肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是由各种病因诱导的慢性肝病所引起的共同病理过程，包括脂肪性肝炎、病毒性肝炎和药物性肝炎等，是肝脏损伤后在修复过程中的一种代偿反应[1]，其主要特点是肝脏受损后，细胞自身修复能力不足，从而导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积及分化为肌成纤维细胞，ECM则主要在活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)中产生，它在HF的致病过程中起关键性作用[2]。HF是一种可逆的创伤愈合过程，但随病症的不断加重，形成难逆性肝硬化，最终导致肝癌，因此寻找有效防治或者缓解HF的治疗靶点及药物，已经成为亟待解决的问题[3]。
MAPK信号转导通路主要包括c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)以及大丝裂原激活蛋白激酶(ERK5/BMK1)4个亚族，其中关于JNK、p38和ERK的研究较多[4]。JNK是参与生物体内各种应激反应的关键分子，p38主要介导炎症和凋亡相关通路，ERK则广泛存在于机体内，参与细胞的增殖和分化[5]。研究显示，在HF发展过程中，JNK、p38、ERK磷酸化水平升高，治疗后则逐渐下降，抑制MAPK信号通路可明显改善HF[6]。
狗肝菜多糖(dicliptera chinensis polysaccharide，DCP)是爵床科植物狗肝菜Dicliptera chinensis(L.)Nees的主要活性成分。本课题组前期研究发现, DCP具有抗炎、抗氧化实现保肝作用[7-8]；且发现DCP能够通过减少炎症因子的释放发挥抗HF的作用，对DMN诱导的HF具有显著的缓解作用[9]。综上所述，MAPK通路与HF的发生发展及炎症反应密切相关，DCP又可通过减轻炎症来抑制HF，因此推测DCP抗HF与抑制MAPK通路的激活有关。故本实验在前期研究明确DCP抗HF的基础上，通过观察DCP对MAPK通路及相关炎症因子的影响，探究DCP抗HF的作用机制。
1 材料 1.1 实验动物SPF级SD大鼠60只，6~8周龄，体质量(170~210) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号: SCXK(湘)2015-0010。饲养于湿度40%~55%、温度(22~26)℃、12 h光暗循环条件下，自由饮食饮水。
1.2 药物与试剂2, 4-二甲基亚硝胺(2, 4-dimethylnitrosamine，DMN)溶液购自天津市化学试剂研究所(批号：010110)；秋水仙碱购自昆明制药集团股份有限公司(批号：1909A)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、血清碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、总胆红素(TBIL)试剂盒、透明质酸酶(HA)试剂盒、层粘连蛋白(LN)试剂盒、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)试剂盒、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号分别为：20190516、20190503、20190428、20190513、20190603、20190610、20190515、20190521)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、Masson染色试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司(批号依次为：MB9898-JUL-13D、MA0123-1-DEC-20D)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自南通市碧云天生物科技研究所(批号依次为：P0013B、P0010S、P0015B)；PVDF膜购自美国Millipor公司(批号：ISEQ00010)；TGF-β1、α-SMA、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK蛋白一抗购自英国Abcam公司(批号依次为：GR121504-3、GR105729-1、ab207477、ab176645、ab278674、ab31828、ab192591、ab32537)；β-actin蛋白一抗购自无锡傲锐东源生物科技有限公司(批号：17AV0305)；山羊抗鼠、山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司(批号依次为：112438、133599)。
