2. 陆军装备部装备项目管理中心，北京 100072
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有机磷农药(organophosphorus pesticides，OPP)和有机磷神经性毒剂(organophosphorus nerve agents，OPNAs)属于有机磷领域中重要的两类化合物，主要通过不可逆抑制胆碱酯酶(cholinesterase，ChE)活性，使神经突触内乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)过度蓄积，神经系统的传导功能受损，进而产生一系列的毒害作用。OPP的毒性较低，因具有高效、便宜、对植物安全等优势，用于杀虫、灭菌、除草等。OPNAs是由OPP发展而来的具有速效致死性的膦酸酯类物质，典型代表有G类毒剂，如塔崩(GA)、沙林(GΒ)、梭曼(GD)、环沙林(GF)和V类毒剂，如维埃克斯(VX)，这些毒剂曾作为化学武器被应用于一战、二战和多次恐怖活动中[1-2]。
OPP和OPNAs可以通过呼吸道、皮肤黏膜、眼睛、胃肠道等多种途径进入生物体，经过迅速的分布、代谢，最终以原体、代谢物、蛋白质加合物3种形式存在，并对生物体的健康产生短期或长期的影响，包括: ①急性胆碱能毒性：蓄积的ACh对胆碱能受体(烟碱受体和毒蕈碱受体)过度刺激所产生的缩瞳、流涎、心动过急或过缓等症状; ②中间综合征：急性或重度的OP中毒引发的神经肌肉接头功能障碍，如呼吸肌、骨骼肌麻痹; ③迟发性神经病(organophosphate delayed neuropathy，OPIDN)：单次或反复暴露于OP毒物导致的迟发性中央-外周远端感觉-运动多神经病，有感觉障碍、共济失调、肌无力等表现; ④慢性神经毒性：单次急性或多次低剂量暴露于OP毒物所引发的慢性神经行为改变，如学习记忆能力下降、情感障碍等[3]。
鉴于OPP/OPNAs的原体、代谢物在生物体内有稳定性差、存续时间短、降解速度快等诸多不足，OP毒性机制的研究焦点已经转移至蛋白加合物。本文将诸多研究中涉及到的靶标蛋白分为两类：内源性清道夫(丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase，BChE)、白蛋白、转铁蛋白)和低剂量毒性的相关蛋白(细胞骨架蛋白、神经病靶标酯酶、泛素)，综述OPP/OPNAs与这些靶蛋白之间的共价加合物、加合反应机理、活性位点的结构特征，旨在为OP毒物的确认暴露、溯源归因、精准治疗、合理预防等提供新的研究思路。
1 OPP/OPNAs中毒机制OPP/OPNAs对生物体产生急性毒性作用的原因是AChE的活性被抑制。AChE主要分布于中枢神经系统的突触内和外周神经系统的神经肌肉连接处，少量与血液中红细胞的膜结合。它能够快速水解神经递质ACh，终止ACh对突触后膜的兴奋作用，从而保证神经信号在生物体内的正常传递[4]。此过程依赖于AChE的活性位点：催化三联体(Ser203-His447-Glu334)和外周阴离子位点，底物ACh的季铵离子通过静电作用结合在AChE的阴离子结合位点，其羰基碳与AChE的丝氨酸残基Ser203的羟基相互作用，经乙酰化和去乙酰化循环水解ACh[5]。
