2. 广西壮族自治区人民医院;
3. 广西医科大学附属肿瘤医院;
4. 广西医科大学附属口腔医院;
5. 广西壮族自治区卫生健康委员会口腔感染性疾病防治重点实验室，广西 南宁 530021
2. People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region;
3. Dept of Pharmacy, Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University;
4. Dept of Pharmacy, College & Hospital of Stomatology, Guangxi Medical University;
5. Guangxi Health Commission Key laboratory of Prevention and Treatment for Oral Infectious Diseases, Nanning 530021, China
随着人类生活水平的不断提高，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)已经成为严重影响人类健康生活质量的公共卫生问题，而且T2DM的发病呈现逐年年轻化[1]。T2DM是一种病因复杂的慢性全身性疾病，以胰岛素抵抗、血液中葡萄糖水平升高和胰岛β细胞功能障碍为主要特征[2]。其中，肥胖是导致T2DM的主要影响因素之一，高水平的游离脂肪酸对胰岛β细胞可产生明显毒性作用，并可诱导机体发生胰岛素抵抗。研究表明，长期暴露于高浓度的游离脂肪酸则可导致胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌绝对或相对不足，从而引发糖尿病[3-4]。因此，探讨抑制游离脂肪酸诱导的胰岛功能损伤和胰岛β细胞凋亡的策略，对T2DM的防治具有非常重要的意义。
葛根素(puerarin，PR)是从豆科植物野葛Puerarin Lobata (Wild) Ohwi根部中提取的异黄酮类生物活性成分。在我国已被广泛应用于T2DM、糖尿病肾病、糖尿病心肌病等糖尿病并发症的治疗[5]。前期研究发现，葛根素可明显改善链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠糖尿病前期状态，改善胰腺超微组织损伤[6]。但目前尚未有相关文献明确葛根素对胰岛细胞的体外保护作用机制，因此，本研究将采用体外培养的小鼠胰岛β细胞株(MIN6细胞)，观察葛根素对棕榈酸诱导的MIN6细胞损伤和凋亡的影响，并从NF-κB信号通路及凋亡相关因子的角度探究其可能机制。
1 材料 1.1 实验细胞MIN6细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公司, 货号：CL-0674。
1.2 药品与试剂葛根素注射液(山东方明药业集团股份有限公司，批号：H20033292)、棕榈酸钠(鲲创科技股份有限公司，批号：KCSJ002)、胎牛血清(Gemini公司，批号：A58G00J)、RPMI 1640培养基(美国Giboco公司，批号：8119267)、0.25%含EDTA胰酶(北京索莱宝公司，批号：20201217)、青霉素/链霉素(北京索莱宝公司，批号：20201101)、β-巯基乙醇(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：WH01112009XP)、LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200613)、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200411)、GSH试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200510)、GAPDH多克隆抗体(中国Proteintech公司，批号：10494-1-AP)、NF-κB抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号：CN89330)、p-NF-κB抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号：16)、Bax抗体(中国Proteintech公司，批号：50599-2-lg)、Bcl-2抗体(中国Proteintech公司，批号：26593-1-AP)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(Invitrogen中国公司，批号：VC303853)
1.3 主要仪器二氧化碳培养箱(Thermo Forma公司，型号：31111)、超净工作台(苏州净化设备总厂，型号：1450型)、小型高速冷冻离心机(德国ThermoIEC公司，型号：Micro CL17R)、荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯株式会，型号：奥林巴斯CKX-41)、连续光谱扫描式酶标仪(香港分子仪器公司，型号：SpectraMaxPlus384)、垂直电泳仪(美国Bio-Rad中国有限公司)、双色红外荧光成像系统(美国Li-COR OdysseClx公司)。
1.4 MIN6细胞的培养将MIN6细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中(含1%青霉素-链霉素、50 μmol·L-1 β-巯基乙醇)，置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养，2~3 d换液1次，待细胞生长至接近融合时，用0.25%胰酶消化、传代培养，继续后续实验。
