2. 深圳职业技术学院医护学院，广东 深圳 518055
2. Dept of Medical College, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China
过敏性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)是由半抗原特异性T细胞依赖性反应介导的皮肤或粘膜接触某些外部刺激物或过敏原时发生的炎症反应[1-2]。当机体受到半抗原攻击后，主要表现为炎性细胞浸润和炎性因子的释放，临床症状主要是致敏皮肤周围出现红斑、糜烂、结痂、水肿、瘙痒等[3-5]。ACD反应中的T细胞在移植排斥反应、移植物抗宿主病、自身免疫和肿瘤免疫中起着关键作用。因此，研究对ACD的诱导和调控作用对于寻找新药和阐明作用机制具有重要意义。
良好的实验动物模型有助于人们更方便和更有效地了解人类疾病的发生及发展规律并有利于研究其预防措施。2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)诱导的ACD模型是炎症或慢性瘙痒研究中最常用的动物模型之一[6-7]。一个好的动物模型必须具有可准确复制且与临床发病机制相似的特点，这对疾病的发病机制和疗效的研究具有关键作用。DNFB是一种半抗原，当与机体首次接触后激活皮肤角质形成细胞并产生细胞因子。而细胞因子与抗原呈递细胞结合，转移至局部淋巴结，激活抗原特异性的T细胞，使其产生记忆T细胞，该过程为敏化过程。在致敏4~7 d后，机体再次接触半抗原DNFB后补充和激活记忆T细胞，通过辅助T细胞1(Th 1)和辅助T细胞2(Th 2)产生细胞因子，诱发局部接触性过敏反应[8]。该反应一般在接触半抗原后约18 h发生，并在24~48 h内达到高峰。有文章应用2周ACD模型研究Toll样受体在慢性瘙痒症中的作用，而也有文章通过使用5周ACD模型研究通过BRAF信号通路影响感觉神经元慢性瘙痒的发展[9]。所以有些研究人员考虑到2周的建模周期是否太短而无法产生明显的症状和炎症变化。为了在实际的实验操作中明确和选择更适合的动物模型而进行深步研究，本研究构建并评价了DNFB致小鼠ACD反应的不同建模方法。
1 材料与方法 1.1 实验动物及饲养雄性SPF级C57 BL/6小鼠，体质量约(25±2)g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，生产许可证号：(苏)2016-0010，SCXK。饲养和实验期间自由进食和饮水，环境温度(20~25)℃，相对湿度40%~60%。本研究中描述的所有实验方案均遵循安徽医科大学动物护理委员会《实验动物护理和使用指南》中概述的方案，符合美国国立卫生研究院ARRIVE实验动物护理和使用指南的指导方针。
1.2 主要药品试剂及仪器2，4-二硝基氟苯：购自Sigma，BCCB1276。丙酮：合肥欣乐有限公司，190131。橄榄油：上海阿拉丁，K1922143。多聚甲醛：上海阿拉丁，HJ201403。生理盐水：山东齐鲁药业有限公司，2B20012105。小鼠(Mouse)免疫球蛋白E(Ig E)ELISA试剂盒：南京建成生物工程研究所，210821M。相机和三脚架：日本尼康。ASP-300型自动脱水机：德国莱卡。HistoCoreArcadia组织包埋机：德国莱卡。RM2255全自动轮转石蜡切片机：德国莱卡。DHG - 9070型电热恒温鼓风干燥箱：上海三科学仪器有限公司。Pannoramic MIDI智能组织切片成像分析系统：3D HISTECH。
1.3 2周过敏性接触性皮炎模型的构建与分组DNFB溶解在丙酮：橄榄油(4 ∶1)的混合溶液中；雄性C57 BL/6小鼠随机分为生理盐水对照、溶媒组(丙酮：橄榄油)和DNFB模型组，每组6只。适应性喂养1周后，剔除小鼠颈背部和腹部的毛发，剃毛面积约为2 cm × 2 cm。适应2 d后，将0.5% DNFB-丙酮混合液50 μL均匀涂抹在腹部剃毛区，进行初次致敏，d 2重复该操作强化致敏。敏化5 d后，将0.15% DNFB 50 μL均匀涂抹在模型组小鼠颈背部剃毛区，对照组小鼠和溶媒组小鼠分别涂抹50 μL的生理盐水和50 μL丙酮-橄榄油混合液。隔1 d给药1次，重复4次，即在颈背部开始给药的d 1，3，5，7均匀涂抹，且每次颈背部涂抹24 h后记录行为学视频60 min。见Fig 1 A。