作为ACh水解过渡态的结构类似物，OPP和OPNAs是AChE的高效抑制剂。OPP/OPNAs进入生物体后，磷原子与丝氨酸侧链的羟基共价结合生成磷/膦酰化的AChE，使AChE丧失水解ACh的功能。与乙酰化的AChE能够快速水解不同，磷/膦酰化的AChE的水解非常缓慢，致使AChE的活性受到抑制，ACh在体内过度蓄积并持续作用于胆碱能受体：毒蕈碱和烟碱受体，超过50%的AChE被抑制后会出现胆碱能危象，如呕吐、腹痛、腹泻、瞳孔缩小、多汗、流涎、心率减慢、肌肉痉挛等，严重者甚至会导致死亡[6]。
不同物种间或同一物种的不同部位间的AChE具有高度保守性，OP毒物对AChE的抑制作用与物种、年龄无关。OPP/OPNAs进入生物体后会迅速分布于各个器官如脑、肺、心、肝、肾，并稳定存在，其中肺的摄取率最高，这似乎间接解释了为什么OP患者中毒死亡的直接原因是呼吸衰竭。此外，研究发现OP毒物的体循环量与AChE的浓度呈负相关，循环量过高会诱发胆碱能综合征，伴有呼吸窘迫、高血压等症状[7]。同时，神经元的钙瞬变增加和钙的高表达会造成神经元过度活化，进而导致神经元损伤，出现癫痫或永久性认知障碍。磷/膦酰化的AChE的重活化有两种途径：历经缓慢的自发水解或活化剂的重活化。肟类重活化剂能够复能磷/膦酰化ChE，与蓄积的ACh竞争膈肌烟碱型乙酰胆碱受体，从而保护呼吸肌纤维免受OP毒物的损伤[8-9]。此外，有研究发现其有拟胆碱酯酶作用，可水解ACh，但也存在诸多局限性：①重活化作用具有选择性：对敌敌畏、对硫磷、甲胺磷等中毒酶有较好的重活化作用，而对乐果、敌百虫和马拉硫磷等中毒酶的重活作用较差，GD中毒酶的重活效果更差[8]; ② OP-AChE老化后AChE的活性不能再恢复，OPP/OPNAs与丝氨酸残基之间的共价加合物易发生脱烷基形成单阴离子加合物，与OP毒物的磷原子上的取代基带电性一致，阻碍了AChE的再活化进程; ③常见的肟类药物为季铵化合物，不易透过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，仅对外周组织中的AChE有重活化效果; ④肾排泄快，需根据病情和半衰期重复给药。目前，最有效的活化剂是亲核吡啶鎓肟，但吡啶鎓环中的季氮原子带有的永久性的正电荷会阻止肟穿过BBB，无法恢复大脑正常的胆碱能功能。研究发现[9]，叔肟单异亚硝基丙酮能激活中枢神经系统中的AChE，治疗后患者具有更高的存活率和更低的发病率，但具体的活化作用还需进一步研究确认。
2 内源性清道夫在生物体内有这样的一类蛋白：OPP/OPNAs的磷/膦酰化修饰似乎并没有对其造成明显的不良影响，它依旧保持最初的生物学功能，参与机体正常的代谢过程。随着蛋白的自身降解，有毒的OPP/OPNAs排出体外，这类蛋白包括BChE、白蛋白、转铁蛋白等，属于内源性清道夫，通过与OPP/OPNAs共价结合来帮助机体清除毒物。对这些内源性清道夫的加合物进行研究，深入理解其加合位点、作用机制、周围环境，对OP毒性的预防和抗OP毒性药物的研发具有一定的启示作用。
2.1 OPP/OPNAs与BChE的加合反应BChE主要分布于血清和肝脏中，肌肉和脑组织中也有少量存在[10]。因同属于丝氨酸水解酶家族，BChE与AChE具有相似的结构特征：氨基酸序列的高度同源性、活性部位催化三联体(Ser198-His438-Glu325)和外周阴离子部位、相似的三维结构、具有芳香氨基酸残基。BChE催化水解丁酰胆碱(butyrylcholine，BCh)，其丝氨酸的羟基攻击BCh的羰基碳，与丁酰基共价结合并释放胆碱，随后丁酰化酶水解释放丁酸，BChE恢复活性。
