2. 成都中医药大学临床医学院，四川 成都 610075;
3. 攀枝花市中西医结合医院耳鼻喉科, 四川 攀枝花 617000;
4. 成都中医药大学药学院，四川 成都 611137
2. College of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China;
3. Dept of Otolaryngology, Panzhihua Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Panzhihua, Sichuan 617000, China;
4. College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China
新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)通过飞沫传播、气溶胶传播、接触传播等途径进入人体而诱发的急性呼吸道传染病。SARS-CoV-2病毒常从鼻咽进入机体，与细胞膜上的病毒受体结合后开始复制、增殖，因此患者鼻中的SARS-CoV-2病毒载量高于咽喉部[1]。变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉科常见的过敏性疾病，发病率高，随着环境污染日益加重，目前已影响了全球多达40%的人口[2]。患有严重过敏性疾病的患者可能面临更大的COVID-19感染风险和更严重的临床症状。韩国的一项全国性队列研究表明，在7 340名COVID-19患者中，有4 210名(57.4%)患者患有变应性鼻炎[3]。这些患者免疫力弱、敏感性高，较其他人更易感染COVID-19，感染后也更容易出现严重的临床症状。因此，对于感染了COVID-19的AR患者，应采取及时有效的治疗措施防止症状加重。但目前还没有针对COVID-19或AR的特异性药物，因此寻找治疗COVID-19合并AR的替代和补充疗法非常重要。
中医是以辨证论治为诊疗特点的传统医学，在COVID-19及AR的治疗中发挥着重要的作用。在2020年2月发表的《2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染肺炎快速诊断与治疗指南(标准版)》中，已经将中医疗法纳入COVID-19的预防和治疗措施当中[4]。作为中医经典方剂，桂枝汤(Guizhi decoction，GZD)来源于《伤寒论》，由大枣、桂枝、甘草、白芍和生姜组成。基于辨证论治的理论，桂枝汤被中医广泛应用于COVID-19合并AR的临床防治中。现代药理研究表明，桂枝汤具有抗菌、抗炎、抗病毒的作用，并能有效提高患者的机体免疫力[5]。在《新型冠状病毒肺炎(COVID-19)经方防治推荐方案(国际第1版)》中，桂枝汤被推荐为COVID-19预防方[6]。对于抵抗力弱、慢性病多发的老年人群体，湖南省推荐桂枝汤作为老年人预防COVID-19的中药方剂[7]。此外，作为中医经典方剂，桂枝汤对AR的治疗作用也在临床试验中得到了证实[8]。然而，用传统的方法来阐明桂枝汤治疗COVID-19合并AR的多化合物、多靶点、多途径的复杂机制具有挑战性。因此，利用网络药理学及分子对接技术来解释桂枝汤治疗COVID-19合并AR的药理学机制具有重要意义。
1 资料与方法 1.1 桂枝汤活性成分及靶基因的预测从TCMSP数据库(https://tcmspw.com/index.php)中筛选桂枝汤的组成药物(大枣、桂枝、甘草、白芍、生姜)的主要活性成分。筛选参数为药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%。然后利用这些活性成分在TCMSP数据库中的MOL ID号预测它们对应的靶蛋白，并借助UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)标准化蛋白质的基因名称。
1.2 预测疾病相关基因在GeneCards数据库中将物种设置为“Homo sapiens”，输入关键词“novel coronavirus”及“allergic rhinitis”来检索与COVID-19和AR相关的靶基因。
1.3 筛选共有靶点及桂枝汤的关键成分借助Draw Venn Diagram网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)筛选药物和疾病的共有靶点，以明晰桂枝汤、COVID-19和AR之间的联系。应用Cytoscape 3.7.1软件构建“中药-活性成分-靶点”网络，来展示共有靶点和桂枝汤中作用于这些靶点的活性成分之间的关系。然后，根据活性成分在网络中的度值，筛选出排名前5的关键成分，并从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得这5个关键成分的2D结构。
1.4 构建共有靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络并进行分析将上一步获得的共有靶点输入到String在线数据库中(https://string-db.org/)，物种设置为“Homo sapiens”，中等置信度=0.400，生成蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络。利用Cytoscape 3.7.1软件将PPI网络可视化，并根据共有靶点在网络中的度值进行排列，最终筛选出核心靶点。
1.5 共有靶点的基因功能富集分析利用Metascape数据库(https://metascape.org/)，从生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞成分(cellular component，CC)3个方面对共有靶点进行GO富集分析(P＜0.01)。将共有靶点导入KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)进行KEGG富集分析，设置筛选标准为P＜0.01。使用Hiplot网络平台(https://hiplot.com.cn)，绘制前10个GO条目(包括BP、CC、MF)和前20条KEGG通路的气泡图和“KEGG通路-共有靶点”网络图，对前10个GO条目和前20个KEGG通路进行分析。
