帕金森病(Parkinson′s disease，PD)，是世界第二大神经退行性疾病，其患病率随着患者年龄的增加而上升。主要表现出行动迟缓、静止性震颤、肌肉僵直等症状。.造成PD的主要原因为脑内多巴胺神经元的减少，进而对纹状体分泌多巴胺(dopamine，DA)产生影响^[1]。DA主要通过多巴胺受体(dopamine receptor，DR)发挥正常功能。DR包括激活性受体D1类(DRD1和DRD5)和抑制性受体D2类(DRD2、DRD3和DRD4)^[2]。其中，DRD1、DRD2和DRD3常见于黑质-纹状体和中脑-边缘系统，并且在脑内有丰富的表达量，主要参与行为和情绪的调控^[3]；DRD4主要分布于海马区，对神经传递起到调节作用^[4]；DRD5是信息传递和神经冲动传递的重要功能性受体^[5]。

临床大多采用化学制剂治疗PD，虽然PD症状在一定程度上有所缓解，但长期服用会出现一系列不良反应，药效也会逐渐减退。此外，这些药物无法修复多巴胺神经元的损伤，也不能缓解多巴胺神经元的退化。在现代医学中，PD的发病机制尚不明确，大多认为与多巴胺神经元有关。杜仲是中国特有的木本植物，广泛生长于中国中南部。早在2000多年前，杜仲已有入药记载，并且杜仲在保护神经元方面具有较好的效果。因此，研究杜仲可能具有抗PD活性。

网络药理学以中医理念为基本研究方法，是阐明活性成分和中药潜在机制的可行策略。斑马鱼模型是一种新型生物模型，因其体积小，繁殖快且产量大，身体透明易于观察等特点已广泛应用于活性评价中。此外，斑马鱼神经系统结构和发育过程与人类高度相似，实验中常用来模拟人类相关疾病研究。本研究根据网络药理学结果，对杜仲抗PD可能存在的活性成分、作用靶点和通路进行预测，然后利用斑马鱼PD模型进行检验，明确杜仲抗PD的相关作用机制。

1 材料 1.1 药物提取

将干燥的杜仲进行磨粉处理，将粉末和纯净水按照1 ∶10的比例进行回流提取，回流2次，每次2 h，回流结束后将得到的混合液进行离心，取上清液进行抽滤，将抽滤后得到的液体进行旋蒸，待旋蒸瓶内的水分全部旋出，将其放入抽真空箱24 h，最终得到较为纯净的杜仲干燥粉末。以上药物提取在山东省科学院药物化学实验室完成并检测。

1.2 仪器

北京爱生公司斑马鱼养殖系统，Viewpoint公司Zebrabox斑马鱼行为分析仪；罗氏有限公司实时荧光定量PCR仪器、蔡司光学有限公司荧光显微镜、伯乐生命医学产品有限公司C1000 Touch梯度PCR仪、基因有限公司超微量分光光度计。

1.3 动物

野生型斑马鱼AB和转基因斑马鱼Vmat: GFP由山东省科学院生物研究所提供，在恒温28 ℃的斑马鱼养殖系统中进行饲养，遵循照明黑暗14 h：10 h的生物节律，定点投食。

2 方法 2.1 杜仲活性成分筛选

在药理学数据库与分析平台TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)，以“杜仲”为关键词对其化学成分进行检索。然后根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug likeness，DL)≥0.18筛选有效活性成分。

2.2 杜仲活性成分潜在靶点收集

在TCMSP中收集杜仲活性成分的相应靶点信息，然后通过Uniprot数据库进行分析转化，获取与活性成分作用的相关靶点(人源)。

2.3 PD疾病相关靶点的筛选与收集

以“Parkinson′s disease”为关键词，在DISGENET数据库(http://www.disgenet.org/)中进行检索，收集PD相关疾病靶点，筛选条件为：得分(score值)＞0.1。

2.4 杜仲活性成分-潜在靶点-PD疾病靶点网络构建

根据TCMSP数据库筛选出与杜仲活性成分相关的潜在靶点，利用cytoscape 3.7.2软件绘制出杜仲活性成分-潜在靶点网络图，再将其结果与PD疾病靶点进行比对，生成杜仲活性成分-PD疾病网络图，并利用FUNRICHNEW.exe绘制杜仲和PD共有靶点的韦恩图。

2.5 蛋白质相互作用网络构建(protein-protein interaction，PPI)

在STRING数据库(http://string-db.org/cgi/inputPl)输入杜仲和PD共有的交集靶点蛋白名称，获取交集靶点蛋白信息，收集数据导入Cytoscape 3.7.2软件，根据Drgee值拓扑分析构建出PPI网络图。

2.6 杜仲对治疗PD靶点蛋白的GO功能富集分析和KEGG通路富分析

为了表明杜仲的药物靶蛋白在基因功能中的作用，利用Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html)对PPI网络中筛选出的核心靶点进行GO功能富集分析。之后使用Metascape对KEGG通路富集分析进行筛选，探讨其缓解PD的作用通路并进一步对富集信号通路进行分析，获得各通路相关网络图。

