2. 青海民族大学青海省青藏高原植物化学重点实验室，青海 西宁 810007
2. Key Laboratory for Tibet Plateau Phytochemistry of Qinghai Province, Qinghai Minzu University, Xining 810007, China
慢性缺氧性肺疾病(支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化和限制性胸壁异常等)，是世界上最常见的致残和死亡原因之一，低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是导致肺部血管阻力升高的主要机制[1]。HPH的发生发展经历了急性期的低氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)以及慢性期的低氧性肺血管重塑(hypoxic pulmonary vascular remodeling，HPVR)[2]。HPH通常早期难以发现，直到后期出现心力衰竭，如呼吸困难、心悸和下肢水肿等症状才会被诊断治疗[3]。该疾病的发病机制复杂，目前的研究尚未能完全解释其发生发展机制。以往研究发现：肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)内游离钙离子浓度(cytoplasmic free Ca2+ concentration，[Ca2+]i)异常升高是肺血管持续收缩和重塑导致肺动脉高压发生的主要诱因[4-5]。低氧条件下，诸多调节途径参与诱导细胞内Ca2+水平的升高，继而引发细胞钙稳态失衡。一方面，作为PASMCs内最重要和最根本的第二信使，Ca2+不仅参与了HPV的形成和发展过程，也能够通过调节PASMCs的迁徙与增殖，促进HPVR的形成[6-7]; 另一方面，钙信号转导通路在维持肺动脉内皮细胞屏障完整性以及肺动脉内皮细胞释放舒血管物质等过程中都发挥了重要作用[3]。
本文着眼于低氧导致PASMCs钙稳态失衡的作用机制，就近年来的相关研究做一综述。全文共分为3个主要部分：低氧与PASMCs钙稳态失衡; 钙稳态失衡引发HPV的机制; 钙稳态失衡在HPVR中的作用。
1 低氧与PASMCs钙稳态失衡 1.1 低氧-缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)-PASMCs钙稳态失衡低氧可诱导PASMCs中HIF-1的聚集。HIF-1由α和β亚基构成。HIF-lα是氧调节蛋白，为HIF-1的特有组份，而HIF-1β是多种转录因子的共同亚基。常氧下，胞质中HIF-1α易降解。相反，缺氧时HIF-1α的降解受到抑制。HIF-1α在胞质中聚积，并与HIF-1β形成稳定的异二聚体。HIF-1聚积，使编码钙库操纵性钙通道和受体操纵性钙通道的经典瞬时受体电位通道1(transient receptor potential canonical 1，TRPC1)和经典瞬时受体电位通道6(transient receptor potential canonical 6，TRPC6)表达水平上调，诱导钙内流，胞内游离钙水平升高，最终促进HPV和HPVR的发生[8]。前期研究发现，在低氧条件下，敲除HIF-1α的大鼠，发生肺动脉高压的几率显著下降，肺动脉重构明显改善[9]。近年研究发现，低氧条件下，敲除HIF-1α能够下调PASMCs中的TRPC1和TRPC6通道的表达和功能[10]。慢性低氧条件下，白杨素能够通过下调PASMCs中HIF-1α、TRPC1和TRPC6的表达来调节细胞内钙浓度，从而发挥改善肺动脉高压的作用[11]。
1.2 低氧-K+通道-PASMCs钙稳态失衡低氧条件下，PASMCs上的电压依赖性K+通道失活，K+外流受限制，细胞膜发生去极化，进而使得电压依赖性钙通道开放，[Ca2+]i增加。Ca2+通过与肌质网质膜上的钙通道蛋白兰尼碱受体(ryanodine receptors，RyR)结合，进一步诱导肌质网内钙释放，触发细胞兴奋收缩耦联机制，导致平滑肌收缩，从而促进HPV[6]。Hua等[12]研究发现，苹果多酚能够通过影响K+通道活性，减少PASMCs胞质内的游离钙浓度，从而逆转肺血管收缩[12]。
1.3 低氧-钙库操纵性钙通道(store-operated calcium channel, SOC)-PASMCs钙稳态失衡SOC可调控内质网(endoplasmic reticulum，ER)/肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)钙库耗竭而引发的[Ca2+]i升高，称为钙库操纵性钙内流。另外，钙库耗竭，SOC可诱导钙库的重新充盈。目前的研究发现在PASMCs中，调控Ca2+参与低氧反应的主要是SOC中的TRPC1和TRPC6，另外也有研究表明Orai 1蛋白也参与其中[13]。