1.3 仪器ELx800Epoch酶标仪(美国Bio-Tek公司)、CFX96荧光定量PCR(美国Bio-Rad公司)、H2050R台式高速大容量冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)、电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)、OLYMPUS BX51显微镜(日本Olmpus公司)、Tanon-4100全自动化学发光图像分析检测系统(上海Tanon公司)。
2 方法 2.1 DCP的制备爵床科狗肝菜Dicliptera chinensis (L.) Ness.的全草购自广西桂林市中药材市场，经广西中医药大学药用植物学教研室韦松基教授鉴定为正品。干燥的狗肝菜全草切碎后于石油醚中回流脱脂2 h，接着沸水提取并浓缩，在4 ℃下用95%酒精醇沉12 h。用Sevag法除去蛋白。抽滤，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮进行洗涤，得狗肝菜粗多糖。将所得物溶于水，于DE52型树脂层析柱中进行洗脱，真空干燥得浅黄色粉末状DCP[10]。
2.2 造模及给药60只大鼠被随机均分成6组，分别为对照组，模型组，秋水仙碱组(0.2 mg·kg-1)和DCP低、中、高剂量组(DCP100、200、300 mg·kg-1)。除对照组外，其他组均腹腔注射(1.6 mL·kg-1) 0.5% DMN溶液。每周3次，8周末完成造模，对照组被灌胃等体积的生理盐水。DCP和秋水仙碱用生理盐水溶解，灌胃给药，每天(8 mL·kg-1)处理1次，共6周[9]。
2.3 血清、组织样本收集末次给药后，用3%的戊巴比妥钠麻醉大鼠，然后收集腹主动脉血液及肝脏。血液经离心机离心后得到血清，贮存在-20 ℃冰箱备用。肝组织500 mg按1∶9加入枸橼酸缓冲液，制成10%的肝匀浆液。肝匀浆液离心后得到的上清液放置在-80 ℃冰箱保存。所有大鼠的左叶肝组织被均分为2份，其中1份在同一位置被剪成约1 cm×1 cm大小的肝组织，放置于4%多聚甲醛中固定，肝组织分别用于HE，Masson染色和免疫组化实验。另1份肝组织放置在-80 ℃被用于RT-PCR和Western blot实验。
2.4 血清样本分析根据ALT、AST、ALP、TBIL试剂盒说明生化法检测血清中ALT、AST、ALP的活性和TBIL的含量；同时，严格按照HA、LN、Ⅳ-C和PCⅢ试剂盒说明书加入血清样品与相关工作液，经气浴后，置于酶标仪上，按试剂盒说明书检测吸光度并计算血清中HA、LN、Ⅳ-C和PCⅢ的含量。
2.5 肝脏样本分析肝脏组织剪碎后，加入相当于肝脏9倍体积的磷酸缓冲液(0.01 mol·L-1，pH7.4)，充分研磨成10%(W/V)匀浆。按照各炎症因子ELISA试剂盒说明书测量肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。
2.6 肝脏病理切片检查 2.6.1 HE染色和Masson染色大鼠的肝组织固定48 h后，在不同浓度的乙醇和二甲苯进行脱水。脱水后的肝组织用石蜡包埋机包埋成肝组织蜡块。然后将肝组织蜡块切成4 μm的切片。按照HE和Masson染色方法对肝组织切片进行染色。置于光学显微镜下，观察肝组织病理变化并拍摄收集图片。
2.6.2 免疫组化将制备好的组织切片于70 ℃中放置30 min，再置二甲苯中10 min脱蜡。首先将切片置于乙醇中脱水，接着用枸橼酸钠抗原修复液进行抗原修复，冷却至室温，再依次使用过氧化氢和牛血清白蛋白。分别孵育一抗a-SMA(1∶200)和TGF-β1(1∶500)12 h，和山羊抗兔IgG二抗(1∶100)30 min。最后，用二氨基联苯胺(DAB)浸泡5 min着色，用苏木精复染，观察表达结果并拍摄收集图片。
2.7 实时荧光定量PCR在各实验组肝脏中加入TRIzol试剂，裂解后得到总RNA。按说明书操作，总RNA被反转录成cDNA。以cDNA为模板在CFX96荧光定量PCR仪上根据检测试剂盒反应条件进行扩增。扩增条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循环40次。依据Ct值计算2-ΔΔCt，以β-actin为参照，计算相对表达量(Tab 1)。
| Genes | Primer | Sequence (5′-3′) |
| TNF-α | Forward | CGTCAGCCGATTTGCTATCT |
| Reverse | CGGACTCCGCAAAGTCTAAG | |
| IL-1β | Forward | TCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTCTGTC |
| Reverse | CAGGCGTGTGCTACCATGCTAG | |
| IL-6 | Forward | CCGGAGAGGAGACTTCACAG |
| Reverse | TCCACGATTTCCCAGAGAAC | |
| β-actin | Forward | GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA |
