2. 齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所，山东省科学院药物筛选技术重点实验室，山东 济南 250103
2. Biology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250103, China
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种常见的神经系统退行性疾病，WHO报道目前全球约有5 000万AD患者，且患病人数呈逐年增长趋势[1]。AD病患的典型临床表现为学习记忆和感知运动能力下降、反应迟钝、注意力不集中等，随着病情恶化会发展为全面性痴呆状态，给患者及其家庭带来巨大的心理压力和沉重的经济负担。AD的发病机制复杂，主要涉及胆碱能系统紊乱、氧化应激与自由基损伤、细胞凋亡、炎症等方面[2]。由于目前对AD的认知有限，其治疗手段尚无统一定论，临床用药主要包括改善认知功能的乙酰胆碱酯酶抑制剂类(盐酸多奈哌齐、利斯的明、石杉碱甲)、抗氧化剂类(司来吉兰)及N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂类(美金刚)等[3-4]。上述药物主要针对于AD的单一靶点进行阻断和治疗，虽然在一定程度上可以暂时缓解AD症状，但需长期服用。AD治疗药物长期服用会在患者体内过量堆积，进而将诱发一系列不良反应。因此，在全球严峻的AD防治形势下，研发有效治疗AD且毒副作用较小的药物已迫在眉睫。
在我国，应用中药作为医学治疗手段已有数千年历史。现代药理学研究表明，在全球销量最好的药物中，约1/4来源自中药等天然产物[5]。中医药因食源性、药源性物质中的活性成分具有更好的有效度和安全性，在疾病预防和治疗中扮演着至关重要的角色。中药毒副作用和不良反应较小，且可发挥多成分、多途径的治疗优势，符合AD等神经退行性疾病发病机制复杂性、多样性的特点，因此在临床治疗中具有广阔的应用前景。金盏菊属菊科植物，亦称金盏花、万寿菊，天然生长在亚洲、美洲等多处地带。金盏菊中分离的化合物(包括黄酮类、皂甙类、萜类等)具有多重生物活性，在抗凋亡、抗氧化、抗炎、伤口愈合、促进色素生物合成等方面均可发挥一定作用[6]。但是，金盏菊是否具有抗AD活性仍然未知。
网络药理学系统整合了传统生物学、药理学、基因组学等多个学科方向，运用多角度高通量筛选等计算机分析技术，通过构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络图，将网络大数据可视化、直观化，从整体综合性角度探索药物与疾病之间的关联，进而预测药物治疗疾病的可行性及作用机制，近年来已成为一种探索中药疗效的高效科研方法和技术手段[7]。本研究以金盏菊为研究对象，应用网络药理学技术，拟筛选出金盏菊的主要活性成分和作用靶点，对金盏菊改善AD症状的作用机制进行预测，并通过体内实验进一步验证。旨在为AD的临床治疗提供新的研究思路，同时深度挖掘金盏菊的活性成分及作用机制，为金盏菊的深度开发利用开辟新途径。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂金盏菊购于河北大中药业有限公司，研磨成粉后蒸馏提纯，离心后收集上清液旋蒸，得到较纯净的金盏菊水提物，以上提取物由山东省科学院药物化学实验室提供并检测。氯化铝(AlCl3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：7784-13-6)、盐酸多奈哌齐(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：120011-70-3)、亚甲基蓝(美国默克生命科学公司)、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)(上海碧云天生物技术有限公司)、Allprep组织/细胞miRNA/RNA/DNA分提试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)。
1.2 仪器斑马鱼养殖系统(北京爱生科技发展有限公司); Zebrabox斑马鱼行为分析仪(上海众维贸易有限公司); 超微量分光光度计(基因有限公司); 实时荧光定量PCR仪器(罗氏诊断产品有限公司); AXIO Zoom.V16卡尔蔡司荧光显微镜(卡尔蔡司光学有限公司); C1000 Touch梯度PCR仪(伯乐生命医学产品有限公司)。
1.3 动物AB品系野生型斑马鱼，由山东省科学院生物研究所药物筛选重点实验室提供，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。