基质交感分子1 (stromal interaction molecule，STIM1)主要参与调控钙库操纵性钙内流。在正常状态下，STIM1作为一种单通道跨膜蛋白定位于ER/SR膜，当ER/SR的内钙耗竭时，STIM1离开ER/SR膜，转运至细胞膜，与Orai 1通道形成钙释放激活钙通道(Ca2+ release-activated Ca2+ current，CRAC)，它对钙高度敏感，能够促进外钙内流。随着细胞内钙库再次充盈，STIM1失活，钙内流减少[14]。
在众多的通路中，低氧通过SOC诱导钙库操纵性钙内流增加是PASMCs的[Ca2+]i升高的重要机制之一。研究表明：低氧处理，能够使得PASMCs表面的SOC表达增加，继而通过SOC的外钙内流增加[15]。另外，低氧条件下，人肺动脉内皮细胞中经典瞬时受体电位通道4转录水平升高，使得SOC表达增加、功能上调，细胞内钙水平升高，进一步使激活蛋白1活性及表达均增加。同时，血管内皮生长因子、内皮素1(endothelin-1，ET-1)及血小板衍生生长因子等应答基因的表达水平升高，最终诱导肺动脉内皮细胞的生长因子增加，从而促进PASMCs的增殖，导致肺动脉重构[16]。Wang等研究发现西地那非能够通过下调TRPC1的表达，抑制PASMCs的钙库操纵性钙内流，从而改善缺氧诱导的PASMCs增殖[17]。
1.4 低氧-受体操纵性钙通道(receptor-operated calcium channel，ROC)-PASMCs钙稳态失衡目前的研究表明：ROC定位于细胞膜上，在PASMCs中，ROC由经典瞬时受体电位通道3、TRPC6、经典瞬时受体电位通道7参与构成。低氧条件下，ET-1、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管紧张素Ⅱ、血小板生长因子等血管活性物质与G蛋白偶联受体结合，激活磷脂酶C(phospholipase，PLC)，PLC能够进一步催化二磷酸磷脂酰肌醇裂解成三磷酸肌醇(inositol 1, 4, 5-triphosphate，IP3)、二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)。IP3与SR或ER膜上的IP3受体(IP3 receptor，IP3R)结合，导致Ca2+从SR/ER释放或动员进入细胞质，[Ca2+]i升高; DAG能够诱发ROC的开放，DAG作为第二信使，能够直接激活ROC，[Ca2+]i升高[14]。研究表明：U73122作为PLC抑制剂，能够减少DAG的生物合成，从而减弱野生型小鼠HPV; 另外，使用OAG(DAG类似物)激活TRPC6或者减少DAG的降解，都能够引发小鼠发生肺动脉收缩[18]。Kaymak等[19]研究表明，在低氧诱导的实验性肺动脉高压大鼠中，氯喹能够降低肺动脉中TRPC1、TRPC6和钙敏感受体的表达，从而改善肺动脉重构。
1.5 低氧-钙敏感受体(Ca2+-sensing receptor，GaSR)-PASMCs钙稳态失衡Ca2+作为第二信使在HPV和HPVR中发挥重要作用的同时，又是其中关键的第一信使。低氧处理后，细胞外钙能够通过激活细胞膜上的GaSR，进一步激活PLC-IP3-Ca2+途径，IP3与PASMCs内钙库上的IP3受体结合，进一步引发内钙释放，胞内的第二信使Ca2+水平升高。
CaSR是一种G蛋白偶联受体，能够感知细胞外钙浓度的变化，参与到钙稳态调节过程中[20]。目前的研究发现：CaSR在血管平滑肌细胞和内皮细胞中均有表达[21]，它能够被氨基酸(苯丙氨酸和谷氨酸)、多价阳离子(Ca2+，Gd3+，Mg2+)以及氨基糖苷类抗生素等激活。Yamamura等[22]的研究表明：在低氧导致的肺动脉高压小鼠和野百合碱引发的肺动脉高压大鼠中，PASMCs的CaSR表达水平均升高; 利用NPS2143阻断钙敏感受体后，HPH动物的右心室收缩压、右心肥大指数均显著降低，并且肺小动脉的重构得到明显改善。
1.6 低氧-低氧诱导促有丝分裂因子(hypoxia-induced mitogenic facto，HIMF)-PASMCs钙稳态失衡HIMF具有促有丝分裂、血管生成、血管收缩和趋化因子样的特性，这些特性都与病理性肺疾病(血管收缩、血管重塑、炎症和纤维化)有关。2009年, Fan等[23]发现HIMF能够通过激活PLC-IP3途径，引发人PASMCs内钙水平升高，导致肺血管收缩，最终引发肺动脉高压。HIMF为PASMCs外CaSR的非经典配体，低氧刺激下HIMF与CaSR结合能够引发PASMCs增殖和HPH的发生[24]。最新的研究证明，在HIMF诱导肺动脉高压形成中，高迁移率族蛋白B1-晚期糖基化终末产物受体信号转导通路在“肺动脉平滑肌细胞-内皮细胞”相互调控的过程中发挥着关键作用[25]。
低氧导致PASMCs的[Ca2+]i升高的可能机制(Fig 1)有待进一步的研究和完善，随着今后研究的深入，会发现更多的调控通路和潜在的药物靶点。