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| Fig 1 Protocol for 2-week and 5-week ACD model induction in mice |
将C57 BL/6雄性小鼠随机分为对照组、溶媒组(丙酮∶橄榄油4 ∶1组)和DNFB模型组，每组5只。小鼠适应性喂养1周后，小鼠腹部和颈背部剃毛，面积2 cm × 2 cm。小鼠剃毛后适应两天开始造模。滴加0.15% DNFB 100 μL于小鼠腹部剃毛处，均匀涂抹敏化。敏化1周后，在模型组小鼠颈背部剃毛区域涂抹0.15% DNFB 50 μL，每周给药两次，持续4周，共9次，每次颈背部处理24 h后记录痒觉行为学视频，连续记录60 min。具体干预措施见Fig 1 B。
1.5 痒行为学检测使用SONY数字视频摄像机对痒行为测试进行录像。在录像记录前，将小鼠放置在塑料场地(10 cm×10 cm×13 cm)中至少10 min使其习惯于记录条件，塑料小盒上方有通气孔，盒中放少许垫料，透明塑料盒之间用纸片隔开，避免小鼠相互影响；透明塑料盒使用前清洗并吹干，避免气味残留的影响。然后记录小鼠60 min的自发性划痕。视频在计算机上播放以供观察者评估，计数在60 min内观察到小鼠后肢向着颈背部涂抹区域的抓挠行为。划痕定义为在小鼠抬起后爪抓挠到后爪回到地面或嘴巴记为1次。
1.6 皮肤病理组织学检测造模结束后，取小鼠造模处皮肤，多聚甲醛固定后脱水包埋成蜡块，切片机切成5 μm的薄片，分别进行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，HE)和甲苯胺蓝染色(Toluidine blue staining，TB)后，镜下观察并拍片。ImageJ测量表皮厚度(Fig 4箭头处)和肥大细胞数(Fig 5箭头处)后分别进行统计学分析。
1.7 ELISA检测小鼠血清中Ig-E水平造模结束后，眼球静脉取血。离心机设置3 000 r·min离心30 min后取上清，接下来的具体操作步骤按ELISA试剂盒所附的说明书进行操作，检测范围为7.5~ 240 μg·L-1最后在450 nm波长处测定各孔的OD值，并拍照记录后进行统计学分析。
1.8 统计学分析所有的数据使用GraphPad Prism 8.0统计软件进行单因素(One-way ANOVA)方差分析，多组间比较采用Bonferroni检验，所有的结果用x±s表示。
2 结果 2.1 两种建模周期的小鼠痒行为学变化实验结果如Fig 2所示，与空白对照组相比较，2周ACD模型组小鼠后肢抓挠次数明显增多且呈上升趋势(P < 0.01)；溶媒组小鼠后肢抓挠次数无明显增多趋势。随着时间的推移，2周模型的构建周期结束时小鼠抓挠次数达到最高水平(P < 0.01)。5周ACD模型的模型组小鼠后肢抓挠次数也增多明显，在5周模型构建期结束时，模型组的痒行为学显著高于对照组和溶媒组(P < 0.01)。
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| Fig 2 Comparison of scratching behavior changes in two ACD models (x±s, n=6) A: 2-week last scratch count; B: 2-week itch behavioral trends; C: 5-week last scratch count, D: 5-week itch behavioral trends. **P < 0. 01 vs NS group |
实验结果如Fig 3所示，在两种建模的过程中，对照组和溶媒组小鼠颈背部皮肤表面均无明显变化，且小鼠活动性较好。随着造模过程的进行，2周模型小鼠造模部位皮肤逐渐出现红斑、水肿、溃烂、结痂。小鼠造模处皮肤在涂抹DNFBd 5已经发生溃烂；颈背部涂抹DNFB d 7溃烂处皮肤结痂变硬；2周造模结束时皮肤呈现结痂状态。