1.4 金盏菊化学成分与相应靶点基因的收集与筛选通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php)检索金盏菊药物的全部化学成分并进行筛选，筛选条件为：口服生物利用度(OB)≥30%且药物相似性(DL)≥0.18。同时获取金盏菊有效活性成分及相应靶点信息后，利用蛋白质(UniProt)数据库(http://www.uniprot.org/)，转换靶点蛋白质名称为对应的标准化基因名称，所得信息用于后续数据分析。
1.5 AD疾病靶点的收集与筛选通过人类基因平台(DISGENET)数据库(http://www.disgenet.org/)，以“Alzheimer′s disease”为关键词检索与其相关的人类基因，筛选条件为: score＞0.1，最后分别与金盏菊活性成分作用靶点转换的基因名称进行比对，获得金盏菊抗AD的潜在靶点蛋白数据。
1.6 金盏菊活性成分-潜在靶点-AD疾病靶点网络构建根据TCMSP和DISGENET数据库收集筛选以及UniProt数据库转化结果，分别将金盏菊活性成分作用的靶点和AD疾病相关靶点导入基因功能分析(FUNRICHNEW.exe)软件在线构图，得到金盏菊与AD的交集蛋白信息，绘制维恩图。同时将此结果上传至网络可视化生物信息分析软件(Cytoscape 3.7.2)，构建金盏菊有效活性成分和AD疾病靶点间相互作用的网络图，并根据Cytoscape 3.7.2自带功能对此网络图的网络特征进行分析，预测金盏菊改善AD的作用机制。
1.7 靶点蛋白相互作用(PPI)网络构建应用蛋白质网络构建软件(STRING)数据库(http://www.string-db.org/)构建靶点蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络。选择“Multiple Protein”(多种蛋白质)，输入金盏菊与AD共同交集的靶点蛋白名称，选择“Homo sapiens”(人源)的蛋白质种类属性作为筛选条件，下载数据后导入Cytoscape 3.7.2软件，根据度值(Degree)拓扑分析并绘制PPI网络图。
1.8 GO生物功能富集分析通过GO生物功能富集分析可以从生物的功能角度上对基因进行标准化描述，全面注释基因及其产物的生物学功能和属性分析。本研究为验证金盏菊改善AD症状的靶点蛋白在基因功能中的作用，利用基因富集在线分析(Metascape)平台对金盏菊和AD共同交集的基因信息进行GO生物功能富集分析。
1.9 动物实验 1.9.1 实验流程图见Fig 1。
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| Fig 1 Flow chart of experiment At 3 dpf (3 days post fertilization), zebrafish larvae were allocated into different experimental groups. At 6 dpf, the behavior and apoptotic cells of zebrafish larvae was recorded, and the expression of AD apoptosis-related genes was assayed. |
成年雌雄斑马鱼分开饲养于26 ℃恒温斑马鱼养殖水箱中，每日定时喂食丰年虾两次。按雌雄比例1 ∶ 1选择成熟斑马鱼于实验前一日下午放入产卵缸中用隔板隔离，于次日上午8 ∶ 30抽出隔板，约2 h后收取斑马鱼受精卵，在新鲜养殖水中反复冲洗3次，剔出死卵后移入含2 mg·L-1亚甲基蓝的养殖水中，置于恒温培养箱中控光孵化。
1.9.3 分组、造模及给药选取健康的3 dpf斑马鱼幼鱼随机分为空白对照组、造模组(AlCl3溶液80 μmol·L-1)、阳性药组(AlCl3溶液80 μmol·L-1+盐酸多奈哌齐4 μmol·L-1)、低、中、高浓度金盏菊组(根据前期浓度致死率实验统计后，确定金盏菊的最大安全剂量，26 mg·L-1)(AlCl3溶液80 μmol·L-1+金盏菊提取物6.5、13、26 mg·L-1)，每组40条。将各组斑马鱼幼鱼置于6孔培养板中，每孔20条，水环境pH(氢离子浓度指数)值保持在7.0~7.5，恒温保温箱中环境温度保持在28 ℃左右，并且始终模拟昼夜交替(光照10 h和遮光14 h)环境。空白组板孔中给予纯净水，其他组在纯净水中加入相应药液，每日更换一次新鲜纯净水和药液，连续给药3日至6 dpf。