| Reverse | GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG |
在各实验组肝脏中加入1%的PMSF的RIPA缓冲液，裂解后得到总蛋白。按照BCA担保测定试剂盒说明书检测总蛋白浓度。总蛋白中加入蛋白上样缓冲液，于95 ℃水浴5 min变性蛋白质。用10%SDS-PAGE分离变性蛋白质，冰浴条件下以恒转电流转移到PVDF膜上。将PVDF膜放入5%脱脂奶粉中，于室温下摇床封闭封闭2 h，TBST洗膜后分别于以下抗体4 ℃摇床孵育过夜：JNK(1∶1 000)，p38(1∶1 000)，ERK(1∶1 000)，p-JNK(1∶1 000)，p-p38(1∶1 000)，p-ERK (1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)。次日，TBST洗膜后加入山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)室温孵育2 h。将PVDF膜置于全自动化学发光图像分析系统中，使用Image软件分析条带蛋白灰度，以β-actin为参照，计算蛋白相对表达量。
2.9 数据统计分析所有数据均使用Graphpad Prism 5.0软件进行统计分析, x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。
3 结果 3.1 DCP对HF大鼠肝组织病理形态学的影响对照组大鼠肝脏呈鲜红色，表面光滑，质地柔软且有弹性；模型组肝脏呈暗红色和灰白色相间，表面粗糙，质地较硬且边缘变厚；给药组肝脏病变程度较模型组均有改善，其中DCP高剂量组对组织形态改善程度最大。
进一步HE染色和Masson染色结果显示，对照组大鼠的肝小叶结构清晰，肝细胞结构正常，排列整齐, 且以中央静脉为中心呈现放射状、无明显炎症细胞浸润；模型组大鼠肝小叶结构被破坏，肝细胞排列分布紊乱，出现大量蓝色胶原纤维沉积，被沉积的胶原纤维分割成大小不等的假小叶，出现大量炎性细胞浸润和肝细胞坏死；与模型组相比，各给药组受损的肝小叶结构减轻，亦有不同程度的胶原纤维沉积，炎性细胞浸润减少，其中DCP高剂量组改善程度最大(Fig 1)。
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| Fig 1 Effect of DCP on liver appearance and pathological changes of rats (×200) A: Control group; B: Model group; C: Colchicine group; D: DCP low dose group; E: DCP medium dose group; F: DCP high dose group(similarly hereinafter) |
观察血清生化指标，模型组大鼠肝细胞产生大量ALT、AST、ALP，显示肝细胞严重受损，TBIL的显著升高说明大鼠肝脏摄取和排泄功能出现障碍，以上各指标与对照组相比具有明显差异(P＜0.01)；各给药组与模型组相比，ALT、AST、ALP、TBIL均有不同程度的下降(P＜0.01)，其中DCP高剂量组改善程度最明显(Fig 2)。
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| Fig 2 Effect of DCP on liver function of rats (x±s, n=10) **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs model group(similarly hereinafter) |
肝纤维化4项(HA、LN、Ⅳ-C和PCⅢ)指标常用来作为判断HF病情发展情况和治疗效果，与对照组相比，模型组大鼠肝纤维化四项指标均上升(P＜0.01)；与模型组相比，各给药组肝纤维化四项指标均有不同程度的下降(P＜0.01), 其中DCP高剂量组改善程度最为明显(Fig 3)。
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| Fig 3 Effect of DCP on four indexes of liver fibrosis in rats (x±s, n=10) **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs model group |
免疫组化结果显示，与对照组相比，模型组大鼠肝组织中TGF-β1、α-SMA、表达明显增加，与模型组相比，各给药组肝组织中TGF-β1、α-SMA表达明显降低，其中DCP高剂量组降低程度最为明显；ELISA及RT-PCR结果显示，与对照组相比，模型组大鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达明显增加(P＜0.01)；与模型组相比，各给药组肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达明显降低(P＜0.01)，其中DCP高剂量组降低程度最为明显(Fig 4, 5)。