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| Fig 3 Comparison of skin appearance changes in two ACD models (x±s, n=6) A: 2-week NS group; B: 2-week vehicle group; C: 2-week DNFB group; D: 5-week NS group; E: 5-week Vehicle group; F: 5-week DNFB group. |
然而，5周模型小鼠的皮肤表面明显出现红斑、水肿、溃烂、结痂、脱痂、再反复溃烂后结痂的现象。在小鼠颈背部涂抹DNFB d 8造模处皮肤发生溃烂；d 11给药前皮肤已结痂；d 15给药前，皮肤结痂已褪去，暴露痂下皮肤，呈干燥状；d 18给药前，造模处皮肤溃烂加重；d 22给药前，皮肤开始结痂，且给药区域周围皮肤开始翻起；d 25给药前，小鼠给药区域周围翻起皮肤开始褪去，且皮肤溃烂；5周模型造模结束取材时，颈背部痂脱落暴露出皮肤。
2.3 HE染色观察比较皮肤表皮增厚程度如Fig 4所示，2周模型和5周模型的溶媒组和对照组小鼠造模处皮肤表皮均无明显增厚，且边缘清晰。2周模型组小鼠与对照组小鼠相比，造模处皮肤表皮层明显增厚(P < 0.01)，且炎性浸润、海绵状变性和真皮毛细血管扩张；与2周模型结果相似，5周模型小鼠造模部位皮肤也表现出表皮增厚(P < 0.01)、角化过度、海绵样变性和真皮毛细血管扩张。
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| Fig 4 Comparison of epidermal thickness variation in two ACD models (x±s, n=6) A: 2-week NS group; B: 2-week vehicle group; C: 2-week DNFB group; D: 5-week NS group; E: 5-week vehicle group; F: 5-week DNFB group; G: Statistical analysis of the degree of skin epidermal thickening. **P < 0. 01 vs NS group |
实验结果如Fig 5所示，与对照组和溶媒组小鼠相比，2周模型组小鼠造模部位皮肤真皮层出现散在的炎症细胞浸润，且肥大细胞浸润明显(P < 0.01)。同样，5周模型的结果与2周模型的结果相似，造模部位皮肤表皮炎症浸润明显(P < 0.01)，但浸润程度更为严重。5周造模部位皮肤肥大细胞呈圆形或椭圆形，细胞核小，染色浅，位于细胞中心成堆或单独分布，且细胞质内充满相同大小的蓝紫色颗粒，均匀分布在细胞核周围。
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| Fig 5 Comparison of inflammatory mast cell changes in two ACD models(x±s, n=6) A: 2-week NS group; B: 2-week vehicle group; C: 2-week DNFB group; D: 5-week NS group; E: 5-week vehicle group; F: 5-week DNFB group; G: Statistical analysis of the mast cell counts results. **P < 0.01 vs NS group |
实验结果如Fig 6所示，与对照组和溶媒组小鼠相比，2周模型组小鼠血清中Ig-E水平明显升高(P < 0.01)。同样，5周模型的结果与2周模型的结果相似，模型组小鼠血清中Ig-E水平较对照组明显升高(P < 0.01)。