1.5 MTT法检测MIN6细胞的存活率将MIN6细胞制备成单细胞悬液，计数，以5×103/孔的密度接种于96孔板中。待细胞贴壁后，弃去培养基，将细胞分为正常组(Normal control)，模型组(Model control)，葛根素高、中、低剂量组(PR 5、2.5、1.25 mg·L-1)，分别加入相应浓度的含药培养基或完全培养基预处理2 h后，除正常组外，其余各组加入120 μmol·L-1的棕榈酸，共同培养24 h。每孔加入10 μL MTT试剂和90 μL无血清培养基，培养箱培养4 h后，酶标仪490 nm处检测各孔吸光度值(A值)，计算细胞存活率。
1.6 细胞LDH、MDA和GSH的测定细胞分组及药物处理见“1.5”项，各组细胞处理结束后，收集细胞上培养清液，根据LDH含量检测试剂盒说明书，检测并计算细胞上清中LDH含量。采用超声破碎法破碎细胞，细胞破碎完毕后离心取上清，根据MDA含量检测试剂盒和GSH检测试剂盒说明书进行检测和计算。
1.7 细胞AOEB染色及形态观察将对数生长期的细胞按每孔5×104 /孔的密度接种于6孔板中，细胞分组及药物处理见“1.5”项，各组给药处理结束后，弃除完全培养基或含药培养基，用PBS轻柔清洗1遍细胞，每孔再加入500 μL的PBS，然后将配置好的AOEB工作液(将AO和EB两种溶液按照1 ∶ 1混合配置)，5 μL/孔加入各组细胞中，室温避光染色5 min，染色结束后，弃去荧光染液，用PBS清洗1遍细胞，采用倒置荧光显微镜观察细胞凋亡情况并拍照记录。
1.8 Western blot法检测各组细胞Bcl-2、Bax、NF-κBp65蛋白表达情况细胞分组及药物处理见“1.5”项，各组细胞处理结束后，用PBS冲洗1~2次，各组加入含PMSF的RIPA裂解液裂解细胞，12 000 g离心15 min，取上清即为各组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，根据目的蛋白分子量的大小采用不同浓度的分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜，TBST溶液洗膜3次后，4 ℃冰箱孵育按1 ∶ 500或1 ∶ 1 000稀释的一抗过夜，TBST重新洗膜3次，每次5 min室温摇床孵育加HRP标记的山羊兔二抗0.5~1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，双色红外荧光成像系统曝光扫膜，以GAPDH作为内参蛋白校正，实验结果用ImageJ分析软件进行灰度值分析。
1.9 统计学分析采用SPSS 17.0统计分析，两组计量资料比较采用t检验、多组比较采用单因素方差分析。所有实验数据均采用x±s表示。
2 结果 2.1 葛根素对MIN6细胞存活率的影响120 μmol·L-1棕榈酸孵育MIN6细胞24 h后可以诱导MIN6细胞损伤(P < 0.01)；与模型组相比，不同浓度葛根素预处理2 h后，120 μmol·L-1棕榈酸共同孵育24 h可减轻棕榈酸诱导的细胞损伤(P < 0.01或P < 0.05)。提示葛根素可有效改善棕榈酸诱导的细胞损伤(Tab 1)。
| Group | Dose/mg·L-1 | Cell viability |
| Normal control | 0 | 1.00±0.02 |
| Model control | 0 | 0.46±0.04## |
| PR | 5 | 0.71±0.03** |
| 2.5 | 0.57±0.02** | |
| 1.25 | 0.49±0.01* | |
| ##P < 0.01 vs control；*P < 0.05，**P < 0.01 vs model | ||
结果显示，模型组LDH释放量，MDA含量明显增加，GSH活性明显下降(P < 0.01或P < 0.05)，说明此时棕榈酸对MIN6细胞造成了损伤。当加入不同浓度葛根素预处理2 h后, 120 μmol·L-1棕榈酸共同孵育24 h时，随着葛根素浓度的增加，MIN6细胞中LDH释放量呈现明显(P < 0.01或P < 0.05)剂量依赖性下降趋势，葛根素高、中剂量组MDA含量明显降低，GSH活性明显增加(P < 0.01或P < 0.05)。结果表明，葛根素能够减轻棕榈酸造成的细胞损伤(Tab 2)。
| Group | Dose/ mg·L-1 | LDH/ U·L-1 | MDA/ μmol·g-1 Pro | GSH/ μmol·g-1 Pro |
| Normal control | 0 | 17.06±6.48 | 6.70±0.43 | 5.97±0.21 |
| Model control | 0 | 51.32±4.30## | 9.24±1.25# | 3.89±0.57## |
| PR | 5 | 23.00±7.04** | 6.02±1.24** | 5.63±0.39** |
| 2.5 | 29.97±8.16** | 6.46±0.76* | 4.71±0.14 | |
| 1.25 | 38.61±1.55* | 7.25±0.97 | 4.08±0.18 | |
| #P < 0.05，##P < 0.01 vs control; *P < 0.05，**P < 0.01 vs model | ||||
如Fig 1所示，正常组细胞生长良好，贴壁情况良好，呈现亮绿色荧光，模型组细胞出现凋亡，发出橘红色荧光，对于葛根素给药组，高剂量组的呈现黄绿色荧光，中剂量开始出现早期凋亡细胞，呈现橘黄色荧光，低剂量组坏死细胞最多，呈现橘红色荧光。结果提示，葛根素可以改善棕榈酸引起的MIN6细胞凋亡。
|
| Fig 1 Effects of PR on apoptosis of palmitic acid-induced MIN6 cells(200×) A: Normal control; B: Model group; C: PR 5 mg ·L-1; D: PR 2.5 mg·L-1; E: PR 1.25 mg·L-1 |
各组细胞中目的蛋白表达结果如Fig 2所示。与正常组相比，模型组中NF-κB p-p65、Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调(P < 0.01)；与模型组相比，葛根素高、中剂量组NF-κB p-p65、Bax蛋白表达下调，Bcl-2蛋白表达上调(P < 0.01或0.05)。提示葛根素能减少炎症因子NF-κB p-p65蛋白和促凋亡因子Bax蛋白的表达，同时促进抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达。
