罗汉果广泛分布于广西桂林永福县、临桂县[1]，作为一种常用的药食两用的植物，罗汉果具有降血糖、抗炎抑菌、抗氧化等作用[2]。罗汉果主要含有由三萜皂苷类、黄酮类、多糖类等物质[3]，其中罗汉果皂苷V(mogroside V，MV)是其主要的活性成分[4]，MV是一种三萜类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、止咳润肺、降血糖等作用[5]。糖尿病是一种以血糖水平升高为表现的慢性疾病，与内分泌代谢紊乱有关。糖尿病已经成为发生率仅次于心血管疾病和肿瘤的疾病，预计到2040年，会有超过6亿人遭受糖尿病的侵害[6]。寻找天然的降糖药物，加强对糖尿病的防治，减轻其并发症一直是研究者关注的焦点。胰岛β细胞是一种内分泌细胞，能贮存和分泌胰岛素从而维持体内血糖的稳态[7]。在氧化应激条件下，活性氧(reactive oxygen species，ROS)会对胰岛β细胞造成损伤，引起凋亡，从而导致功能障碍，最终引发高血糖。研究表明MV具有抗氧化活性，对氧化应激环境有拮抗作用，从而降低糖尿病并发症的发生率[2]。但是，其是否能降低胰岛β细胞内ROS水平，从而发挥保护胰岛细胞的作用仍不清楚。PI3K/Akt是细胞生长、存活、增殖等的重要信号通路[8]，与藤茶总黄酮抑制肝癌的作用有关[9]，且其参与了ROS的氧化应激。本研究通过采用过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)构建小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞氧化损伤模型，探讨MV对MIN6细胞氧化损伤的保护作用及其机制是否与PI3K/Akt信号通路有关。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞为桂林医学院生药学重点实验室传代保存。
1.1.2 药物含量为95.78%的MV(批号: PS000637) 购自成都普思生物科技股份有限公司。
1.1.3 主要试剂DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司; 胎牛血清购自美国CLACK公司; 噻唑蓝(MTT)购自北京索莱宝公司; Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自美国BD公司; RIPA强裂解液购自上海Beyotime公司; BCA蛋白定量测定试剂盒购自上海Beyotime; β-actin单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司; Bcl-2、PCNA、Akt等单克隆抗体购自美国Abcam公司; p-Akt单克隆抗体购自沈阳万类生物科技有限公司; MK2206购自于美国MedChemExpress公司; 鼠二抗及兔二抗均购自上海Abmart公司; Western一抗稀释液购自上海雅酶生物科技有限公司; 硝酸纤维素膜购自美国Pall公司; H2O2购自西陇化工厂; ECL超敏化学发光试剂购自合肥Biosharp公司。
1.1.4 仪器流式细胞仪购自美国BD公司(BD C6 plus); Galaxy 170S型二氧化碳培养箱购自德国Eppendorf公司; A2-4S1级2型生物安全柜购自新加坡ESCO公司; Infinite M200Pro型酶标仪购自瑞士TECAN公司; 蛋白电泳系统购自美国Bio-Rad公司; 蛋白转印系统购自美国Bio-Rad公司; 电泳仪电源购自美国Bio-Rad公司; 高速冷冻离心机购自美国Thermo公司; TDZ4-WS型台式低速离心机购自湘仪离心机仪器有限公司; ECL化学发光仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法 1.2.1 药物的配制(1) MV为白色粉末，用PBS配制成浓度为100 g·L-1的母液，根据实验所需用DMEM培养基稀释至所需浓度。(2)将30%H2O2(10 mol·L-1)加PBS配置成60 mmol·L-1的母液，现用现配，根据实验要求用培养基稀释成所需浓度。
1.2.2 细胞培养将MIN6细胞复苏后，5 mL培养基混匀后，放入7 cm培养皿中，摇匀，放置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养至细胞密度为80%~90%时，进行传代。
1.2.3 MTT试验检测细胞活力将处于对数生长期的MIN6细胞，胰酶消化后，加入适当的培养基制成细胞悬液，利用细胞计数仪计量细胞悬液中的细胞密度。调整细胞密度为4×103个/孔接种于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。过夜贴壁后，设置空白对照组(Control，Ctrl)、H2O2组(500 μmol·L-1)、MV组(100 mg·L-1)以及MV保护组(MV预处理1 h后加入H2O2)，空白对照组加入等体积培养基，每组浓度设6个复孔。药物处理后，置于37 ℃，5% CO2培养箱中分别培养24 h后，每孔加入20 μL MTT。继续培养4 h后，弃上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，用枪吹打使结晶溶解，混匀。在490 nm波长处测吸光度(OD)。