OPP/OPNAs对BChE的抑制作用与AChE类似，即OP毒物的磷原子与Ser198的羟基共价结合生成OP-BChE加合物。不同的是，OP-BChE加合物仅起到中和毒物的作用，对机体没有任何不良影响。研究表明，BChE与OP毒物的结合速率比AChE高，因血液中的高丰度、较长的半衰期、高反应性以及显著的排毒功效，BChE被认为是最有效的生物清除剂，而人血浆中BChE的浓度约50nmol/L，不足以抵消高浓度的OPP/OPNAs。因此，OP毒性的防治常常采用外源性的BChE来实现[11]。此外，BChE也能催化水解ACh，但由于底物特异性和水解能力的差异性，反应进行缓慢。当AChE活性受到抑制时，BChE能代替AChE水解突触后膜上过量的ACh或参与调节突触前膜ACh的释放过程。不足的是，这一过程只存在于周围神经系统中，无法降低中枢神经系统中ACh的含量，故AChE被抑制时仍会出现胆碱能功能异常。
OPP/OPNAs进入生物体后，BChE的活性位点Ser198的羟基对OP毒物的磷原子进行亲核攻击，生成磷/膦酰化BChE。因此，可以通过鉴定体内的BChE加合物来判断OP的暴露。染毒后的BChE经蛋白酶酶解获得含有Ser198位点的肽段：胃蛋白酶酶解后的九肽加合物和胰蛋白酶酶解后的二十九肽加合物，两种均可用于OP毒物的生物检测，但相比于九肽加合物，二十九肽加合物因肽段分子量大，含有的氨基酸残基多，观察完整的y系列或b系列碎片离子以确定修饰位点的难度增加，所以修饰的FGESAGAAS肽段是检测OP暴露的生物标志物[12]。然而，BChE加合物的检测存在局限性：① OP-BChE加合物存在老化现象，且老化速度比AChE加合物快。老化后的BChE加合物缺少烷氧基的信息，无法对去烷基化后具有相同结构的OP毒物进行溯源。例如GB、GF、VX、VM和VR均含有甲基膦键，与被修饰的BChE生成老化的甲基膦酸标志物; VE的结构中含有乙基膦键，VE-BChE生成老化的乙基膦酸标志物; 仅有甲基-、乙基-OPNAs类似物，如丙基沙林与BChE生成老化的丙基膦酸标志物。虽然甲基-、乙基-、丙基膦酸酯是OPNAs特有的，但仍无法对老化的OP毒物准确溯源; 而对于常见的OPP，BChE加合物的OP毒性溯源似乎格外高效：O-甲醇酸酯和敌敌畏分别形成磷酸单甲氧基-、磷酸二甲氧基-BChE加合物; 二嗪农生成二乙氧基硫代磷酸标志物，经硫醇-硫酮互变异构获得的二嗪农异构体，与BChE共价结合生成一乙-、二乙氧基磷酸加合物。②磷/膦酰化的BChE可经亲核试剂(如肟)作用重新活化，加合物结构的破坏会影响对OP暴露的判断，而肟无法恢复老化的BChE的活性，因此设计有效的烷基化剂是应对BChE加合物老化的重要途径之一，但该领域的相关研究尚少[13]。
2.2 OPP/OPNAs与白蛋白的加合反应白蛋白是由肝实质细胞合成，在血浆中的半衰期约20 d，是血浆中含量最高的蛋白质，在维持胶体渗透压、运输营养和排除毒素等方面具有重要作用。1963年，桑格对标记肽进行氨基酸测序，证明二异丙氧基氟磷酸酯(diisopropoxy fluorophosphate，DFP)可以标记人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的酪氨酸残基。此后，除丝氨酸水解酶之外，白蛋白逐渐成为探究OP毒物生物标志物的重要靶标。