|
| Fig 2 Effects of PR on Bax, Bcl-2, p65 and p-p65 expression of palmitic acid-induced MIN6 cells A: Normal control; B: Model group; C: PR 5 mg ·L-1; D: PR 2.5 mg·L-1; E: PR 1.25 mg·L-1. ##P < 0.01 vs Control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model group |
T2DM的发病因素众多，近年来，脂毒性在T2DM的发生发展中的作用受到广泛关注。研究表明，长期暴露于高水平的游离FFA中，一方面会减少葡萄糖刺激的胰岛素分泌，引起胰岛素抵抗; 另一方面可诱导胰岛β细胞发生凋亡，激活炎症因子，导致胰岛细胞损伤[7-8]。因此，抑制脂毒性诱导的胰岛细胞损伤有望成为治疗T2DM的有效途径之一。本研究采用棕榈酸作为造模刺激物，从细胞水平来探讨葛根素对脂毒性诱导的胰岛β细胞的作用。实验结果表明，MTT法、LDH、MDA和GSH试剂盒均提示葛根素具有改善棕榈酸引起的MIN6细胞损伤的作用，AOEB荧光染色法结果提示葛根素具有抑制MIN6细胞凋亡的作用。
NF-κB是重要的核转录因子之一，在细胞炎症、损伤中具有重要的调节作用[9]。当刺激因素激活后，NF-κB核转移过程增强，其与相应的靶基因结合，参与调控一系列炎症因子等促炎基因的表达，最终导致细胞功能受损甚至凋亡的发生。大量研究显示[10-12]，NF-κB信号通路的激活与糖尿病发生的胰岛β细胞凋亡及损伤密切相关，抑制NF-κB信号通路的活化可以有效保护胰岛β细胞。Western blot结果表明，与正常组相比，模型组NF-κB p-p65表达明显上调，说明造模成功。与模型组相比，葛根素高剂量组NF-κB p-p65表达明显下调，提示葛根素有较好的抑制NF-κB通路活性，改善MIN6细胞损伤的作用。
β细胞凋亡在T2DM的发生发展过程中起到重要的作用，T2DM患者的胰岛β细胞数量明显减少[13-14]。Bcl-2家族的凋亡相关基因Bcl-2、Bax是调控胰岛β细胞凋亡的重要因子。其中，Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因蛋白，为线粒体膜的整合蛋白，可通过线粒体途径、内质网途径抵抗细胞凋亡；Bax是促进细胞凋亡的基因蛋白，当接收到凋亡信号刺激被激活后，分子构象发生改变，形成Bax/Bax二聚体，进而促进细胞凋亡[15-16]。Western blot结果显示，与正常组相比，模型组Bax表达明显上调，Bcl-2表达明显下调，说明造模成功。与模型组相比，葛根素高、中剂量组Bax表达明显下调，Bcl-2表达明显上调，提示葛根素有明显的抑制棕榈酸引起的MIN6细胞凋亡的作用。
综上所述，葛根素可改善棕榈酸诱导的胰岛MIN6细胞的氧化应激状态，进而抑制凋亡和炎症反应而改善胰岛细胞的功能。因此，葛根素对胰岛MIN6细胞的保护机制可能与调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达及抑制NF-κB信号通路有关。
| [1] |
Taylor R, Al-Mrabeh A, Sattar N. Understanding the mechanisms of reversal of type 2 diabetes[J]. Lancet Diabetes Endocrinol, 2019, 7(9): 726-36. doi:10.1016/S2213-8587(19)30076-2 |
| [2] |
Zheng Y, Ley S H, Hu F B. Global aetiology and epidemiology of type 2 diabetes mellitus and its complications[J]. Nat Rev Endocrinol, 2018, 14(2): 88. doi:10.1038/nrendo.2017.151 |
| [3] |
Chen C, Cohrs C M, Stertmann J, et al. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis[J]. Mol Metab, 2017, 6(9): 943-57. doi:10.1016/j.molmet.2017.06.019 |
| [4] |
Oh Y S, Bae G D, Baek D J, et al. Fatty acid-induced lipotoxicity in pancreatic beta-cells during development of type 2 diabetes[J]. Front Endocrinol, 2018, 9: 384. doi:10.3389/fendo.2018.00384 |
| [5] |
Gao S, Li L, Li L, et al. Effects of the combination of tanshinone IIA and puerarin on cardiac function and inflammatory response in myocardial ischemia mice[J]. J Mol Cell Cardiol, 2019, 137: 59-70. doi:10.1016/j.yjmcc.2019.09.012 |
| [6] |
Wu K, Liang T, Duan X, et al. Anti-diabetic effects of puerarin, isolated from Pueraria lobata (Willd.), on streptozotocin-diabetogenic mice through promoting insulin expression and ameliorating metabolic function[J]. Food Chem Toxicol, 2013, 60: 341-7. doi:10.1016/j.fct.2013.07.077 |