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| Fig 1 Mechanism of hypoxic-induced increase of intracellular free calcium concentration in PASMCs The white straight arrow indicates direct hypoxia induction, the green curved arrow indicates intracellular calcium signaling, and the yellow curved arrow indicates extracellular calcium influx. |
HPV是指低氧刺激下，众多因素导致的强烈的肺动脉收缩。低氧下，HPV这一特殊的反应是机体为了维持肺组织正常的通气/血流比值所产生的适应机制，但是随着低氧的持续发生，这一反应也会变成引发肺动脉高压的病理因素[1]。低氧条件下，HPV发生发展的一项重要诱因就是“低氧导致的PASMCs内钙水平升高”[26]。
如前所述，低氧能够通过诸多途径引发PASMCs内游离钙水平升高，细胞内钙离子进一步与钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合形成Ca2+/CaM复合物，激活肌球蛋白轻链磷酸酯酶，引发肌球蛋白轻链磷酸化，进一步激活肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置，导致PASMCs发生收缩，引发HPV。
3 HPVR与PASMCs钙稳态失衡HPVR是指PASMCs增殖、细胞外基质增加等导致的动脉管壁增厚及肺小动脉管腔狭窄。目前，针对HPH中HPVR的治疗方法有限，肺血管重塑的重要驱动因素之一就是PASMCs的过度增殖和凋亡抵抗[27]。降低PASMCs内[Ca2+]i可以有效地抑制或者改善HPVR，使得肺动脉压力降低[7]。
3.1 [Ca2+]i升高-PI3K/Akt/mTOR-PASMCs增殖Akt又被称为蛋白激酶B，是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)下游的作用位点之一。作为与PI3K/Akt通路密切关联的蛋白激酶之一，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可作为Akt下游的一个底物被激活。
PI3K/Akt/mTOR可参与细胞凋亡、细胞增殖、细胞自噬等多个环节。Lee等[28]证实，低氧可以激活鸡肝细胞Ca2+/PI3K/Akt/mTOR通路，调节细胞周期蛋白，促进鸡肝细胞DNA合成，从而诱导细胞增殖。PASMCs内游离钙水平升高，可激活PI3K/Akt/mTOR，使得细胞周期蛋白表达增加，最终诱导PASMCs的增殖[23]。研究发现，慢性低氧诱导的肺动脉高压小鼠模型中，低氧诱导HIMF表达增加，诱导Akt磷酸化，能够促进PASMCs增殖[29]。
3.2 [Ca2+]i升高-PKC/MAPKs-PASMCs增殖蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)由Ca2+激活，调节细胞凋亡及生长分化等过程。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，包括p44/42MAPK、p38MAPK(α、β)、Jun N端激酶等，可被多种细胞外信号激活。MAPK被活化，转移至细胞核内，能够调节细胞周期蛋白。缺氧能够通过诱导鸡肝细胞[Ca2+]i升高，激活PKC/MAPKs，进一步促进DNA合成，诱导细胞发生异常增殖[28]。目前的研究表明：缺氧通过诱导大鼠PASMCs的HIMF表达水平上调，进一步引发细胞内Ca2+水平升高，通过调控PASMCs中PKC/MAPKs信号转导通路，从而诱导细胞异常增殖[30]。
4 总结与展望综上所述，低氧导致PASMCs钙稳态失衡过程中，HIF-1α、TRPC1、TRPC6、部分敏感的K+通道、PLC、CaSR、HIMF及ROC相关的膜受体都有可能成为HPH防治药物的潜在靶点或者干预目标。
目前为止，虽然越来越多的研究者关注Ca2+在HPH发生发展过程中扮演的角色，但是仍然存在着很多不明确的问题。首先，低氧诱导PASMCs发生钙稳态失衡的相关机制并不是单独存在的几条通路，而是一个复杂的网络机制，目前的研究并不能完全、清楚地阐述这个网络机制; 第二，钙超载引发HPV和HPVR还涉及哪些因素和信号通路，也有待研究; 第三，低氧后，PASMCs钙超载与肺动脉内皮细胞的损伤有哪些联系，也需要进一步研究和解释。
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