2.7 动物实验方法 2.7.1 实验分组及处理

上午10时将1 dpf(day post fertilization，dpf)的胚胎进行脱膜处理，脱膜后的斑马鱼用养鱼水反复冲洗2-3次，洗掉多余的脱膜剂。放入孵育箱2-3 h，使其适应温度。本实验分为以下3组: 空白对照组、50 μmol·L^-1 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-terahydropyridine，MPTP)处理组、50 μmol·L^-1 MPTP与25 mg·L^-1的杜仲共处理组。每日按时换药，换完药后放入培养箱进行培养。

2.7.2 行为学监测

在6 dpf时，用48孔板进行斑马鱼行为学实验，每孔1条，放入Zebrabox斑马鱼行为分析仪中，先使其适应环境10 min。之后开始检测，检测时间为20 min。运用Zeblab软件进行数据处理，计算每条鱼游动总距离和平均速度。

2.7.3 斑马鱼脑内多巴胺神经元检测

本实验从1 dpf时给药，连续给药3 d，在3 dpf时用蔡司显微镜观察转基因斑马鱼Vmat：GFP多巴胺神经元的发育情况。

2.7.4 荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)

在6 dpf时，每组选取30条斑马鱼幼鱼进行qRT-PCR检测，将斑马鱼按组别放入EP管中，用清水冲洗2-3次，洗去多余的药物残留，最后将EP管中的水全部吸出，加入裂解液，在破碎机中研磨，使其完全裂解，然后将研磨后的裂解物放入离心机中离心，取上清液。RNA提取后，利用超微量分光光度计检测所有组RNA的浓度，之后对RNA进行反转，将反转得到的cDNA进行稀释，然后加入相应的引物用实时荧光定量PCR仪对各个基因进行扩增。扩增结束后，计算各组基因的相对表达量。

2.7.5 统计学处理

利用Graphpad prism 7.0软件对实验结果进行One-way ANOVA检验，并以x±s表示。

3 结果 3.1 杜仲抗PD有效成分及与PD靶点

应用TCMSP数据分析平台对杜仲活性成分进行收集，以类药性五原则、OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件。筛选结果去除重复项后，共得到26个杜仲有效活性成分(Tab 1)，包括β-谷甾醇(beta-sitosterol)、槲皮素(quercetin)和β-胡萝卜素(beta-carotene)等。通过DISGENET数据库检索“Parkinson′s disease”，共挖掘到359个PD靶点。最终得到杜仲抗PD的潜在作用靶点共33个(Fig 1)，包括DRD1、DRD2、DRD3等。

3.2 杜仲抗PD作用靶点PPI网络

通过STRING数据库对筛选出的杜仲抗PD的33个潜在作用靶点进行分析，获取靶点相互作用信息(Fig 2)，得到33个节点和189条边，提示杜仲抗PD的多靶点、多通路的作用特点。

3.3 GO功能富集分析

对杜仲抗PD潜在靶点进行GO功能富集分析，共富集到41条结果，生物过程方面包括调节神经递质(regulation of neurotransmitter levels)，分子功能方面涉及多巴胺神经受体活性(dopamine neurotransmitter receptor activity)(Tab 2)，提示多巴胺能神经系统的调节可能参与杜仲抗PD功能。

3.4 KEGG通路富集分析结果

共富集得到10条通路与杜仲改善PD相关，包括癌症的途径(Pathways in cancer)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、铂耐药(platinum drug resistance)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、多巴胺能突触(dopaminergic synapse)等(Tab 3和Fig 3)。值得注意的是，多巴胺能突触相关信号通路与PD密切相关。

3.5 杜仲改善斑马鱼PD样症状——行为学验证

斑马鱼PD模型行为会表现出与PD患者类似的运动迟缓等现象，为了验证杜仲的抗PD活性，本研究利用行为学进行验证，结果如Fig 4。Fig 4A表示不同实验组(n=10)斑马鱼游动的总距离，与空白对照组相比，造模组斑马鱼的游动距离明显减少，游动速度也明显降低(Fig 5B)；与造模组相比，杜仲处理组的游动总距离明显增加(Fig 4A，杜仲处理组所示)，游动速度明显变快(Fig 4B，杜仲处理组所示)，差异具有统计学意义。研究结果显示，杜仲可以改善由MPTP造成的斑马鱼PD样行为。

3.6 杜仲改善斑马鱼PD样症状——多巴胺神经元验证

多巴胺神经元损伤是PD特征之一，本研究通过观察斑马鱼脑内多巴胺神经元损伤情况来验证杜仲抗PD的活性(Fig 5)(n=8)。与空白对照组相比，造模组斑马鱼脑内多巴胺神经元长度明显减少；与造模组相比，杜仲处理组斑马鱼脑内的多巴胺神经元长度有所恢复。该实验表明，杜仲可以缓解斑马鱼脑内多巴胺神经元的损伤。本研究以行为和多巴胺神经元两个指标对杜仲缓解PD样症状进行验证，结果提示杜仲具有抗PD活性。

