结肠癌作为常见的消化道恶性肿瘤，发病率逐年增加，且其死亡率更是高居恶性肿瘤第四位^[1]。西医对于结肠癌的治疗手段单一，以手术、放疗和化疗为主，后期副作用较大。中医对结肠癌的认识在古今有两种不同的看法，《黄帝内经》将结肠癌命名为“积证”，主要原因是卫气停留于结肠不能返回，积液久停，合而为肠瘤，以气滞为主要原因^[2]。现代中医认为，癌毒源于内，在肠道瘀结，脏腑通降失常，无力抗癌毒，以血瘀为主^[3-4]。中医对于结肠癌的治疗复方有多种，如四君子汤、加味乌梅汤、黄芩汤等^[5]。丹参饮符合古今病因辩证，丹参有活血祛瘀之功，檀香具行气温中之效，可能对结肠癌的治疗有一定效果。

丹参饮由中药丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)、檀香(Santalum album L)和砂仁(Amomum villosum Lour)组成，具有活血行气止痛的功效，主治气滞血瘀证，目前临床上主要用于心血管和胃肠道系统的治疗^[6]。王程等^[7]建立CT-26结肠癌肝转移小鼠模型，丹参饮(1 g生药/mL)干预该模型可抑制结肠癌转移，其机制可能与抑制肝脏肿瘤中端粒酶的表达有关。王学良^[8]采用丹参饮干预结肠癌肝转移小鼠模型，发现丹参饮对肿瘤转移过程有明显的抑制作用，其作用机制与调节NF-κB和EGFR的表达有关。尽管当下对丹参活性成分的研究较多，但对中药复方丹参饮的研究较少。网络药理学利用网上平台大数据分析，通过药物有效成分对应靶点和疾病靶点，构建中药-成分-靶点-疾病网络关系，并以分子对接检验结合效果，进而分析潜在的治疗机制。

1 材料与方法 1.1 丹参饮活性成分和结肠癌靶点筛选

丹参饮作用靶点筛选：在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中查找，得到复方丹参饮中丹参、檀香、砂仁的所有有效活性成分，以生物利用度OB值≥30%，类药性DL≥0.18为筛选条件，分选出中药复方丹参饮的主要活性成分。以TCMSP数据库查找丹参饮各味药的相关作用靶点，再通过Uniprot数据库(http//www.Uniprotorg/)将target name转化为symbol name。

结肠癌作用靶点筛选：在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中查找Colon Cancer疾病相关靶点，以得分≥1.0为筛选条件，得到相应疾病靶点。

1.2 药物与疾病相关靶点交集的构建

为了进一步剖析复方丹参饮与结肠癌的关系，依托R4.0.2软件，绘制丹参饮与结肠癌靶点的韦恩图。再以共同靶点为筛选条件，找出丹参饮中主要的相关活性成分。并以Cytoscape3.7.0软件为依托，结合上述得到的各靶点、疾病以及中药有效成分的关系，构建中药-活性成分-靶点-疾病的网络关系图。

1.3 PPI蛋白互作网络关系图的构建

在STRING数据库(http://string-db.org/)中，将疾病和中药成分共有的靶点导入进行搜索，物种选择为“Homo sapiens”，隐藏蛋白网络中游离的节点，设置最低互作分值为0.4，构建靶点蛋白的可视化互作网络图。

1.4 GO功能与KEGG通路富集分析

通过Biocondoctor数据库(http://www.bioconductor.org/)下载安装基因本体论富集分析(Gene Ontology，GO)和信号通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的语言包到R4.0.2软件，然后依托R4.0.2绘制出GO功能和KEGG通路富集气泡图、柱状图以及相应的信号通路图。

1.5 重要靶点和主要活性成分的分子对接

通过PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载通路中重要蛋白AKT1的3D蛋白结构，通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载主要活性成分木犀草素(Luteolin)和丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)的3D结构，通过Sybyl X2.0软件进行Surflex-Dock分析，Total score为输出构象的总打分函数, 涉及碰撞打分(crash)、极化打分(polar)。本文将Total score打分高于5.000的输出构象判定为较好的输出构象，并用Pymol软件处理对接结果。

