2. 山西省中医院，山西 太原 030012;
3. 山西中医药大学，山西 晋中 030619
2. Shanxi Traditional Chinese Medical Hospital, Taiyuan 030012, China;
3. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong Shanxi 030619, China
近几十年来，有机锡化合物在工农业生产中被广泛应用，如船体防污漆及木材防腐剂等。在使用过程中，该类化合物会不可避免地向环境中排放[1]。然而，大多数有机锡化合物具有高生物毒性，这些化合物可通过小肠或皮肤等途径进入人体。特别是三取代体最易被吸收，并主要分布在肝、肾和脑部[2]。其中，作为三丁基氯化锡在人体内的主要的降解产物，二氯二丁基锡对人体产生的危害同样引起人们的重视。
肝脏作为人体的主要代谢部位，在分子解毒的过程中可能会生成过量的有毒活性氧。这会对肝细胞造成氧化损伤，严重时会损害这一关键器官的功能[3]。而抗氧化剂的使用可保护肝脏免受自由基介导的损伤。有研究发现，一些具有抗氧化作用的天然活性产物对肝损伤的治疗具有显著效果[4-5]。
青藤碱(sinomenine，SIN)是从防己科植物青藤的干燥藤茎中提取的生物碱，具有抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[6]。此外，SIN具有抗氧化作用[7]。本课题组前期研究证实了SIN可以保护H2O2导致的肝HL02细胞损伤。
本研究通过建立二氯二丁基锡诱导的HL02细胞损伤模型观察SIN对细胞的保护作用及对凋亡相关信号通路的影响，旨在进一步阐明SIN发挥保护作用的机制，为深入探讨其潜在药用价值研究提供实验依据。
1 材料和方法 1.1 仪器光学倒置显微镜(OPTECBDS200-PH，重庆Optec Instrument公司)；酶标仪(Thermo Scientific)；台式低速离心机(TD5A-WS，长沙湘仪有限公司)；高速冷冻离心机(TGL-16gR，上海安亭科学仪器厂)；荧光倒置显微镜(Ⅸ-51，Olympus)；流式细胞仪(BD-C6，USA)；实时定量PCR仪(Step One，Applied Biosystems)。
1.2 细胞株HL02细胞株来自中国科学院细胞库。
1.3 主要试剂二氯二丁基锡(货号205494)购自美国Sigma公司；青藤碱(纯度>97%，货号S302249)购自上海aladdin公司；吖啶橙(AO，货号0360-50G)、溴化乙锭(EB，货号0492-5G)均购自美国Amerisco公司；活性氧(ROS)检测试剂盒(货号C1300-1-2)购自北京ApplyGEN公司；双染凋亡检测试剂盒(货号KGA106)购自江苏keyGEN BioTECH公司；RNA提取试剂盒(货号9753Q)购自北京Takara Bio公司；兔抗cleaved caspase-3(货号9664)、caspase-9抗体(货号9502)均购自美国Cell Signaling公司。RPMI 1640培养基(货号31870082)、胎牛血清(FBS，货号10100147)、青链霉素双抗混合液(货号15070063)购自美国Invitrogen Life公司；引物合成自生工生物工程有限公司。
1.4 细胞培养将HL02细胞接种于无菌培养瓶中，加入含10% FBS的RPMI 1640培养液，将其置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。
1.5 方法 1.5.1 MTT法测定细胞活力 1.5.1.1 SIN毒性实验取对数生长期的HL02细胞，均匀添加进96孔板内，孵育过夜后，分别加入2、4、8、16、32、64、128、256、512 μmol·L-1 SIN，24 h后加入10 μL 5 g·L-1 MTT。培养4 h后弃去上清液，添加100 μL DMSO，使用酶标仪(570 nm)测量吸光度(OD)值。计算细胞生存率。
1.5.1.2 DBT毒性实验将HL02细胞孵育过夜后分别加入0.25、1、4、16、32 μmol·L-1 DBT孵育24 h。按相同方法计算细胞生存率。
1.5.1.3 SIN保护活性实验HL02细胞经SIN(4、8、16 μmol·L-1)培养24 h后加入3 μmol·L-1 DBT孵育6 h，测定OD值。计算细胞生存率。
1.5.2 形态学观察HL02细胞经过DBT以及SIN处理后，使用倒置显微镜(×40)观察，拍照。
1.5.3 AO/EB染色法HL02细胞经过DBT以及SIN处理后，添加1 g·L-1 AO和EB溶液，暗处孵育15 min，用冷的PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察后拍照。
1.5.4 Annexin V-FITC/PI双染法使用DBT及不同浓度的SIN处理HL02细胞，收集细胞，避光染色。检测细胞凋亡率。
1.5.5 ROS含量测定HL02细胞经DBT及不同浓度的SIN处理后，加入到10 μmol·L-1 DCFH-DA溶液中，37 ℃孵育半小时，反复清洗3次后检测荧光强度。结果用实验组与对照组的平均荧光强度表示。
1.5.6 线粒体膜电位检测将JC-1、超纯水和染色缓冲液按1∶160∶40比例配置工作液。取1 mL工作液加入处理后的HL02细胞样品中，37 ℃孵育20 min，PBS清洗重悬，检测荧光强度。