3.7 杜仲改善斑马鱼PD样症状——DA相关基因验证

为进一步验证和挖掘杜仲抗PD活性的作用机制，本研究利用qRT-PCR对不同实验组的PD相关基因drd1、drd2和drd3进行检测(Fig 6)。与空白对照组相比，造模组中的drd1、drd2和drd3的表达明显下调，具有统计学意义；与造模组相比，杜仲处理组中drd1和drd2的表达明显增加，drd3虽不具有统计学意义，但也出现了上调的趋势。研究结果表明，杜仲可以对DA相关基因的异常表达进行调控。

4 讨论

通过网络药理学方法，本研究筛选得到了26个杜仲有效成分，构建杜仲活性成分-潜在靶点网络，并从中预测β-谷甾醇、槲皮素和β-胡萝卜素为杜仲抗PD的重要有效成分。以往研究表明^[6]，β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化和神经保护功效。槲皮素可以通过降低神经元活性氧水平，增加谷胱甘肽的表达发挥抗氧化功能，从而起到保护神经的作用^[7]。研究发现^[8]，PD患者血清中α-胡萝卜素和β-胡萝卜素水平均明显降低，且与病情严重程度相关，推测PD的发生与血清中类胡萝卜素的水平有关。因此上述成分可能作为杜仲改善PD的有效药物成分。

本课题组前期研究发现^[9-10]，斑马鱼PD模型在运动能力方面出现运动迟缓、游动总距离降低、游动速度变慢等现象。杜仲叶显著降低了斑马鱼PD模型脑中多巴胺能神经元和神经血管的丢失，改善了运动障碍，减少了脑部细胞凋亡数量。机制研究发现杜仲叶可以激活自噬，促进α-syn降解，从而减轻斑马鱼PD样症状。有研究发现^[11]，MPTP诱导的小鼠PD模型与健康组小鼠相比，自主运动能力、协调性和耐受力都有所下降。崔爽等^[12]研究发现，在6-羟基多巴胺诱导的大鼠PD模型中，杜仲可以减轻氧化应激反应，使多巴胺能神经元细胞减少。本研究结果显示，造模组多巴胺神经元长度比对照组明显减少，运动距离和运动速度明显降低，造模成功，杜仲处理组与造模组相比多巴胺神经元长度显著增长，游动总距离明显增加，游动速度明显变快。研究结果表明，杜仲可以缓解多巴胺神经元损伤，改善斑马鱼PD样行为。斑马鱼多巴胺神经元分布在中脑中缝核、室旁器官神经丛、前直肠神经丛、下丘脑中间神经丛等^[13]，本研究以中缝核区多巴胺神经元的长度作为评价指标，对该多巴胺神经元区域长度进行了统计分析，但未开展神经元数量、突触密度、树突和轴突等指标的检测，今后我们将进一步完善这方面的不足。

PPI结果提示，杜仲抗PD作用是通过多靶点、多通路实现的，且各靶点之间存在密切的联系。例如，肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1(IL-1B)之间存在相互作用。有研究显示^[14]，炎性因子IL-1B可以刺激TNF产生，使炎性反应加重。此外TNF-α还可诱导IL-1、IL-6等炎性因子激活。B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和半胱氨酸蛋白酶(CASPASE-3)之间具有相互作用关系^[15]，Bax/Bcl-2的表达比率决定着细胞凋亡的进程，其比值增加会将细胞凋亡的关键因子caspase-3激活。另有研究显示^[16]，蛋白激酶B(AKT)和糖原合成酶-3(GSK-3β)之间相互作用，AKT的激活可以促进GSK-3β的表达。

杜仲抗PD的GO富集分析结果显示，杜仲具有调节神经递质水平、多巴胺神经递质受体活性等作用。KEGG通路富集分析结果发现，杜仲抗PD与多巴胺能突触这一通路有关。通过上述结果推测，多巴胺能神经系统与杜仲改善PD症状紧密相关。PPI显示，各靶点之间存在着紧密相关的联系，其中，DRD1、DRD2和DRD3是与多巴胺能神经系统密切相关的调节因子。DR主要与DA结合，激活DR能够调节轴突结构，保持大脑正常功能。DR广泛分布于中枢神经系统等众多多巴胺神经通路中，通过影响神经递质的释放以及释放频率等来调节神经元的兴奋性^[17]，与PD紧密相关。以往研究发现，DRD1和DRD2介导的多巴胺能信号对认知、运动和神经内分泌功能等具有重要影响，DRD3与思维、认知等功能相关^[18]。本实验通过qRT-PCR对杜仲抗PD机制进一步检验，与造模组相比，杜仲处理组斑马鱼drd1和drd2水平明显上调，而drd3虽有上调趋势，但无统计学意义，提示杜仲改善PD症状可能主要通过调节drd1和drd2发挥作用。

综上所述，本研究通过网络药理学方法，分析了杜仲有效成分，预测了杜仲抗PD的作用靶点，绘制了杜仲抗PD靶点的生物过程富集分析，通过斑马鱼行为学和体内实验进行验证，揭示杜仲可以缓解斑马鱼PD样症状，并且与多巴胺能神经系统密切相关。这一发现为后续杜仲有效成分改善PD症状研究提供了新方向新思想。