1.9.4 行为学实验运动能力下降、反应能力减退是AD患者典型的临床表现，拟通过明暗交替行为学实验检测金盏菊改善斑马鱼AD样行为的效果。从各组中随机选取6 dpf斑马鱼放入48孔板中(n=10)，每孔加入1 mL纯净水后吸入1条鱼，再将48孔板放入斑马鱼行为分析仪暗箱中，在斑马鱼适应环境10 min后开始正式实验，检测时间设置为60 min(黑暗环境10 min和明亮环境10 min，交替循环3次)，视频记录其运动轨迹，之后运用Zeblab软件处理数据，计算每条鱼在明暗交替环境下的游动总距离和平均速度。
1.9.5 斑马鱼脑区细胞凋亡情况检测脑区细胞凋亡是AD典型的病理学特征之一，拟通过TUNEL染色实验方法，对各组斑马鱼脑区细胞凋亡情况进行检测，验证斑马鱼AD样行为与脑区细胞凋亡的关联一致性。根据行为学实验的量效关系，选定26 mg·L-1作为金盏菊给药浓度，分别从空白对照组、造模组、阳性药组和金盏菊组中随机选取6 dpf斑马鱼，经多聚甲醛固定并4 ℃过夜处理。第二日按照一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，对斑马鱼脑区凋亡细胞染色，利用AXIO Zoom.V16蔡司荧光显微镜观察，采集图像并统计各组斑马鱼脑区凋亡细胞数量。
1.9.6 探究金盏菊改善斑马鱼AD样症状的作用机制通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)实验方法探究金盏菊改善斑马鱼AD样症状的细胞凋亡机制。分别从空白对照组、造模组、阳性药组和金盏菊组随机收集斑马鱼于EP(eppendorf)管中(n=30)，加入裂解缓冲液在组织研磨机中机械匀浆后离心取上清液，提取RNA(ribonucleic acid)，利用超微量分光光度计测定浓度，A260/A280应在2.0~2.5之间。立即使用C1000 Touch梯度PCR仪将RNA反转为cDNA(complementary DNA)，期间严格按照试剂盒说明书操作。以各组反转完成后的cDNA为模板，加入待测引物在qRT-PCR仪器中扩增后，输出各组别目的基因的CT(Cycle Threshold)值，以Rpl13a为内参基因，通过2-ΔΔCT相对定量法计算不同组别基因的相对表达量。
1.10 统计学方法采用Graphpad Prism 7.0软件对实验数据进行统计分析，对实验结果进行One-way ANOVA检验，并以x±s表示。
2 结果 2.1 金盏菊有效活性成分及作用靶点通过TCMSP数据分析平台收集到金盏菊活性成分共35个，根据Lipinski(类药性五原则)标准，以OD%≥30;DL≥0.18为筛选条件，筛选出8个化合物作为金盏菊有效活性成分(Tab 1)，对应235个靶点，删除重复靶点后剩余187个作用靶点。
| Mol ID | Molecule name | OB (%) | DL |
| MOL000098 | Quercetin | 46.43 | 0.28 |
| MOL000354 | Isorhamnetin | 49.60 | 0.31 |
| MOL000359 | Sitosterol | 36.91 | 0.75 |
| MOL000449 | Stigmasterol | 43.83 | 0.76 |
| MOL000953 | CLR | 37.87 | 0.68 |
| MOL005440 | Isofucosterol | 43.78 | 0.76 |
| MOL006090 | 4β-methylstigmasta-7, 24(28)-diene-3β-ol | 43.28 | 0.78 |
| MOL006098 | Faradiol | 37.47 | 0.75 |
通过DISGENET数据分析平台收集到与AD相关靶点蛋白信息，筛选出221个AD靶点。依据UniProt数据库转换结果，绘制AD-金盏菊交集靶点维恩图(Fig 2)。利用Cytoscape 3.7.2分析软件将活性成分与靶点的对应关系可视化为金盏菊抗AD成分-靶点网络关系图，共包括455条边和385个节点。
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| Fig 2 Ingredients-targets network of C.officinalis against AD Venn diagram of C. officinalis anti-AD target proteins. Blue: The number of AD targets. Yellow: The number of C. officinalis targets. Green: The number of intersection targets. |