1.5.7 实时荧光定量PCR处理后的HL02细胞提取总RNA，并使用酶标仪测量RNA浓度和纯度。之后，按照反转录试剂盒的程序获得到cDNA。基因的相对含量表示为2-ΔΔCt。引物序列如Tab 1所示，内参基因是GAPDH。
| Gene | Base sequence (5′-3′) |
| Bad | F：CGGAGGATGAGTGACGAGTT |
| R：CAAGTTCCGATCCCACCA | |
| Bcl-xL | F：CTGGTGGTTGACTTTCTCTCCT |
| R：GGTCTCCATCTCCGATTCAGT | |
| Bcl-2 | F：ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA |
| R：GAGACAGCCAGGAGAAATCAA | |
| Bax | F：ATGCGTCCACCAAGAAGC |
| R：GCCACTCGGAAAAAGACCT | |
| Cytochome-c | F：GTTGAAAAGGGAGGCAAGC |
| R：GTTCTTATTGGCGGCTGTGT | |
| Apaf-1 | F：CCACTCAACAGCAAAGAGCA |
| R：ATGGAGAAGGGCAGCAAGAT | |
| caspase-9 | F：GAACTAACAGGCAAGCAGCA |
| R：CCTCCAGAACCAATGTCCAC | |
| caspase-3 | F：GGAGGCCGACTTCTTGTATG |
| R：ACTGTTTCAGCATGGCACAA | |
| GAPDH | F：TGTCTCCTGCGACTTCAACAG |
| R：GAGGCCATGTAGGCCATGAG |
收集处理后的HL02细胞，加入裂解液，12 000 r·min-1离心20 min，取上清液，定量，等量等体积蛋白加到上样孔中进行电泳分离。随后用5%脱脂牛奶封闭1.5 h，一抗在4℃孵育12 h后，二抗室温培养1 h，显影，曝光。
1.5.9 统计学分析计量资料采用x±s表示，平行重复3次，数据分析使用单因素方差分析及两两比较用Tukey法。
2 结果 2.1 SIN对DBT诱导HL02细胞毒性的保护效果结果如Fig 1所示，HL02细胞在不同浓度的SIN(2~512 μmol·L-1)中培养12 h后，浓度低于128 μmol·L-1的SIN未对HL02细胞的增殖显示抑制效果。经过DBT单独处理，细胞活力呈浓度依赖性降低，IC50值为2.96 μmol·L-1。相比对照组，DBT处理组的细胞存活率明显下降，而使用SIN预处理可以显著提升细胞存活率，差异有统计学意义(P＜0.01)。形态学观察结果显示，DBT处理组HL02细胞变小呈圆珠状，而不同浓度SIN预处理后形态改变的细胞逐渐减少。
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| Fig 1 The protective effect of SIN on DBT-induced cytotoxicity of HL02 cells (x±s, n=3) A: Toxicity of SIN on HL02 cells; B: Toxicity of DBT on HL02 cells; C: The protective effect of SIN on the decline of HL02 cell viability induced by DBT; D: Cell morphology observation results. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs model. |
结果如Fig 2所示，HL02细胞经DBT处理后核染色质为桔红色并呈固缩状，而不同浓度SIN的预处理后，上述现象逐渐减少。模型组中细胞凋亡率为(25.37±0.87)%，而不同浓度SIN预处理后，细胞凋亡率分别降为对照组(22.30±0.50)%、(18.30±1.04)%、(13.07±1.82)%，与单独使用DBT处理相比较，SIN组凋亡率明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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| Fig 2 SIN reduced increase of DBT-induced HL02 cell apoptosis (x±s, n=3) A: The characteristics of cell apoptosis observed by AO/EB fluorescence staining; B: Cell apoptosis rate detected by Annexin V-FITC/PI double staining; C: The corresponding quantitative data of B. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
实验结果显示(Fig 3)，模型组中细胞内ROS为对照组的(1.99±0.07)倍，而经过不同浓度SIN预处理后，细胞内ROS含量降低至对照组的(1.75±0.04)、(1.46±0.04)、(1.25±0.04)倍。同时，单独使用DBT处理降低MMP至对照组的(0.41±0.04)倍。而经不同浓度的SIN预处理后加入DBT，电位差明显发生改变，分别增长为对照组的(0.54±0.03)、(0.71±0.05)、(0.83±0.04)倍。