相比于BChE加合物，OP-白蛋白加合物具有诸多优势：①白蛋白的OP解毒作用强，同样作为OP清道夫，血液中白蛋白的浓度是BChE的10000倍，弥补了反应速度慢的不足，可以通过与磷原子共价结合清除体内的OP毒物。②白蛋白的半衰期较长，意味着OP-白蛋白加合物在体内的保留时间比OP-BChE长，为OP暴露提供更好的检测窗。③OP-白蛋白加合物更稳定，而OP-BChE易老化。BChE具有活性部位催化三联体，其中丝氨酸残基Ser198与OP上的磷原子共价结合，附近的组氨酸和谷氨酸会催化BChE加合物的老化过程，而白蛋白的活性部位不存在促进衰老的氨基酸残基。④OP-白蛋白加合物的应用范围广。BChE加合物的研究没有广谱性，因为牛、山羊、绵羊的血液中没有BChE，大鼠血液中的BChE含量低，而所有哺乳动物的血浆中都存在白蛋白，更具有研究价值。白蛋白与OPP/OPNAs发生亲核反应，共鉴定出3种磷/膦酰化修饰的氨基酸残基：酪氨酸残基、赖氨酸残基、丝氨酸残基，它们的共性特征是具有亲核侧链，氨基酸残基的ε侧链进攻OPP/OPNAs上的磷原子形成OP-白蛋白加合物。OPP/OPNAs与不同的残基的ε侧链共价连接时，插入的位点也不同，例如GB的O-异丙基甲基磷酸酯分别被加到了酪氨酸的ε-酚羟基、赖氨酸ε-氨基、丝氨酸的ε-羟基上[13-14]。
2.2.1 OP-酪氨酸加合物酪氨酸残基可以被多种OP毒物磷/膦酰化修饰，如DFP与菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋清溶菌酶上的酪氨酸残基共价结合; OPP(对硫磷、敌敌畏、毒死婢、马拉硫磷、丙胺磷、DFP)、OPNAs(GB、GD)与HSA、纯小鼠白蛋白的酪氨酸(tyrosine，Tyr)411残基共价连接。FP-生物素对牛血清白蛋白磷酰化修饰的活性位点Tyr410，相当于HSA的Tyr411。对特殊标记的Tyr411深入研究，发现其pKa值(7.9-8.3)明显低于酪氨酸残基的平均水平(pKa=10)，解析加合物的晶体结构时发现，该残基与多个带正电的基团相邻并处于非极性环境中，Tyr411的羟基临近Arg410和Lys414的侧链。将Tyr411定点突变为Ala时，白蛋白的活性消失，而将Arg410突变为Ala时，白蛋白的活性大大降低，说明Tyr411是HSA的活性位点，Arg410对稳定其高反应性具有重要作用。据悉，Tyr411是最具高反应性的残基，分析蛋白加合物进行OP溯源时，OP毒物中不同的离去基团会影响OP检测限，例如对硫磷、毒死婢很容易确定到1 μmol·L-1的暴露水平，丙胺磷在高水平(1 mmol·L-1)下可以检测样本，但预估能够达到1 μmol·L-1的检测水平，而马拉硫磷的检测限为1 mmol·L-1，提示相比于其余3种OPP的酚羟基离去基团，马拉硫磷的硫醇基团与Tyr411有较低的反应性。除Tyr411外，HSA中的Y263也具有高反应性，能够同时被6种OPNAs(GA、GB、GD、GF、VX及其异构体)共价修饰。对Y263的空间结构及电子效应进行研究，发现Y263较大的溶剂可及性(%SAS)，增加了与OPNAs发生碰撞的机会，离子对(与距离4.21 Å的K233形成的离子对)和非共价相互作用(酚羟基与距离2.89 Å的E230形成氢键)在稳定加合物中具有关键作用。HSA上有关活性位点Tyr411和Y263的研究启示：OPP/OPNAs与残基的共价结合与OP毒物的离去基团、活性位点的结构和周围环境有关[15]。此外，残基离子化也会影响加合反应，FP-生物素在pH 8.0~8.3下高剂量染毒HSA并延长染毒时间，发现90%结合在Tyr411，其余10%标记在其它残基上，如丝氨酸，研究其特殊反应性，发现酪氨酸羟基的pKa低于丝氨酸羟基(pKa：10.1 < 16)，同时，由于周边的精氨酸或赖氨酸对酪氨酸或丝氨酸的离子化羟基的稳定作用，导致离子化的酪氨酸比例远高于丝氨酸，使酪氨酸更容易发生加合反应且加合比例更大。