将上述筛选的32个金盏菊抗AD的潜在作用靶点蛋白导入STRING数据库中，得到靶点蛋白间的相互作用信息。将结果导入Cytoscape 3.7.2数据库中构建金盏菊抗AD的PPI网络图(Fig 3)，共有32个节点代表靶点和208条边代表靶点间相互作用关系，节点与边相互交错，提示金盏菊抗AD的潜在靶点间关联密切，金盏菊通过多靶点多通路发挥抗AD作用。图中的节点颜色越深，表示该节点Degree越大，度值较大的关键靶点为CASP3、VEGFA、TNF等，提示它们可能在金盏菊抗AD中发挥重要作用。
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| Fig 3 The protein-protein interaction network of anti-AD targets of C. officinalis The circle represented the target point. The red was the key target point. |
将金盏菊抗AD的32个潜在作用靶点蛋白导入Metascape平台数据库中进行GO功能富集分析，可以获得与蛋白相对应的基因生物学功能，包括细胞组分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)3个方面。通过GO功能富集分析共收集到42条结果，根据基因数值，列出前20条GO功能富集分析结果(Tab 2)。上述靶点蛋白对应基因的分子功能主要涉及细胞凋亡、毒物质反应、活性氧代谢等方面。其中细胞凋亡排在首位，提示抗凋亡机制在金盏菊抗AD活性中发挥重要作用。
| No. | GO ID | Description | Number of genes | P value |
| 1 | GO: 0097190 | Apoptotic signaling pathway | 16 | 5.01×10-19 |
| 2 | GO: 0009636 | Response to toxic substance | 15 | 2.19×10-18 |
| 3 | GO: 0072593 | Reactive oxygen species metabolic process | 14 | 2.45×10-20 |
| 4 | GO: 0030335 | Positive regulation of cell migration | 14 | 3.24×10-16 |
| 5 | GO: 0009617 | Response to bacterium | 14 | 1.62×10-14 |
| 6 | GO: 0048608 | Reproductive structure development | 13 | 5.37×10-16 |
| 7 | GO: 1901699 | Cellular response to nitrogen compound | 13 | 9.77×10-14 |
| 8 | GO: 0009611 | Response to wounding | 13 | 2.09×10-13 |
| 9 | GO: 0070482 | Response to oxygen levels | 12 | 6.03×10-15 |
| 10 | GO: 0097193 | Intrinsic apoptotic signaling pathway | 11 | 8.51×10-15 |
| 11 | GO: 0042803 | Protein homodimerization activity | 10 | 1.48×10-9 |
| 12 | GO: 1903409 | Reactive oxygen species biosynthetic process | 10 | 1.15×10-16 |
| 13 | GO: 0045862 | Positive regulation of proteolysis | 10 | 6.31×10-12 |
| 14 | GO: 0071407 | Cellular response to organic cyclic compound | 10 | 1.26×10-10 |
| 15 | GO: 0045121 | Membrane raft | 10 | 1.66×10-12 |
| 16 | GO: 0001819 | Positive regulation of cytokine production | 9 | 1.26×10-9 |
| 17 | GO: 0019904 | Protein domain specific binding | 8 | 8.13×10-7 |