1.2.4 流式细胞凋亡检测取对数生长期MIN6细胞种于7 cm培养皿中，贴壁后，按照“1.2.3”中分组方式加入相应浓度的药物。作用24 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集细胞，离心后加入1 mL PBS洗涤细胞后再次离心。弃上清，加入200 μL Binding buffer，5 μL FITC和5 μL PI，室温避光孵育30 min。加入200 μL Binding buffer，300目筛网过滤后，BD C6 Plus流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.2.5 2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测ROS取对数生长期的MIN6细胞，0.25%胰酶消化后，种于6孔板中。贴壁后，加入药物处理24 h。药物处理完毕，弃去培养基，用PBS洗涤，用0.25%胰酶消化后加入600 μL培养基终止消化，1 000 r·min-1离心5 min，用PBS洗涤。加入500 μL ROS探针DCFH-DA(2 μmol·L-1)后，37 ℃孵育20 min。孵育结束后，用PBS洗涤3次，加入300 μL PBS悬浮细胞，300目筛网过滤后，流式细胞仪检测荧光强度。
1.2.6 Bcl-2、PCNA蛋白水平检测取对数生长期MIN6细胞种于10 cm培养皿中，贴壁后，加入相应浓度药物处理。处理结束后，将细胞收集于1.5 mL EP管中，根据细胞沉淀量加入适量的RIPA强裂解液，用1 mL的移液器将细胞沉淀吹散，放置于冰上30 min，使得细胞沉淀得以充分裂解。12 000 r·min-1离心30 min，将上清移至预冷的1.5 mL EP管中。BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。根据蛋白浓度以及所需体积，并加入5×SDS、ddH2O使上样体积为20 μL。根据蛋白分子量配制相应浓度的分离胶，SDS-PAGE电泳分离120 min，转膜60 min，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，洗膜后分别加入相应的一抗(1 ∶ 1 000)4 ℃孵育过夜。PBST洗膜3次，室温孵育对应的二抗，再洗膜4次。ECL发光及进行灰度值计算分析。
1.2.7 统计学处理采用SPSS 20.0统计进行统计学分析，两组样本采用独立样本t检验并用x±s表示，多组间样本采用单因素检验分析。
2 结果 2.1 MV抑制了H2O2诱导的MIN6细胞的损伤作用我们使用25~1 600 mg·L-1的MV处理MIN6细胞，发现100 mg·L-1以内的MV处理MIN6细胞与对照组之间的细胞活力值无差异(P>0.05)，结果表明100 mg·L-1以下的MV对MIN6细胞几乎无毒性(Fig 1A)。在光学显微镜下观察细胞形态发现，对照组细胞生长状况良好，细胞膜边缘清晰可见，H2O2单独处理的细胞数减少，细胞皱缩变圆、变亮，细胞损伤严重。结果提示，H2O2抑制了MIN6细胞增殖并极可能诱导了细胞死亡。MV预处理组与H2O2单独处理组相比，MV预处理组细胞密度有所增加，细胞碎片减少(Fig 1B和C)，说明MV对H2O2诱导的MIN6细胞损伤具有一定的保护作用。
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| Fig 1 The protective effect of mogroside Ⅴ on MIN6 cells (x±s, n=3) A: The effect of different concentrations of mogroside Ⅴ on the vitality of MIN6 cells; B: Morphology of MIN6 cells treated with mogroside Ⅴ under microscope; C: The protective effect of mogroside Ⅴ on the apoptosis of MIN6 cells induced by H2O2. *P < 0.5, **P < 0.01 vs Ctrl; ##P < 0.01 vs H2O2 |
流式结果表明，H2O2作用于MIN6细胞后，细胞凋亡率达到了21.2%。MV预处理后，能减少H2O2诱导的细胞凋亡至15%，差异具有统计学意义(P < 0.05)。因此，MV可以部分抵抗H2O2的氧化应激，从而保护MIN6细胞，减轻其氧化损伤，减少MIN6细胞的凋亡(Fig 2)。
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| Fig 2 Effect of mogroside Ⅴ on apoptosis of MIN6 cells (x±s, n=3) A: Mogroside V restrains H2O2-induced apoptosis in MIN6 cells; B: The percentage of apoptotic cells. **P < 0.01 vs Ctrl; ##P < 0.01 vs H2O2 |
流式结果显示，H2O2作用于MIN6细胞后，ROS的释放增加，因此导致了MIN6细胞的死亡。MV预处理MIN6细胞后，能显著减少H2O2诱导的ROS(P < 0.05)(Fig 3)，这可能与其具有抗氧化的药理活性有关。MIN6细胞ROS水平下调，细胞氧化损伤降低，细胞凋亡减少。
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| Fig 3 Effect of mogroside Ⅴ on reactive oxygen species (ROS) in MIN6 cells (x±s, n=3) A: Mogroside V decreases the release of ROS induced by H2O2 in MIN6 cells; B: The mean flourescence intensity in MIN6 cells. *P < 0.05 vs Ctrl; #P < 0.05 vs H2O2 |