2.2.2 OP-赖氨酸加合物OPP/OPNAs对赖氨酸残基的磷/膦酰化修饰是基于赖氨酸的ε-氨基对OP毒物上磷原子进行亲核攻击，然后在ε-氨基上加一个有机磷部分，例如毒死婢和DFP与HSA发生亲核反应，分别得到二乙氧基-和二异丙氧基-磷酰化赖氨酸[16]。GA对体外(牛、卵磷脂、大鼠、兔)纯白蛋白和体内(卵磷脂、大鼠、兔)白蛋白的膦酰化修饰，发现体内外有相似的被修饰的肽序列，且在不同物种中均保持稳定。GA-卵磷脂加合物的形成是源于赖氨酸侧链的氮原子对GA上磷原子的亲核攻击，膦酰化的残基通常存在于白蛋白的表面或附近的空腔内，具有较低的PKa值和CDOCKER相互作用能。CDOCKER相互作用能越低表示加合物越稳定，如体内的活性位点K414与GA之间的加合物具有较强的结合能(-24.3242 kcal/mol)，稳定性较强，而未标记的赖氨酸残基的CDOCKER相互作用能较高[17]。此外，膦酰化的赖氨酸残基的反应性同样受到氢键、静电作用、电子对的影响，如GA靠近HSA上的K525时，氮原子与K525和Y401的侧链形成氢键，碳原子与F551的侧链形成H-π共轭，这两个因素有助于增强GA-K525的疏水性，降低亲水性和GA与K525亲核反应能，使加合物更加稳定[9]。提示可以通过诱变或化学修饰邻位残基来改变周围环境，降低氨基酸残基的pKa，从而增加OP与白蛋白的反应性。不同物种的氨基酸序列显示兔血清白蛋白(rabbit serum albumin，RSA)与HSA的序列同源性高达76.03%，高于常用的实验动物大小鼠。GD对RSA、兔血浆染毒发现存在GD-赖氨酸加合物，而兔体内膦酰化的残基仅发现赖氨酸，因体内GD的暴露剂量远低于体外，在未使用过量毒物的情况下，赖氨酸残基优先被标记，推断RSA体内赖氨酸残基比酪氨酸、丝氨酸的反应性更高，可能的原因有：①赖氨酸是碱性氨基酸，其侧链易解离并带有正电荷，增强了亲核活性; ②赖氨酸ε-氨基优先与GD形成加合物，而非酪氨酸的ε-酚羟基、丝氨酸的ε-羟基，可能是其官能团赋予其这种特性[7]。
2.2.3 OP-其他氨基酸加合物在没有活性位点丝氨酸的蛋白中，酪氨酸和赖氨酸的反应性比丝氨酸大。当实验条件加大，如增加OP毒物浓度、延长染毒时间等，就会出现OPP/OPNAs与丝氨酸残基的加合现象，但丝氨酸加合物的稳定性远低于酪氨酸加合物，同样在pH8.3的条件下温育，一个月后仍能观察到被OP修饰的酪氨酸，而OP-丝氨酸加合物早已不见踪影，这可能由于：①OP-丝氨酸容易进行β消除以释放有机磷部分，只剩下脱氢丙氨酸，而OP-酪氨酸并未发现释放有机磷酰基部分的证据。②OP-丝氨酸可以轻松去除有机磷部分，导致肽的质谱图中没有特征性片段，而OP-酪氨酸相对稳定的产生大量的特征性片段，为OP标记的酪氨酸的存在提供证据[18]。膦酰化的丝氨酸位点同样有其结合特征，HSA上的K* VPQVSTPTLVEVSR肽段上的S419与结构相似的GB和GF有较强的亲和力，其中GB的磷原子与HSA中S419侧链的氧原子形成共价键，同时，GB与HSA中K500侧链的氮原子之间的氢键、与相邻残基之间较低的非共价结合能，均增加了GB-HSA的稳定性。具有硫醇离去基团的OP毒物，如V类OPNAs(VX、VR、Vs)和OPP(氧化氢-甲基、乐果、氧化乐果)能与HSA中唯一的非二硫键桥接的半胱氨酸残基(Cys34)形成二硫加合物，它是通过游离的硫醇离去基团或二硫键二聚体与Cys34之间进行硫醇-二硫键交换形成的。