1.6 核心靶点与关键成分之间的分子对接从RCSB-PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心靶点的蛋白质3D结构，导入PyMOL 2.4.1软件中进行氢化、脱水和配体分离。同时，通过Chembio Office软件将关键成分处理为mol2格式文件。然后，利用AutoDockTools 1.5.6软件及Autodock Vina 1.1.2软件，进行核心靶点与关键成分之间的分子对接。分子对接结合能负值越高的受体分子在对接构象中越稳定。
2 结果 2.1 桂枝汤活性成分及靶基因的预测从TCMSP数据库中检索到桂枝汤的五味中药共含127个活性成分，这些成分共预测到2 554个靶蛋白。从中剔除重复的靶蛋白，利用UniProt数据库对这些蛋白的基因名标准化，得到394个靶基因。
2.2 预测疾病相关基因在GeneCards数据库中检索到COVID-19和AR的相关基因后，删除其中的重复基因和得分低于中位数的基因，最终筛选出350个COVID-19相关靶点和938个AR相关靶点。
2.3 筛选共有靶点及桂枝汤的关键成分在Draw Venn Diagram网站生成的Venn图中，桂枝汤、COVID-19和AR共有52个共有靶点(Fig 1)。基于所获得的数据，结合Cytoscape 3.7.1软件构建了一个包含165个节点和690条边的“中药-活性成分-靶点”网络(Fig 2)。如Fig 2所示，5种中药的108个活性成分作用于这52个共有靶点，桂枝中有6个，生姜中有4个，大枣中有17个，白芍中有4个，甘草中有86个。其中，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山奈酚和(+)- 儿茶素存在于两种或两种以上的中药中。网络中按度值排名前5位的活性成分是槲皮素(78)、β-谷甾醇(36)、山奈酚(34)、柚皮素(12)和(+)- 儿茶素(12)。这5种活性成分可能就是桂枝汤发挥抗病毒、抗过敏作用以治疗COVID-19合并AR的关键物质基础。
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| Fig 1 Venn diagram summarizing common targets of GZD, COVID-19 and AR Guizhi decoction |
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| Fig 2 The "herbal-active component-target" network Green diamonds: herbs; pink octagons: active components that belong to only one herb; red octagons: active components belonging to two or more herbs; blue round rectangles: common targets; gray lines: the interrelationships between herbs, active components, and common targets; DZ: Ziziphus jujuba; GZ: Cinnamomum cassia; GC: Glycyrrhiza uralensis; BS: Paeonia albiflora; SJ: Zingiber officinale. The active component is indicated by the MOL ID in TCMSP database. |
用Cytoscape 3.7.1软件生成具有52个节点和1 151条边的共有靶点PPI网络(Fig 3)。在图中形状越大，颜色越深，靶点的度值就越高，在网络中就越重要。比较度值发现，IL-6、TNF、MAPK3、MAPK8、IL-2、IL-10、CXCL8、IL-4、MAPK1和EGFR是排名前10的核心靶点。
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| Fig 3 PPI network of common targets |
为了阐明桂枝汤治疗COVID-19合并AR的多重作用机制，本研究分别通过Metascape数据库和KEGG数据库对52个共有靶点进行了GO和KEGG富集分析，并获得显著富集的1 523个GO条目(BP 1 428个，CC 28个，MF 67个)和145条KEGG通路(P＜0.01)。在Hiplot平台上，用气泡图(Fig 4)展示前10个GO条目及前20条KEGG通路富集分析的情况。结果提示，BP主要涉及细胞对生物刺激的反应、T细胞活化、细胞因子产生的正调控等；CC主要涉及细胞膜区、质膜、细胞-底物连接部位等；MF主要涉及细胞因子活性、信号受体激活剂活性、受体配体活性等；KEGG通路包括Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路、IL-17信号通路等。观察“KEGG通路-共有靶点”网络图(Fig 5)，可发现前20条KEGG通路与52个共同靶点中的43个存在相互作用。这一结果也与这20条主要通路显著富集的结果一致。
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| Fig 4 Bubble diagrams of GO and KEGG enrichment analysis of common targets The top 10 GO (BP, CC, MF) terms and the top 20 KEGG pathways were shown in bubble diagrams. |