2 结果 2.1 丹参饮中活性成分与靶点筛选

通过TCMSP数据库平台，查找得到丹参饮的所有化学成分。其中丹参有202个化学成分，檀香有70个，砂仁有165个。以OB>30%，DL>0.18为筛选条件过滤，共得到丹参饮中药物的活性成分78个，其中丹参65个，檀香3个，砂仁10个(Tab 1)。

2.2 药物-疾病有效成分靶点筛选

将TCMSP数据库中丹参饮有效成分对应的靶点蛋白通过Uniprot数据库进行转化，共得到基因靶点142个。利用GeneCards数据库，以得分>1为筛选条件，得到3 239个结肠癌靶点。利用R4.0.2软件，绘制丹参饮-结肠癌靶点韦恩图(Fig 1)，获得中药有效成分和疾病共同靶点105个，根据靶点筛选获得含有相应靶点的中药有效成分69个。

2.3 中药-活性成分-靶点-疾病网络关系构建

将疾病和复方中共有靶点作为研究对象，再将相应靶点与复方中的有效成分和单味药对应关系，有效成分与相关靶点关系，以及靶点与疾病关系导入Cytoscape3.7.0软件。对药物及其对应的有效成分，靶点以及疾病进行优化，获得中药-成分-靶点-疾病网络关系。该网络由178个节点，888条边组成，其中木犀草素是丹参和檀香的共有成分，重要性最强。在丹参中，与靶点关联度居前三的是丹参酮ⅡA、丹参新醌D和二氢丹参内酯。在檀香中，除木犀草素外，与靶点关联最强的是异鼠李素。在砂仁中，β-谷甾醇作为丹参和砂仁的共有成分，其与靶点关联度最强，其次是豆甾醇。总结来说，木犀草素和丹参酮ⅡA与靶点相互作用最多，研究价值相对较大。

2.4 PPI蛋白相互作用网络构建

在STRING数据库中输入药物和共有的105个有效靶点，设置物种为“Homo sapiens”，得到PPI蛋白相互作用网络关系图(Fig 2)。并分选出链接节点最多的20个靶点基因，根据其连线数做出蛋白互作网络核心基因的柱状图(Fig 3)。其中主要受影响的靶点基因有AKT1、Tp53、IL-6等，这为探寻中药复方丹参饮治疗结肠癌的机制提供深远的参考价值。

2.5 GO功能与KEGG通路富集分析

以Biocondoctor数据库中GO和KEGG相应的语言包，依托R语言，得出主要的GO功能柱状图(Fig 4)和KEGG富集通路气泡图(Fig 5)。其中GO功能分析结果从高到低为DNA-binding transcription factor binding、RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding、ubiquitin-like protein ligase binding、ubiquitin protein ligase binding、cytokine receptor binding。KEGG通路富集分析结果从高到低为PI3K/AKT signaling pathway、Hepatitis B、Human cytomegalovirus infection、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection。同时以PI3K/AKT信号通路为主要影响对象，得出相应通路蛋白变化情况的通路图(Fig 6)。根据中药-成分-靶点-疾病网络关系、PPI蛋白互作和KEGG通路富集的结果，选择AKT1作为后续分子对接的靶点蛋白。

2.6 AKT1与木犀草素和丹参酮ⅡA分子对接

利用SybylX2.0软件，将木犀草素和丹参酮ⅡA分别与AKT1进行分子对接，发现木犀草素与AKT1对接的Total score、crash、polar分别为8.649 2、-0.945 2、6.543，有强烈的结合活性。丹参酮ⅡA与AKT1对接的Total score、crash、polar分别为5.250 7、-0.107 8、1.294 7。通过Pymol软件将分子对接结果优化，如图可知木犀草素和AKT1中的GLU-17、ARG-15、THR-87、ASN-54和GLN-79这5个氨基酸存在较强的氢键作用(Fig 7A)。丹参酮ⅡA与AKT1中的LYS-268和SER-205两个氨基酸有较强的氢键作用(Fig 7B)。说明木犀草素和丹参酮ⅡA对丹参饮药效作用的发挥有重要影响，为研究丹参饮对结肠癌的作用机制提供了理论参考。