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| Fig 6 Comparison of Ig-E levels in serum in two ACD models (x±s, n=6) A: 2-week IgE levels in serum; B: 5-week Ig-E levels in serum. **P < 0. 01 vs NS group |
ACD是一种具有复发性、瘙痒性和炎症性的慢性皮肤病，其发病率在全世界逐年升高。外源性过敏原的局部致敏是诱发ACD免疫炎症的重要基础，而免疫炎症反应主要以Th 2细胞分泌IL-4为基础[4]。通过表皮中的蛋白质连接才能构成一个新的抗原决定簇，引起免疫系统激活。DNFB建立的ACD模型是最常用模型之一，DNFB是小分子物质半抗原，易与皮肤组织蛋白相结合，且不显著改变组织蛋白的内部结构，其诱导的ACD模型作为一种免疫和瘙痒模型，在T细胞炎症相关及瘙痒研究中有重要作用[7, 10]。然而，ACD不同的建模周期模型往往会给研究人员带来选择上的麻烦，而且其时间跨度也大不相同。因此，以便更好地选择合适的动物模型，进一步研究和明确不同建模周期的病变特征变得十分重要，特别是对于药物治疗效果的评价。研究采用腹部致敏后颈背激发的方法建立不同造模周期的小鼠ACD模型，通过检测动物的瘙痒行为变化，并进一步检查了皮肤组织病理学变化情况和血清中IgE水平等，以评估慢性瘙痒和免疫炎症反应的程度。
瘙痒为一种十分不愉快的感觉，会引起机体强烈的抓挠欲望[7, 11]。通常瘙痒与皮肤疾病有关，然而它也可能伴随着各种全身性疾病，包括肾、肝、神经、肿瘤或心理源性疾病等[12-13]。因此，合适的瘙痒模型以及增加对慢性瘙痒神经生物学的了解可能有助于提供新的治疗策略。实验结果显示，两种ACD模型造模周期的小鼠整个建模过程都伴随后肢刮擦反应。随着造模的进行，瘙痒抓挠次数均逐渐增多，这表明两种建模周期都会引起痒行为发生显著变化，且瘙痒发生迅速。因此，从瘙痒行为的角度来看，建模时间的长短可能影响不够明显。
在临床上，特应性皮炎患者常有一些特征性的表现，如皮肤干燥、鱼鳞病和各种湿疹等。急性湿疹的特点是红斑丘疹和水疱，瘙痒剧烈，且伴有渗出和结痂；而亚急性或慢性湿疹为干燥、鳞状或剥落性红斑丘疹[14]。我们的研究结果显示小鼠瘙痒症状为小鼠开始时抓挠，然后皮炎再造成损害进一步加重。即先产生瘙痒，然后再引起皮损，这与ACD的临床特点是一致的。瘙痒是DNFB诱发的ACD模型的基本特征，而不是先出疹后再产生瘙痒。且随着时间的推移，可能会出现表皮增厚(苔藓样变)和长期搔抓而引起的皮肤裂痕。ACD小鼠在造模部位的典型症状是瘙痒、红肿、鳞屑和结痂破损等，尤其是5周模型小鼠反复出现该症状，因此其更严重。这表明两个造模周期的皮损均具有典型性，且也符合临床疾病的特点，因此我们认为其均可作为瘙痒和皮炎研究的动物模型。
ACD通常被认为是由于活化的Th 2、嗜酸性粒细胞和肥大细胞之间复杂的相互作用而引起的炎症性皮肤病，其主要机制为炎性细胞的浸润[15]。该研究发现两种造模周期的小鼠造模皮肤组织病理学表现为表皮增厚、炎性浸润、海绵样变性、真皮毛细血管扩张和角化过度。结果表明两种造模周期都是可行的，但五周模型炎症损伤更加剧烈。肥大细胞是炎症反应的关键效应细胞，在炎症反应中起着至关重要的作用，尤其是在Th 2和Ig E介导的急性过敏反应中[16-17]。Meixiong等[18]研究表明，肥大细胞通过Mas相关的G蛋白偶联受体b 2受体激活导致ACD相关的炎症和瘙痒。本实验结果显示，与对照组相比，两种建模周期小鼠造模皮肤均出现明显的肥大细胞浸润。与瘙痒行为和皮肤损伤结果相同，5周模型小鼠造模皮肤的肥大细胞数量明显高于2周模型小鼠。结果表明，这两种建模周期都是可行的，但在5周建模结束后，炎症损伤程度和免疫反应更加强烈。
综上所述，DNFB引起ACD模型非常稳定，且两种建模周期都是可行的。2周模型虽然造模周期较短，但痒行为学、皮肤损伤和免疫炎症反应均出现。而5周模型可能有更典型的症状、皮肤受损程度更严重和更强烈的免疫反应，且有足够的时间进行药物观察研究。本研究为瘙痒和炎症相关药物的研究选择合适的动物模型提供了实验依据。
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