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| Fig 3 SIN reduced DBT-induced ROS production and MMP depolarization in HL02 cells (x±s, n=3) (A, C)The result of intracellular ROS and MMP measured by flow cytometry.(B, D)The corresponding quantitative data of(A, C). ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
采用qRT-PCR技术检测Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、cytochome c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA表达水平。结果显示(Fig 4)，DBT能明显增加Bad、Bax、cytochome-c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA水平、降低Bcl-xL和Bcl-2的mRNA水平。而不同浓度SIN的预处理能明显逆转上述结果，差异有统计学意义(P＜0.01)。
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| Fig 4 The mRNA expression of apoptosis-related proteins (x±s, n=3) ##P < 0.01 vs control; **P < 0.01 vs model. |
结果如Fig 5所示，经过DBT单独处理，HL02细胞中的Bcl-2/Bax比例明显降低。相比之下，SIN的预处理后二者比例随SIN浓度的提高而升高(P＜0.01)。同时，caspase-9与cleaved-caspase-3的表达也降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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| Fig 5 Expression of apoptosis-related proteins (x±s, n=3) (A, B)The expression of Bcl-2, Bax, caspase-9 and cleaved-caspase-3 proteins.(C, D)The corresponding quantitative data of(A, B). ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
自三取代有机锡化合物因高毒性被禁止使用以来，二取代有机锡化合物逐渐发展。其中，二氯二丁基锡的应用十分广泛。本课题组对有机锡类化合物的药理和毒理研究过程中发现：二氯二丁基锡对肝细胞表现出明显的毒性。该毒性可能源于自由基引起的氧化损伤。在对DBT诱导肝细胞毒性的治疗过程中，我们检测了多种中药活性成分，从中筛选发现青藤碱具有一定的保护活性。近期有研究表明，青藤碱可以通过抑制氧化应激，凋亡和炎症发挥肝保护作用[8]。
氧化应激是肝细胞损伤重要的机制之一[9]。过量的ROS可与生物大分子发生反应，使之失活，最终导致细胞损伤。有研究表明，三苯基锡(TPT)可以诱导HepG2肝细胞产生过量ROS，诱导DNA损伤(DNA断裂)，产生细胞毒性[10]。然而，据文献报道青藤碱具有抗氧化应激活性。例如：近期Fang等[8]报道，青藤碱可以通过抑制氧化应激，凋亡和炎症等机制，对乙醇诱导的小鼠肝损伤发挥保护作用；Fan等[11]报道，青藤碱可通过激活PC12细胞的内源性抗氧化机制减轻H2O2导致的细胞毒性。因此，我们推测青藤碱可能通过激活肝HL02细胞内源性抗氧化机制，清除细胞内产生的过量ROS，从而保护线粒体，降低肝细胞凋亡率。本实验结果也证实了DBT诱导的HL02细胞内ROS的过量产生能够经过SIN的预处理得到减轻。
在凋亡发生的初期，细胞内过量ROS可以降低抗凋亡蛋白表达、上调促凋亡的蛋白表达。这引起MMP下降与线粒体膜通透性增强[12]。进而导致细胞质中cytochrome-c蛋白增多。其可以和Apaf-1聚合为凋亡体[13]。凋亡体可以激活caspase-9形成cleaved-caspase-9。cleaved-caspase-9进一步诱导下游的caspase-3活化形成cleaved-caspase-3并最终可导致细胞程序性死亡。有研究表明，一些mRNA的表达水平能够反映相应蛋白质的表达水平[14]。本实验结果表明，DBT处理组中Bcl-2和Bcl-xL的mRNA表达降低，而Bax、Bad、cytochrome c、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的mRNA表达升高。经过不同浓度SIN的预处理，上述结果发生逆转。Western blot结果也证实SIN能够显著提升Bcl-2与Bax的比值、降低caspase-9与cleaved-caspase-3的表达。
综上所述，本研究结果表明，SIN能够有效降低DBT诱导的HL02细胞损伤，其机制与抑制ROS介导的线粒体凋亡有关。
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