我们进一步通过Western blot分析增殖以及凋亡相关因子Bcl-2、PCNA和Akt的表达。结果显示，H2O2使MIN6细胞中PCNA、Bcl-2以及p-Akt蛋白的表达降低，这可能是H2O2处理后导致细胞减少，细胞凋亡的原因。MV预处理后，能减轻H2O2对MIN6细胞内PCNA以及Bcl-2表达的抑制及Akt的活性下降，进而提高了MIN6细胞活性及抑制其凋亡(Fig 4)。
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| Fig 4 Effect of mogroside Ⅴ on protein volume expression of MIN6 cells (x±s, n=3) A: The expression levels of related proteins in MIN6 cells; B, C, D: The relative expression levels of related proteins in MIN6 cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs Ctrl; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs H2O2 |
为进一步验证Akt在MV对MIN6细胞中的作用，我们使用Akt抑制剂MK2206处理MIN6细胞，发现MK2206能引起MIN6细胞凋亡，而且MV也可以部分逆转其对MIN6细胞的损伤(Fig 5A)(P < 0.05)。同时发现，MK2206也可以使细胞内ROS水平增加(Fig 5B)(P < 0.01)，这与H2O2导致MIN6细胞发生氧化损伤的结果一致。此外，蛋白水平分析显示，MV也可以上调MK2206导致的PCNA以及Bcl-2表达降低以及Akt的活化(Fig 5C)(P < 0.05)。
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| Fig 5 The oxidative damage on MIN6 cells caused by Akt inhibitor alleviated by mogroside Ⅴ (x±s, n=3) A: Mogroside V restrains Akt inhibitor-induced apoptosis in MIN6 cells; B: Mogroside V decreases the release of ROS induced by Akt inhibitor in MIN6 cells; C: Mogroside V reverse the expression levels of related proteins induced by Akt inhibitor in MIN6 cells. **P < 0.01 vs Ctrl; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs MK2206 |
糖尿病是全球最主要的代谢性疾病之一[9]。胰岛β细胞能够分泌和贮存胰岛素，其增殖的减少以及受损抑制了胰岛素的分泌。本研究结果显示，MV能够增加H2O2诱导的MIN6细胞的增殖。PCNA与细胞增殖密切相关，其表达水平的高低可反映MIN6细胞的增殖活性。Western blot结果显示，MV逆转了H2O2诱导的PCNA表达减少。因此，推测MV通过增加PCNA的表达来促进H2O2诱导的MIN6细胞增殖。
氧化应激是糖尿病的病理基础之一，其能够损伤胰岛β细胞以及导致胰岛素抵抗。胰岛β细胞中的抗氧化酶水平较低，对高糖、高脂、炎症因子等刺激因子非常敏感，导致其容易受到ROS介导的氧化应激损伤[10]。本研究表明，MV能够减少H2O2诱导的ROS释放。这提示MV可能通过抑制氧化应激减少MIN6细胞氧化损伤。细胞内产生氧化应激，ROS增加的同时，常常伴随着细胞凋亡的发生。胰岛β细胞的凋亡也是糖尿病发生的一个重要因素。过量ROS的产生会激活线粒体凋亡通路，从而诱导细胞发生凋亡。当凋亡刺激作用于线粒体时，会导致促凋亡和抗凋亡因子表达的失衡，从而诱导细胞凋亡。Bcl-2是重要的抗凋亡因子，细胞凋亡的发生常常伴随着其表达的减少。我们研究发现，MV能够上调H2O2诱导的Bcl-2表达减少。因此，我们推测MV减少H2O2诱导的凋亡机制可能与增加Bcl-2的表达有关。
PI3K/Akt信号通路是细胞的重要调节通路，与增殖凋亡密切相关。我们发现MV干预后，能够保护H2O2诱导的PI3K/Akt失活。有研究表明，磷酸化的Akt蛋白可以使Bcl-2从聚合体中释放出来，从而发挥抗凋亡作用。为了确定Akt的活化确实参与了MV对MIN6细胞的保护作用，我们使用了Akt的抑制剂MK2206。我们发现Akt抑制剂MK2206可以升高MIN6细胞内的ROS水平以及造成细胞凋亡，而MV也可以减轻其对MIN6细胞的氧化损伤。因此，MV上调氧化损伤MIN6细胞内Bcl-2的表达可能与激活上游Akt信号通路有关。
综上所述，MV通过促进胰岛β细胞的增殖，抑制凋亡的发生以及减少ROS的水平保护了H2O2诱导的MIN6细胞损伤，其机制可能与促进PI3K/Akt的活化增加Bcl-2的表达有关。
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