| [7] |
郝慧瑶, 张荣金, 张芳, 等. PI3K/Akt通路在棕榈酸诱导的胰岛β细胞损伤中的作用[J]. 现代中西医结合杂志, 2021, 30(9): 919-22, 95. Hao H Y, Zhang R J, Zhang F, et al. Effect of PI3K/Akt pathway in the islet β-cell injury induced by palmitic acid[J]. Mod J Integr Tradit Chin West Med, 2021, 30(9): 919-22, 95. doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2021.09.002 |
| [8] |
唐保露, 郑宇辰, 张叶明, 等. 四君子颗粒含药血清对棕榈酸诱导的MIN6细胞凋亡的影响[J]. 中成药, 2020, 42(8): 2031-6. Tang B L, Zheng Y C, Zhang Y M, et al. Effects of Sijunzi Granules medicated serum on MIN6 cell apoptosis induced by palmitic acid[J]. Chin Tradit Pat Med, 2020, 42(8): 2031-6. doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2020.08.012 |
| [9] |
Zhang Q, Lenardo M J, Baltimore D. 30 years of NF-κB: A blossoming of relevance to human pathobiology[J]. Cell, 2017, 168(1-2): 37-57. doi:10.1016/j.cell.2016.12.012 |
| [10] |
Mitchell J P, Carmody R. NF-κB and the transcriptional control of inflammation[J]. Int Rev Cell Mol Biol, 2018, 335: 41-84. |
| [11] |
来千惠, 熊青, 吴贵军, 等. 异鼠李素对高糖高脂诱导胰岛β细胞损伤保护作用的研究[J]. 中国糖尿病杂志, 2020, 28(6): 461-6. Lai Q H, Xiong Q, Wu G J, et al. Protective effect of Isorhamnetin on injury induced by glucolipotoxicity in islet beta cells[J]. Chin J Diabetes, 2020, 28(6): 461-6. doi:10.3969/j.issn.1006-6187.2020.06.012 |
| [12] |
Binker-Cosen M J, Richards D, Oliver B, et al. Palmitic acid increases invasiveness of pancreatic cancer cells AsPC-1 through TLR4/ROS/NF-κB/MMP-9 signaling pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 484(1): 152-8. doi:10.1016/j.bbrc.2017.01.051 |
| [13] |
中国2型糖尿病防治指南(2017年版) [J]. 中华糖尿病杂志, 2018, 10 : 4-67. Guidelines for the prevention and control of type 2 diabetes in China(2017 Edition) [J]. Chin J Diabetes Mellit, 2018, 10 : 4-67. |
| [14] |
Gurzov E N, Ke P C, Ahlgren U, et al. Novel strategies to protect and visualize pancreatic β cells in diabetes[J]. Trends Endocrinol Metab, 2020, 31(12): 905-17. doi:10.1016/j.tem.2020.10.002 |
| [15] |
Chen Q, Xu H, Xu A, et al. Inhibition of Bcl-2 sensitizes mitochondrial permeability transition pore (MPTP) opening in ischemia-damaged mitochondria[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0118834. doi:10.1371/journal.pone.0118834 |
| [16] |
张芸绮, 蔺晓菁, 王妙然, 等. 橙皮苷对高脂高糖诱导胰岛β细胞损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2021, 37(5): 652-6. Zhang Y Q, Lin X J, Wang M R, et al. The protective effect of hesperidin on injury induced by glucolipotoxicity in islet beta cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2021, 37(5): 652-6. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2021.05.011 |