以VX为例，VX的含硫离去基团2-(二异丙基氨基)乙硫醇(2-(diisopropylamino)ethanethiol，DPAEP)与Cys34形成二硫加合物，酶解后会以半胱氨酸-脯氨酸二肽或三肽的形式释放。这些毒物与白蛋白会形成两个中心的加合物，一个是含硫中心的二硫加合物，一个是含磷中心的磷/膦酰化加合物，其中二硫加合物的靶向氨基酸为半胱氨酸，而磷/膦酰化加合物的靶标主要为酪氨酸或赖氨酸。有一种观点：磷/膦酰化的酪氨酸邻近Cys34时有助于二硫加合物的形成。但在HSA的三维结构中，没有一个反应性的酪氨酸(包括高反应性的Tyr411)与Cys34接近，仅有Tyr84、Tyr140在Cys34附近，提示这两种酪氨酸可能是OP毒物的潜在靶点。
2.3 OPP/OPNAs与转铁蛋白的加合反应转铁蛋白(transferrin，TRF)由肝细胞合成，是血浆中主要的含铁蛋白，负责运输由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。尽管转铁蛋白的半衰期仅有7 d，但因其胰蛋白酶酶解样本在40℃的环境中可以保存一个月以上，同样能作为检测OP加合物的良好靶标蛋白[19]。采用过量的OP毒物(GB、GA、VX、GD、GF、乙基塔崩、丙基塔崩)转染人转铁蛋白，结合位点涉及3种类型的残基：酪氨酸-、赖氨酸-和丝氨酸残基，其中Y515位点同时被GB、GD、VX标记，是转铁蛋白中最具反应性的残基，处于暴露状态并与其他残基之间存在氢键相互作用。同时，发现OP与酪氨酸的结合似乎更倾向于附近有带正电的精氨酸或赖氨酸，结合白蛋白中的标记肽进行研究：在pH=8.3的条件下，采用0.1、0.2 mmol·L-1的DFP、毒死婢和敌敌畏染毒两条合成肽段ArgTyrThrArg和SerTyrSerMet，在ArgTyrThrArg肽段上发现酪氨酸加合物，而另一条肽段上没有发现毒物标记，将染毒浓度增加至1 mmol·L-1，质谱中发现较弱的离子化肽，发现规律：位于带正电荷的精氨酸或赖氨酸残基附近的酪氨酸残基通常具有高反应性。当转铁蛋白上的酪氨酸或赖氨酸被膦酰化后仍能与三价铁离子结合并发生氧化还原反应，表明转铁蛋白的生理功能不受加合物的影响。
3 低剂量毒性的相关蛋白AChE的快速磷/膦酰化充分解释了OPP/OPNAs的急性毒性作用。然而，当确认低剂量的OP毒物在未抑制AChE的情况下仍能产生神经毒性，如头痛，记忆力减退，学习能力差，睡眠困难，疲劳和肌肉无力时，提示有除抑制ChE之外的机制参与其中，而磷/膦酰化修饰的白蛋白或转铁蛋白并不能解释低剂量毒性的由来，说明另有靶标经OPP/OPNAs修饰后对生物体的神经功能造成损伤。但该领域进展缓慢，目前尚不明确其发生机制。
3.1 OPP/OPNAs与细胞骨架蛋白的加合反应据悉，低剂量的OP毒物干扰神经发育的过程，如神经元增殖、分化、凋亡、轴突发生、突触形成，甚至神经胶质细胞的增殖、分化等。神经元细胞骨架是由微管、微丝、中间丝构成的蛋白纤维网架体系，在正常的神经发育中至关重要，其骨架蛋白有望成为研究OP神经毒性的重要靶标[20]。
