结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是全世界最常见的肿瘤之一[1]，致病原因复杂，发病率及复发率高。奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)是第三代铂类化疗药的代表药物，与DNA发生交联后细胞周期停滞，诱导细胞凋亡，但在临床发现严重毒副作用[2]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在细胞生长和凋亡中起关键作用[3]。抑制MAPK/ERK信号通路促进细胞凋亡[4]，因此探究奥沙利铂通过EGFR-MAPK信号通路中EGFR-RAS-RAF-ERK1/2的信号级联反应产生的作用机制，为奥沙利铂靶向用药及临床应用提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 材料人结肠癌细胞HCT116购自中国科学院细胞库(TCHu 99)，奥沙利铂购自北京索莱宝科技有限公司(产品批号No.324F021)。β-actin(TA-09)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，B-RAF(SAB4502855)及RAS(SAB4301113)抗体购自Sigma，Bcl-2(15071S)、Bax(89477S)、ERK1/2(4695S)、p-ERK1/2(8544S)、EGFR(4267S)和p-EGFR(3777S)等抗体购自CST。
1.2 实验方法 1.2.1 奥沙利铂的配制称1 mg的奥沙利铂溶解于1 mL的无菌水中，将药物按所需10、20和40 mg·L-1浓度加入培养基，现用现配。空白对照组加入无菌水。
1.2.2 MTT法检测细胞活力将HCT116细胞接种到96孔板中，贴壁后加入不同浓度的OXA，孵育24 h。加10 μL的MTT溶液(5 g·L-1)，4 h后弃掉废液，加150 μL的DMSO溶液，在37 ℃孵育10 min。在酶标仪490 nm波长测定吸光度。
1.2.3 细胞划痕实验检测细胞迁移将HCT116细胞接种于6孔板中，用10 μL的移液枪头划直线，冲洗后加入不同浓度的OXA培养24 h，拍照并计算划痕创面愈合程度。
1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭小室铺基质胶后加入不同浓度的OXA上室无血清的培养基和下室为20%胎牛血清的培养基，将细胞接种到上室中培养24 h，固定染色，观察细胞数目并拍照。
1.2.5 Western blot检测蛋白表达水平HCT116细胞培养基中培养并加药处理24 h，消化并收集细胞沉淀，进行蛋白定量、电泳、转膜、封闭、一抗及二抗的孵育并发光处理的过程。所有实验至少重复3次，并用Image J进行分析。
1.3 统计学分析用SPSS 16.0统计软件进行分析，结果以x±s表示。采用配对样本t检验或方差分析后t检验。
2 结果 2.1 OXA抑制细胞活力HCT116细胞分别用0、10、20及40 mg·L-1的奥沙利铂处理24 h。与对照组相比，24 h的存活率为100.00 %、79.09 %、62.20 %及41.81 %，呈显著性抑制作用(P < 0.05)。
2.2 OXA抑制细胞迁移及侵袭通过细胞划痕和Transwell实验，发现与对照组相比，OXA显著抑制HCT116细胞的迁移及侵袭，具有浓度依赖性(P < 0.05)，见Tab 1。
| 0 mg·L-1 | 10 mg·L-1 | 20 mg·L-1 | 40 mg·L-1 | |
| Migration rate | 1.00±0.01 | 0.55±0.14 | 0.39±0.02** | 0.07±0.03** |
| Invasion rate | 1.00±0.06 | 0.58±0.07** | 0.35±0.07** | 0.18±0.006** |
| **P < 0.01 vs NC. | ||||
Western blot实验对EGFR-RAS-RAF-ERK1/2的蛋白进行水平检测。OXA对EGFR、p-EGFR、RAS、B-RAF、ERK1/2及p-ERK1/2呈抑制作用，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Tab 2。与空白组相比，抑凋亡蛋白Bcl-2的表达随OXA浓度增加而降低；促凋亡蛋白Bax的表达为先升高后降低的趋势，见Tab 2。
| 0 mg·L-1 | 10 mg·L-1 | 20 mg·L-1 | 40 mg·L-1 | |
| EGFR | 1.00 | 0.86±0.01* | 0.83±0.10 | 0.37±0.01** |
| p-EGFR | 1.00 | 0.71±0.05* | 0.65±0.08* | 0.54±0.08** |
| RAS | 1.00 | 0.68±0.07** | 0.63±0.11* | 0.56±0.08** |
| B-RAF | 1.00 | 0.90±0.06 | 0.64±0.04** | 0.53±0.09** |
| ERK1/2 | 1.00 | 0.81±0.05* | 0.63±0.06** | 0.54±0.05** |
| p-ERK1/2 | 1.00 | 0.95±0.01 | 0.92±0.07 | 0.72±0.06** |
| Bcl-2 | 1.00 | 0.93±0.09 | 0.75±0.10* | 0.74±0.11* |
| Bax | 1.00 | 2.53±0.28** | 2.32±0.27** | 1.71±0.48 |
| *P < 0.05，**P < 0.01 vs NC. | ||||
OXA作为铂类代表药物参与多种肿瘤的治疗，并为晚期结直肠癌的一线药物。目前OXA耐药机制尚不清晰，联合治疗成为OXA减少用量和减轻毒副作用的有效手段。通过实验发现，奥沙利铂通过抑制EGFR-RAS-RAF-ERK1/2的信号级联反应来抑制HCT116的增殖、迁移及侵袭并促进其凋亡，进一步验证抑制ERK1/2后促进凋亡[5]。EGFR-MAPK是奥沙利铂对结肠癌靶向治疗中的重要信号通路。奥沙利铂发挥表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)作用对HCT116细胞产生抑制作用。
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