髓神经元中为了观察collybistin在脊髓中的表达情况，我们进行了Western blot实验。Fig 1A显示，抗Collybistin抗体在小鼠脊髓裂解液中发现了明显的信号，说明collybistin分布在脊髓中。利用免疫组织化学染色，分析collybistin是否分布在脊髓神经元中。如Fig 1B所示，神经元标志物NeuN与collybistin共染，表明脊髓神经元中表达collybistin。
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| Fig 1 Collybistin expressed in spinal cord of mice A: Collybistin was detected by anti-collybistin antibody at spinal homogenates of mice; B: Double immunofluorescence for collybistin (green) and neuronal marker NeuN (red). |
为了明确外周神经损伤对脊髓collybistin表达的影响，我们选取成年小鼠，制备坐骨神经分支损伤(spared nerve injury, SNI) 模型，14 d后，进行Western blot。行为学测试结果显示，与假手术组相比，SNI明显降低了小鼠的机械性缩足阈值(Fig 2A)，说明神经病理性疼痛模型成功建立；Western blot结果表明，与生理盐水组相比，SNI明显降低了脊髓中collybistin的蛋白表达(Fig 2B)。
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| Fig 2 The reduced expression of collybistin observed after peripheral nerve injure A: PWTs on day 14 after SNI (x±s, n=6); B: Protein levels of collybistin on day 14 after SNI or sham operation(x±s, n=4). *P < 0.05 vs baseine or saline. |
为了探究collybistin在痛觉调控中的作用，我们首先构建了针对collybistin的shRNA (shRNA-collybistin)，通过抑制内源性collybistin蛋白的表达验证这一实验目的。Western blot实验结果显示，与对照组相比，shRNA-collybistin明显降低了collybistin的蛋白表达，而scrambled shRNA组无明显变化(Fig 3A)。接着我们进行了行为学测试，如Fig 3B和3C显示，与scrambled shRNA组相比，鞘内转染shRNA-collybistin明显降低了小鼠的缩足阈值(paw withdrawal thresholds, PWTs) 和缩足潜伏期(paw withdrawal latencies; PWLs)，表现出机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。
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| Fig 3 Knockdown of collybistin in spinal cord of mice induced pain sensitization(x±s, n=6) A: Collybistin protein levels in spinal cord 3-5 days after intrathecal injection of control shRNA (NC), or scrambled shRNA, or shRNA-collybistin). *P < 0.05 vs Scrambled-shRNA(x±s, n=4); B, C: Intrathecal injection of shRNA-collybistin induced a decrease in the PWTs and PWLs, The arrow indicated the time points of intrathecal gene delivery. *P < 0.05 vs scrambled shRNA. |
Fig 4结果显示，SNI模型小鼠的PWTs和PWLs值明显降低；与GFP组相比，鞘内转染collybistin能够明显提高小鼠的PWTs (Fig 4A) 和PWLs值(Fig 4B)，说明过表达collybistin可缓解外周神经损伤诱发的机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。
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| Fig 4 Spinal overexpression of collybistin attenuated neuropathic pain(x±s, n=6) A, B: The reduction of PWT and paw withdrawal latencies PWL after SNI were rescued by intrathecal injection of collybistin. The arrow indicated the time points of intrathecal gene delivery. *P < 0.05 vs GFP. |
电生理实验结果显示，与基础值相比，collybistin抗体明显降低脊髓背角神经元中的微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic currents，mIPSCs) 的幅值和频率(Fig 5A)，说明collybistin能够维持正常的抑制性突触传递。为了再次验证这一现象，我们在小鼠鞘内转染shRNA-collybistin后，记录mIPSCs。结果显示，与scrambled shRNA组相比，鞘内转染shRNA-collybistin同样明显降低了mIPSCs的幅值和频率(Fig 5B)。
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| Fig 5 Collybistin regulated inhibitory synapse transmission(x±s, n=6) A, B: Intracellular application of anti-collybistin and intrathecal injection of shRNA-collybistin on day 4 post-SNI decreased the amplitudes and frequencies of miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs). The electrophysiological recordings in spinal slices were performed. The graph showed the averaged amplitudes and frequencies of mIPSCs. *P < 0.05 vs beseline of scrambled-shRNA. |
Fig 5表明，collybistin在维持正常的抑制性突触传递中发挥重要作用，那么我们猜测，过表达collybistin可缓解外周神经损伤对抑制性突触传递的减弱作用。Fig 6结果显示，与空白对照组相比，SNI模型组小鼠的mIPSCs的幅值和频率明显降低；与SNI模型组相比，过表达collybistin能够明显提高SNI模型组小鼠mIPSCs的幅值和频率(Fig 6A)。
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| Fig 6 Spinal overexpression of collybistin prevented peripheral nerve injury from decreasing inhibitory synaptic transmission. (x±s, n=6) The collybistin was intrathecally given 3-5 days on day 14 post-SNI. mIPSCs were recorded on 17-19 day after peripheral nerve injury. The graph showed the averaged amplitudes and frequencies of mIPSCs. *P < 0.05 vs Control; #P < 0.05 vs SNI. |
本实验发现，collybistin表达于脊髓神经元中，外周神经损伤可明显降低脊髓collybistin的蛋白表达。结果提示，collybistin可能在痛觉调控中发挥作用。接着，行为学测试观察collybistin对小鼠痛行为学的影响，结果表明，干扰collybistin可诱发正常小鼠的痛觉敏化。最后，全细胞电记录结果表明，collybistin在维持正常小鼠的抑制性突触传递中发挥核心作用。
文献报道，collybistin分布在海马和皮质神经元中，与突触传递以及可塑性密切相关，参与癫痫、焦虑等神经退行性疾病[9, 11]。大量资料已经证明，脊髓背角是传递、整合痛觉信息的初级中枢[12]。我们的研究显示，collybistin大量表达在脊髓神经元中；神经病理性疼痛小鼠脊髓中collybistin的蛋白表达明显降低。这一结果提示，collybistin可能参与痛觉突触传递。然而，collybistin在脊髓中分布的细胞类型以及是否在外周神经系统中表达，还需要进一步的探究。
在成年哺乳动物脊髓中，抑制性突触传递能够门控外周伤害性信息向脑区的传递[2, 3, 13]。鞘内给予化学抑制剂阻断抑制性受体、或利用基因技术沉默受体，都可诱发正常小鼠的痛觉中枢敏化[3, 14]。最近的研究表明，collybistin可与抑制性突触支架蛋白gephyrin相互结合，维持抑制性受体在突触的聚集。结果显示，鞘内转染shRNA-collybistin，诱发正常小鼠的痛觉过敏和痛觉超敏。同时，我们利用collybistin的特异性抗体、或shRNA-collybistin拮抗细胞内collybistin功能之后，发现脊髓背角神经元中的抑制性突触传递明显降低。有研究表明，collybistin还可能通过与GABAAR α2亚基和甘氨酸受体α1亚基的相互作用，增加抑制性受体的突触表达[9-10]。
当小鼠发生外周神经损伤之后，GABAAR和甘氨酸受体介导的抑制性功能受损，表现出痛觉敏化[4, 15]。然而，增强抑制性突触传递能够缓解小鼠的痛敏症状[3]。我们发现，脊髓过表达collybistin，可明显缓解外周神经损伤诱发的痛觉敏化。此外，还能恢复外周神经损伤导致的“去抑制”。
综上所述，本研究揭示了collybistin在痛觉调控中的作用，为阐明神经病理性疼痛的发病机制提供相应依据，这一研究为神经病理性疼痛的治疗提供新的思路。
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