3.1.1 OPP/OPNAs与微管蛋白的加合反应微管蛋白是微管的主要成分，包括3种：α-、β-、γ-微管蛋白，前两种微管蛋白占总量的80%~95%，具有相似的三维结构，能够紧密结合形成二聚体并参与微管的组装；γ-微管蛋白位于微管组织中心，对微管的形成、数量、位置及细胞分裂具有重要作用。微管蛋白聚合形成微管，参与营养物质从神经细胞体到神经突触的运输。有报道称，易感动物体在OP暴露后引起的OPIDN、认知功能缺陷或与微管蛋白功能损坏、轴突运输中断有关[21]。在FP-生物素染毒的活体小鼠的脑内上清液中发现被标记的分子量为55KDa的蛋白，质谱鉴定该蛋白的主要成分为微管蛋白。随后研究发现，OPP(毒死婢、DFP、FP-生物素)和OPNAs(GB、GD)能与牛微管蛋白(α-、β-微管蛋白)上的酪氨酸残基和赖氨酸残基共价结合，其中α-微管蛋白上的Tyr83和β-微管蛋白上的Tyr281暴露在微管蛋白二聚体的表面，与三磷酸鸟苷分子的鸟嘌呤部分具有π-π相互作用，二者的OP反应性最高，且反应速度也比其他氨基酸残基快。同时，被标记的微管蛋白聚合会形成异常短的微管，微管结构改变，运输功能异常导致神经传递和信号转导功能受损[22]。
3.1.2 OPP/OPNAs与角蛋白的加合反应皮肤是OP毒物进入生物体的重要途径。研究表明，暴露于14C-VX环境中的家猪，皮肤内会残留约20%的放射性，明确了皮肤在OP暴露中的研究价值，而VX对人类皮肤的渗透性不及猪皮，会在更大面积的皮肤上扩散，因此使用剂量的大部分会保留在施用部位的皮肤内。FP-生物素与人角蛋白的加合物肽段THEN*FESFNNLR上的酪氨酸残基Tyr230共价结合，肯定了皮肤内蛋白加合物对检测OP暴露、对OP归因的可行性。皮肤中的角蛋白是中间丝的重要组成部分，主要存在于所有上皮细胞和部分非上皮细胞，用于维持细胞的形状和抵抗外界的压力。OPNAs(VX、DFP)和OPP(毒死婢、FP-生物素)与人足底的愈伤组织内的角蛋白形成蛋白加合物，涉及酪氨酸残基、丝氨酸残基，而在毒死婢与角蛋白加合物的胰蛋白酶解片段中仅发现了被共价修饰的酪氨酸残基，提示与酪氨酸相比，丝氨酸残基对OP毒物的反应性较低[23-24]。关于角蛋白的研究尚少，或许角蛋白的其他位点也被修饰，但因消化肽的含量太低、检测水平有限而未发现。
3.1.3 OPP/OPNAs与其他骨架蛋白的加合反应除微管蛋白、角蛋白外，微丝的主要构成蛋白——肌动蛋白加合物也被发现，FP-生物素能够标记牛肌动蛋白上的酪氨酸残基(Tyr55、Tyr200)。据报道，大鼠重复暴露于阈值以下剂量的毒死婢或DFP中，其坐骨神经中的顺行性轴突运输受损。除微管蛋白外，与之相关的tau蛋白、驱动蛋白分别参与轴突内微管的组装和稳定、外周和中枢神经系统中轴突运输，同样具有研究价值，例如DFP处理的母鸡中tau蛋白磷酸化；对氧磷、毒死婢会直接影响驱动蛋白，破坏微管内依赖驱动蛋白的运输。
3.2 OPP/OPNAs与神经病靶标酯酶的加合反应神经病靶标酯酶(neuropathy target esterase，NTE)是一种只催化经CDP-胆碱途径合成卵磷脂的磷脂酶B，表达主要受卵磷脂、环腺苷酸、泛素-蛋白酶体途径的调节，主要存在于哺乳动物神经细胞和非神经细胞中的内质网膜上[25-27]。据报道，OPIDN是由OP毒物对NTE的磷/膦酰化引起的。NTE属于丝氨酸酯酶，与丝氨酸水解酶(AChE、BChE)的反应机理相似，是OPs上的磷原子与NTE的活性位点丝氨酸Ser966共价结合抑制NTE的酶活性，随后磷/膦酰化的NTE发生老化：NTE上的OP部分的侧链断开，或OP基团的去质子反应，只留下一个带负电的取代基结合到酶的活性位点上，NTE的活性被永久抑制。在神经元中，NTE的活性被抑制会破坏内质网膜脂稳态，而神经轴突内营养物质的运输都是靠内质网完成的，这一过程会不可避免的遭受扰乱。