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| Fig 5 The "KEGG pathway-common target" network diagram Blue nodes: the top 20 KEGG pathways; red nodes: common targets; colored lines: the connection between KEGG pathways and common targets. |
通过比较排名前5的关键成分的2D结构，发现槲皮素的结构与山奈酚、柚皮素、(+)- 儿茶素相似，因此以槲皮素作为这3种关键成分的代表进行分子对接。β-谷甾醇的2D结构与其它四种化合物有明显不同，因此也选择它进行分子对接。借助PyMOL 2.4.1软件、AutoDockTools 1.5.6软件和Autodock Vina 1.1.2软件，将这两种关键成分(槲皮素、β-谷甾醇)与前3个核心靶点(IL-6、TNF、MAPK3)进行分子对接。如Fig 6所示，关键成分与核心靶点可以很好地结合。最佳模式下，槲皮素-IL-6、槲皮素-TNF、槲皮素-MAPK3的结合能分别为-4.8、-7.2、-9.1 kcal·mol-1；β-谷甾醇-IL-6、β-谷甾醇-TNF、β-谷甾醇-MAPK3的结合能分别为-7.2、-7.7、-7.7 kcal·mol-1。
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| Fig 6 Molecular docking results A: Quercetin+IL-6;B: Quercetin+TNF; C: Quercetin+MAPK3;D: Beta-sitosterol+IL-6;E: Beta-sitosterol+TNF; F: Beta-sitosterol+MAPK3 |
本研究共筛选出桂枝汤的127个有效成分和394个基因靶点。经过分析Venn图和“中药-活性成分-靶点”网络图，发现桂枝汤可通过108个活性成分与52个共有靶点的结合来发挥治疗作用。108个活性成分的大多数来源于甘草，这提示甘草应该是桂枝汤治疗COVID-19合并AR的关键药物。根据度值筛选出的关键成分主要属于黄酮类、植物甾醇类和酚类；核心靶点多为促炎细胞因子。共有靶点显著富集于1 523个GO条目和145条KEGG通路中，包括与抗病毒、抗过敏、抗炎机制相关的条目和通路，如T细胞活化、细胞因子产生的正调控、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路、Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信号通路和IL-17信号通路。最后，经过分子对接证实了关键成分可以自发地与核心靶点相结合。
前5位关键成分中，(+)- 儿茶素属于酚类化合物，β-谷甾醇属于植物甾醇类，其他三种活性成分属于黄酮类化合物。这表明，黄酮类、植物甾醇类、酚类化合物是桂枝汤治疗COVID-19合并AR的关键。研究证实，黄酮类化合物不仅可以直接杀灭病毒，减轻炎症[9]；而且还可以通过调节Th1/Th2细胞平衡来调节变应性鼻炎患者的免疫机制[10]。儿茶素可以降低血清中IgE、IL-5、IL-13的水平，恢复Th1/Th2细胞平衡，并有效的减轻AR的炎症反应[11]。β-谷甾醇广泛存在于多种中草药中，具有抗病毒、抗氧化和抗菌活性，且它的抗病毒及抗过敏作用与抗病毒及免疫相关信号通路的传导有关[12-13]。
为了确定共有靶点之间的相互作用，本研究构建了PPI网络，并根据度值筛选出前10个核心靶点，即IL-6、TNF-α、MAPK3、MAPK8、IL-2、IL-10、CXCL8、IL-4、MAPK1和EGFR。这些靶点是桂枝汤治疗COVID-19合并AR的关键靶点。在COVID-19的发病过程中会引发炎症及免疫反应，还会激活多种细胞因子，如TGF-β、IL-6、STAT3等[14]。研究人员在重度COVID-19患者的血浆中也发现，TNF-α、IL-2、IL-7、IL-10等细胞因子的水平较高[15]。MAPK1、MAPK3和MAPK8广泛存在于多种中草药中，参与了细胞增殖、分化、转化、凋亡等生物过程的调节，它们是治疗COVID-19的重要靶点[12]。
通过分析GO条目可以发现桂枝汤在T细胞活化、细胞因子产生的正调控、膜区、质膜、细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性等方面具有特异性作用。桂枝汤的抗过敏和抗病毒作用与显著富集的KEGG通路有关，这些通路包括：Coronavirus disease-COVID-19通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路及IL-17信号通路。在Coronavirus disease-COVID-19通路中有17个共有靶点参与，这表明桂枝汤可以通过这17个靶点直接作用于Coronavirus disease-COVID-19通路，从而在COVID-19的治疗中发挥不可或缺的作用。NF-κB是多种损伤反应基因的多效调节因子，NF-κB信号通路可促进促炎细胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6)的转录，它还能触发Th1、Th17介导的免疫反应，促进IFN-γ和IL-17的释放[16]。Toll样受体是固有免疫和适应性免疫的重要参与者，它在识别气道中潜在的病原体及激活相应的免疫反应的过程中起重要作用[17]。T细胞受体信号通路传导的复杂分子机制会引起T细胞的活化，从而影响机体的免疫反应[18]。
综上所述，本研究表明桂枝汤主要通过黄酮类、植物甾醇类、酚类等活性成分与共有靶点(IL-6、TNF、MAPK3等)的结合，来参与病毒、免疫、炎症相关信号通路和生物细胞过程的调节，最终达到治疗COVID-19与AR的目的。
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