| 18 | GO: 0048872 | Homeostasis of number of cells | 8 | 2.95×10-10 |
| 19 | GO: 0018105 | Peptidyl-serine phosphorylation | 8 | 1.32×10-9 |
| 20 | GO: 0071214 | Cellular response to abiotic stimulus | 8 | 2.29×10-9 |
本研究对不同实验组的斑马鱼进行了明暗交替行为学检测(n=10)，以检测其运动能力和对应激刺激的恢复能力，结果见Fig 4。相比于空白对照组，造模组斑马鱼的AD样行为表现在游动的平均速度明显变慢、对光亮刺激后的恢复能力下降(Fig 4A，造模组所示)，游动总距离明显减少(Fig 4B，造模组所示)(P < 0.01);与造模组比较，阳性药组与金盏菊组斑马鱼游动的平均速度变快、对光亮刺激后的恢复能力提高(Fig 4A，阳性药组和金盏菊组所示)，游动总距离明显增加(Fig 4B，阳性药组和金盏菊组所示)，差异具有统计学意义(阳性药组：P < 0.05;金盏菊组：P < 0.01)。研究结果表明，金盏菊可以改善斑马鱼AD样行为，且抗AD活性与其浓度呈正相关。
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| Fig 4 The relieving effect of positive drugs and C.officinalis on AD-like behavior in zebrafish (n=10) A: a: the control group, b: the model group, c: the positive control group, d: the low C.officinalis group, e: the medium C.officinalis group, f: the high C.officinalis group. The average swimming speed of zebrafish under alternating light and dark conditions. B: Total distance traveled of zebrafish. The total distance and motion track of each zebrafish were analyzed by zeblab software. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AlCl3 treatment group. motion track. |
基于前期文献报道和网络药理学结果，AD与细胞凋亡之间关系密切，本研究通过对斑马鱼脑区开展TUNLE细胞凋亡检测以验证金盏菊抗AD的活性和与凋亡相关的内在机制。如Fig 5所示，与空白对照组相比，造模组斑马鱼脑区凋亡细胞数量明显增加(P < 0.01);与造模组相比，阳性药组和金盏菊组凋亡数量明显减少(P < 0.01)，表明金盏菊对斑马鱼脑区细胞凋亡具有一定缓解作用。结合上述金盏菊改善AD样行为的实验结果，本研究验证了金盏菊的抗AD活性和与抗凋亡相关的作用机制，提示抗凋亡极有可能是金盏菊发挥抗AD活性的作用途径。
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| Fig 5 Comparison and statistic analysis of apoptotic cells in zebrafish brain regions A: a: the control group, b: the model group, c: the positive control group, d: the C.officinalis group. The zebrafish larvae were dosed for 3 dpf to 6 dpf, then stained with TUNEL assay. Representative lateral and ventral views of the zebrafish heads. B: Apoptotic cells were found in brain regions (n=6). Scale bar, 200 μm. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs AlCl3 treatment group. |