在神经胶质细胞中，NTE的抑制也会影响膜磷脂代谢，破坏神经元和神经胶质细胞之间正常的相互作用。正常情况下，神经元被一层神经胶质膜紧密包被时，神经元会向其下游神经胶质细胞发出停止包被的信号，而NTE抑制后，中断二者之间的相互作用，神经元会被多层神经胶质膜松散的包被，继而导致两种细胞凋亡，远端轴突发生退变。此外，NTE有溶血磷脂酶的活性，对磷脂代谢具有重要作用。当酶抑制，脊髓等部位的磷脂代谢和信号通路中断，可能会造成迟发性毒性的发生。总之，OPs引起的NTE活性抑制会诱发以外周神经变性为主要特征的OPIDN，期间NTE的生物功能丧失，神经毒性作用产生。
3.3 OPP/OPNAs与泛素的加合反应泛素(ubiquitin，Ub)是所有真核细胞中的一种小蛋白，游离存在于细胞内或共价缀合到各种胞质、核和整合的膜蛋白上，通过单泛素化或多泛素化底物蛋白参与细胞中的多种代谢过程，如细胞周期调控、信号转导功能、应急反应、DNA损伤修复等。Ub的氨基酸序列中包含赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸残基，是典型的磷酸化位点。然而，与V类毒剂一同孵育时，发现仅在赖氨酸残基上形成蛋白加合物。正常PH条件下，暴露于蛋白表面的赖氨酸残基侧链上的氮原子会发生质子化，无法再与亲核试剂发生反应。而膦酰化的赖氨酸残基附近存在酸性基团谷氨酸，可以临时接受其质子，促进加合物的生成[28]。事实上，暴露于蛋白表面的7个赖氨酸残基中，至少有6个对Ub的生物学功能至关重要，这取决于赖氨酸残基中游离的ε-氨基，它能与Ub分子中游离的C端G76残基反应，形成多聚泛素链，而被修饰的赖氨酸残基会失去其生物学功能[29-30]。简言之，OPs与赖氨酸残基的加合作用会破坏Ub正常的生理功能，进而产生毒性作用。
4 小结通过深度探究OP毒物与蛋白质之间的加合反应机制，了解活性位点的结构特征，为之后的OP毒物的确认暴露、溯源归因、精准治疗、合理预防提供了新思路：(1)通过鉴定蛋白加合物的存在来实现OP的确认暴露，与OP毒物原型、代谢产物相比，生物体内的蛋白加合物为OP的暴露提供了更好的检测窗。对OP毒物的检测时间无需再限定于48 h之内，研究者可以根据蛋白加合物在生物体内的保留时间来选择通过测定哪种蛋白加合物来判断OP暴露；(2)通过分析蛋白加合物中与活性位点相结合的OP毒物的保留基团对OP毒性进行溯源归因，为OP中毒提供更多有效信息，帮助医生对OP中毒患者实现精准治疗。目前，以蛋白加合物为基石对OP毒性溯源的文章较少，难以形成归因溯源的完整体系，提示可以总结常见的物种体内不同蛋白加合物对OPP/OPNAs的溯源情况，互为补充，进而形成一张比较完善的溯源谱图以供医疗参考；(3)充分掌握蛋白加合物的形成规律、活性位点的结构特征。蛋白加合物形成的影响因素较多，与结合蛋白的种类、结构，活性位点暴露情况、周围环境(如空间结构、电子效应、静电作用(氢键、共轭键))，氨基酸残基的酸碱性、解离情况、带电情况等因素相关，通常处于暴露状态(具有较大的%SAS)、与邻位残基形成离子对或存在非共价相互作用、pKa值较小、周边有带正电的氨基酸残基的活性位点，易于与OP毒物共价结合形成蛋白加合物。该规律可用于新药研发，作为预防药，通过预先与活性位点相结合来阻止有毒蛋白加合物的生成；或作为治疗药，通过改变加合物的结构、加合位点的结构特征，破坏已生成的有毒蛋白加合物以达到解毒目的。
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