3 讨论

近年来，随着人们饮食多脂化和人口老龄化的加剧，结肠癌的发病率逐年提升。值得注意的是，我国城镇化的发展对结肠癌的发病率同样影响重大。城市人群脂肪相对摄入量远高于农村，因此其发病率高于农村人群^[9]。本研究结合结肠癌的古今病因辨证，预测丹参饮可能对结肠癌起着一定的治疗作用。结合网络药理学，将丹参饮的有效化学成分和疾病的对应靶点进行整合，建立有效的中药-成分-靶点-疾病网络关系，并通过PPI蛋白互作确定主要核心靶点蛋白，依托R语言完成通路的预测，最后用分子对接确定结果的有效程度。

其中，PPI蛋白互作结果中核心蛋白主要包括AKT1、Tp53、IL-6、VEGFA、MAPK1、CASP3、JUN、MYC、EGFR、STAT3、CCND1、TOS等。Häggblad等^[10]通过研究AKT1、AKT2和AKT1/2基因敲除的结肠癌细胞，发现AKT1和AKT2敲除可以减弱肿瘤细胞的转移和生长。证实核心蛋白AKT1在结肠癌中的重要作用，说明丹参饮可能通过调节上述核心蛋白发挥抗结肠癌活性，然而还需要后续进一步的体内外验证。

从中药-活性成分-靶点-疾病网络关系中可以发现木犀草素和丹参酮ⅡA是丹参饮中的重要活性成分，进一步通过分子对接证实其与关键蛋白AKT1具有相互作用。Kang等^[11]发现木犀草素可以抑制转录抑制因子DNA甲基转移酶的表达，降低Nrf2启动子区域的甲基化，增加5-甲基胞嘧啶双加氧酶与Nrf2启动子的结合，确定了木犀草素抗结肠癌的作用机制。此外，Cyanidin-3-葡萄糖氯化物与木犀草素可协同抑制结肠癌和乳腺癌细胞的生长^[12]。Xue等^[13]发现丹参酮IIA对人结肠癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响与下调mTOR和VEGF表达有关。另有学者^[14]发现丹参酮IIA可以抑制COX-2的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，进而下调VEGF的表达水平，最终抑制结肠癌细胞生长。从中可以看出木犀草素和丹参酮ⅡA对结肠癌细胞有显著的抑制作用，而目前关于两者靶向AKT1的抗肿瘤机制鲜有报道，因此可能是潜在的候选抗结肠癌药物。

此外，KEGG通路分析发现PI3K/AKT信号通路可能是丹参饮治疗结肠癌的关键信号通路。Bishnupuri等^[15]发现结肠肿瘤上皮中PI3K/AKT信号激活显著促进β-catenin核转位、细胞增殖和抗凋亡。Ma等^[16]发现成纤维细胞来源的趋化因子可以促进结肠癌细胞分泌趋化因子CXCL6和CXCL12，并通过PI3K/AKT/mTOR信号通路，协同调节肿瘤转移，因此阻断该途径是结肠癌患者潜在的抗转移治疗靶点之一。此外，趋化因子CXCL12调节PTEN表达，并通过PI3K/AKT信号调节结肠癌细胞的增殖和侵袭能力^[17]，暗示PTEN或PI3K功能的修饰是抑制结肠癌侵袭性扩散的原因所在。人参皂苷Rh2诱导结肠癌细胞SW480凋亡也与抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路有关，其机制可能是通过激活p53和caspase-3活化，下调Bcl-2/Bax比例^[18]。总结以上研究可知，PI3K/AKT信号通路可能是丹参饮治疗结肠癌的关键通路。

综上所述，丹参饮具有活血行气、祛湿止痛的功效，其对结肠癌的治疗或许可以起到一定的积极意义，作用机制可能与调节PI3K/AKT信号通路有关。在世界文化交流日益频繁的大背景下，在中西医结合治疗的大潮流下，中药多靶点、多途径给药的优势彰显无遗。随着各种癌症发病率的日益增多，中药的地位日益显著。然而，对于疾病的攻克和治疗，仍然需要广大研究者的努力探究和挖掘。