为探究金盏菊改善AD症状的机制，本研究采用qRT-PCR检测不同实验组CASP3 mRNA的表达水平。结果显示(Fig 6)，与空白对照组相比，CASP3表达水平明显上调(P < 0.01);与造模组相比，CASP3表达水平在金盏菊组下降，差异具有统计学意义(P < 0.05)，阳性药组虽有下降趋势但差异无统计学意义，实验结果表明，金盏菊能够调控凋亡相关基因的异常表达。
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| Fig 6 Expression of AD apoptosis-related genes a: the control group, b: the model group, c: the positive control group, d: the C.officinalis group. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs AlCl3 treatment group. |
网络药理学融合了多学科、多领域，从系统性角度为中药活性成分和作用机制研究提供了全新的研究方向，同时可为中药的药效开发提供有效性和科学性理论基础。本研究通过网络药理学方法，从金盏菊-活性成分-作用靶点相互作用网络中预测出槲皮素(quercetin)和豆甾醇(stigmasterol)是抗AD的关键化学成分，这与之前的研究结果一致[8-9]。Rifaai等[10]报道，在AlCl3诱导的大鼠AD模型中，槲皮素有助于神经再生和甲状腺激素(thyroid hormone，TH)分泌，缓解了AlCl3对海马神经元的破坏，显著降低了神经元退行性改变，减少了淀粉样斑块(amyloid plaques，APs)和神经原纤维缠结的形成。Burg等[11]研究表明，豆甾醇可降低脂质筏中胆固醇和早老素的分布，以减少APs的产生，进而缓解神经元变性损伤，表现出抗AD活性。由此推测，上述化学成分可能是金盏菊改善AD的药效物质。然而金盏菊改善AD的效果和作用机制尚不明晰，有待进一步研究。
相对于传统的哺乳类动物实验模型，斑马鱼模型繁殖速度快、便于饲养和操作，可以有效弥补并完善现有药物筛选和研发体系，提高药物筛选效率、降低研发成本，现已被应用于多种人类疾病研究。Sang等[12]通过斑马鱼AD模型揭示出芹菜素能够通过抗氧化途径缓解斑马鱼AD样症状，验证了以斑马鱼为模型进行抗AD机制探究的可行性。
AD是一种发病机制复杂、疗程长且难治愈的神经退行性疾病。现代医学认为，细胞凋亡是导致AD发病及进展的关键调控途径[13]。金盏菊抗AD的32个潜在作用靶点GO富集分析结果显示，金盏菊抗AD主要通过细胞凋亡、活性氧代谢等途径发挥作用，说明金盏菊抗AD呈现多靶点、多途径协同作用方式，避免了传统治疗效果单一的短板。在GO富集分析结果中，细胞凋亡信号途径居于首位，提示该通路与金盏菊缓解AD症状密切相关。本结果与既往文献报道[14]契合，为下一步机制验证提供了理论基础。
通过PPI网络图发现，金盏菊与AD靶点存在紧密的相互作用关系，其中CASP3、VEGFA、TNF是网络图中的关键靶点，且与金盏菊活性成分具有较好的结合性。以往研究表明，VEGFA可拮抗异常载脂蛋白APOE(apolipoprotein E)，在AD高风险人群中发挥保护作用[15]。据Drews等[16]报道，氯沙坦通过降低炎性细胞因子TNF表达水平，改善从成年转基因AD小鼠中星形胶质细胞的迁移特性。CASP3是细胞凋亡过程中发挥重要作用的终末剪切酶，通过自我活化参与其他家族蛋白酶的活化过程，浆化细胞膜引起细胞凋亡，继而产生AD典型病理学表现——Aps，诱导AD患者产生认知和行为功能障碍[17]。为探究金盏菊改善AD的作用机制，本研究采用TUNEL染色方法，对各实验组斑马鱼脑区凋亡细胞数量进行比较。结果显示，造模组凋亡细胞数量明显增多，且凋亡趋势与以往文献报道相似[14]。金盏菊处理后斑马鱼脑区细胞凋亡数目减少，验证了金盏菊的抗凋亡活性。王玥等[18]已通过实验揭示阿魏酸可降低CASP3表达水平，从而起到改善AD症状的作用。本研究经qPT-PCR方法进一步验证金盏菊抗AD的凋亡机制，结果显示金盏菊可调节斑马鱼CASP3 mRNA的异常表达，提示金盏菊可以抑制细胞凋亡，缓解斑马鱼AD样症状，与上述网络药理学结果相一致。
综上所述，本研究应用网络药理学方法预测了金盏菊抗AD的主要作用靶点蛋白，构建交互作用网络图，运用金盏菊活性成分抗AD靶点蛋白的生物过程富集分析，阐述了金盏菊通过多靶点、多通路发挥抗AD活性的作用机制，其中细胞凋亡途径综合性关联程度最高。通过体内实验对网络药理学数据进一步验证，结果显示金盏菊可以有效改善斑马鱼AD样症状，且抗凋亡途径参与这一生物学过程。
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