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| Fig 4 Effect of DCP on TGF-β1 and α-SMA of liver in rats (×200) A: control; B: DMNC; C: colchicine; D: DMN+DPC 100; E: DMN+DCP 200;F: DMN+DCP 300 |
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| Fig 5 Effect of DCP on inflammatory cytokines of liver in rats (x±s, n=10) **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs model group |
Western blot实验结果显示，模型组大鼠p-JNK、p-p38、p-ERK蛋白表达水平明显高于对照组(P＜0.01)。与模型组相比，DCP干预后，肝组织中MAPK通路相关蛋白的表达具有不同程度的降低(P＜0.01)，其中DCP高剂量组改善程度最为明显(Fig 6)。
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| Fig 6 Effect of DCP on MAPK pathway proteins in rats (x±s, n=3) A: control; B: DMNC; C: colchicine; D: DMN+DPC 100; E: DMN+DCP 200;F: DMN+DCP 300. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs model group |
本实验采用的DMN诱导大鼠HF模型，其造模原理是DMN进入肝细胞代谢成乙醛，乙醛引起肝细胞损伤，同时生成的甲基使核酸、蛋白质甲基化导致肝坏死，因其造模时间短、重复性高等特点被作为研究抗HF的首选模型[11]。因此本研究选该造模方法。
当肝脏受损时，由于细胞膜的通透性改变，使位于肝细胞内的ALT、AST、ALP、TBIL溢出进入血液，因此ALT、AST、ALP、TBIL被认为是临床判断肝损伤的重要指标[12]。当肝脏出现纤维化样病变时，HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C随HF的加重不断升高，因此HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C可作为临床判断HF病情发展情况和治疗效果的重要指标[13]。在本次实验中，用DMN处理后的大鼠，肝组织结构被严重破坏，胶原纤维过度积累，并引起血清中ALT、AST、ALP、TBIL、HA、LN、PC-Ⅲ和Ⅳ-C活性或含量的显著增加，以上指标表明HF动物模型的成功建立。经DCP干预，发现不同剂量DCP可以减轻DMN对肝脏造成的肝损伤，减少胶原沉积，表明DCP可减缓DMN诱导的HF进程。
α-SMA在HF过程中起重要作用，能反映HSC细胞的活化水平[14]。TGF-β1则贯穿HF始终，其可通过不断刺激HSC的激活加重HF病症[15]。研究表明，TNF-α是调节HF的重要因素之一，IL-6和IL-1β是具有炎症介质作用的多功能细胞因子，这3个炎症因子的表达对于HF的发展进程具有重要影响[16]；在机体各种纤维化的发展过程中，MAPK信号通路蛋白的表达情况和变化趋势与HF和炎症反应的变化趋势一致[17]。JNK是细胞内调节周期、凋亡、应激的关键分子，参与细胞内的各种应激反应，能够活化HSC细胞的增殖；p38主要调节抗炎和致炎方面的平衡，影响炎症反应的过程，对HSC的增殖具有影响作用；ERK则属于MAPK的经典信号转导途径，机体内许多因子的受体都是由ERK的活化来达到信号转导的目的，在HSC的增殖中起到调节作用[18]。因此，抑制MAPK相关通路的激活可作为缓解HF的有效作用靶点。本研究显示，DCP可明显下调α-SMA、TGF-β1、TNF-α、IL-6和IL-1β，抑制MAPK通路被激活，从而有效改善HF病变。
综上所述，本研究结果表明，DCP具有减轻DMN所诱导的大鼠肝纤维化作用，其机制可能与抑制TGF-β1的表达、抑制MAPK通路及降低炎症因子的释放有关。由于肝纤维化疾病的病因复杂、致病因素多、涉及的细胞信号通路广泛，因此，DCP抗HF的详尽分子作用机制接下来将继续深入。本文研究结果进一步为证实DCP抗HF疗效确切，为将其开发为临床保肝药物提供实验基础。
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