2. 河南中医药大学第一临床医学院，河南 郑州 450000;
3. 河南中医药大学药学院，河南 郑州 450000;
4. 河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450000
2. The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China;
3. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China;
4. The Second Afficiated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China
狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)累及肾脏致免疫复合物沉积而形成的炎症性肾病，病程较长且易反复发作，若不及时控制可造成严重的肾脏损伤。LN尚无对应的中医病名，可根据临床症状将其归类为“肾痹”“阴阳毒”等范畴，病因病机为风湿内扰于肾。雷公藤为卫矛科藤本植物雷公藤的干燥根，其味苦辛，能燥能行，祛风除湿、活血通络，治疗LN风湿扰肾证[1]。现代药理研究发现雷公藤具有抗炎、止痛和免疫抑制等作用，具有与糖皮质激素相似的治疗效应，已成为国内治疗狼疮性肾炎的常用药物。但是雷公藤制剂也会造成肾功能衰竭、肾功能不全、血尿、少尿、肌酐升高等与肾脏相关的不良反应[2]，因此，LN治疗选用雷公藤时应该更加谨慎。本研究采用网络药理学方法构建雷公藤干预LN的作用机制网络，分析作用网络中的关键靶点和信号通路，探讨雷公藤对LN的效-毒作用，为进一步研究评价雷公藤治疗LN整体效果提供思路及依据。
1 材料与方法 1.1 数据库及软件本研究利用中草药系统药理学平台(TCMSP)数据库获取雷公藤主要活性成分及靶点；从CoolGeN数据库、OMIM数据库和GeneCards数据库中搜集狼疮性肾炎相关靶点；运用Uniprot数据库将获得的蛋白靶点名称标准化后通过STRING数据库分析蛋白相互作用关系；使用Venny在线工具及Cytoscape3.7.1软件分析药物疾病共同靶点形成韦恩图，并构建“药物-成分-靶点图”和蛋白互作网络图。
1.2 雷公藤成分及靶点筛选基于中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集雷公藤的化学成分。根据吸收、分布、代谢、排泄ADME参数筛选出同时满足口服利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18的化学成分并预测其靶点。通过Uniprot(http://www.uniprot.org/)数据库将所得靶点蛋白名转化为标准基因名称。
1.3 狼疮性肾炎相关靶点收集和筛选基于人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http://www.omim.org/)、在线文本挖掘工具CoolGeN数据库(http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php)和GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)，以“lupus nephritis”为关键词收集与狼疮性肾炎相关的疾病靶点。为增加疾病靶点的可信度，收集过程中根据疾病基因出现频率删除支撑文献较少的靶点。将检索结果合并去重得到LN疾病靶点数据库。
1.4 雷公藤对LN作用靶点预测将雷公藤成分靶点和狼疮性肾炎靶点数据库导入Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)分析得到两者共同靶点，即为雷公藤治疗LN的潜在作用靶点。采用Cytoscape3.7.1软件绘制雷公藤-活性成分-潜在作用靶点-LN网络模型。
1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建雷公藤对LN的治疗效应是多个蛋白交互作用的结果。使用蛋白质相互作用网络数据库(STRING11.0)(https://string-db.org/Version 11.0)分析雷公藤治疗LN的作用靶点，限定物种为人(homo sapiens)，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)，去掉游离的靶点，筛选置信度0.400以上的蛋白互作关系数据，将其导入Cytoscape3.7.1软件可视化作用靶点的PPI网络。
1.6 GO和KEGG富集分析为了解中药的靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用，将雷公藤治疗LN靶点导入采用注释、可视化和集成发现数据库(the database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID6.7)(https://David.ncifcrf.gov/)DAVID6.7数据库，进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集与京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG))通路富集分析，P＜0.05，并按照所含的靶点数目进行排序，筛选有统计学意义且可靠的生物过程和通路。
2 结果 2.1 雷公藤成分靶点和狼疮性肾炎疾病靶点筛选通过TCMSP数据库筛选得到雷公藤52种潜在药效成分和对应的167个相关靶点，剔除22个没有对应靶点的成分和94个重复靶点，得到30个药物有效成分和73个对应的靶点，其中多个成分可以共同作用于一个靶点，成分triptolide、tripterine、kaempferol对应的靶点尤多。在CoolGeNCool、OMIM和GeneCards 3个疾病数据库中搜索“lupus nephritis”，去重后共得到1 227个与狼疮性肾炎相关的靶点。
2.2 雷公藤-狼疮性肾炎治疗靶点预测利用VENNY2.1将73个药物靶点与1 227个疾病靶点取交集，药物-疾病共同靶点共有38个，见Fig 1，即为雷公藤治疗狼疮性肾炎的作用靶点。利用Cytoscape3.7.1构建雷公藤-LN调控网络，如Fig 2，图中橘红色圆形代表雷公藤有效成分，蓝色圆形代表雷公藤-LN共同靶点基因。
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| Fig 1 Intersection of predicted targets of Tripterygium wilfordii Hook. f. target and LN |
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| Fig 2 Component-target network of Tripterygium wilfordii Hook. f. in treatment of lupus nephritis |
在String中分析得到雷公藤-狼疮性肾炎作用靶点的PPI网络，包括35个节点，207条边。以节点大小和颜色深度代表相邻节点数目，相邻节点越多，节点越大，颜色越深，在PPI网络中的地位就越重要。以边的粗细代表Combined score，即相互关系的综合得分，Combined score值越高，边越粗，两个节点的连接质量越高。Degree值＞13的靶点有13个，具体如Fig 3。
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| Fig 3 PPI network of Tripterygium wilfordii Hook. f. for LN |
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| Fig 4 Number of PPI genes connecting nodes |
GO富集分析结果显示雷公藤-狼疮性肾炎作用基因的生物过程(biological process, BP)显著富集在凋亡的调节、细胞增殖的调节、细胞通讯的正调控、信号转导的调控、细胞发育的调控、对肿瘤坏死因子的反应、免疫系统发育、对细胞迁移的调控、NF-κB级联的调控、白细胞黏附等；细胞组分(cell component, CC)主要富集在细胞外区域部分、胞质溶胶、细胞器内腔、膜封闭腔、核腔、细胞表面、基底膜等；分子功能(molecular function, MF)主要富集在类固醇激素受体活性、配体依赖性核受体活性、半胱氨酸型内肽酶活性、序列特异性DNA结合、蛋白复合物结合、转录因子活性、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶调节剂活性等。按照统计学P值由小到大部分展示，见Tab 1。
| Category | Term | Count | P value |
| BP | regulation of apoptosis | 14 | 6.75E-08 |
| BP | regulation of cell proliferation | 13 | 4.73E-07 |
| BP | positive regulation of cell communication | 8 | 2.15E-05 |
| BP | positive regulation of signal transduction | 7 | 1.15E-04 |
| BP | regulation of cell development | 6 | 1.96E-04 |
| BP | response to tumor necrosis factor | 3 | 5.27E-04 |
| BP | immune system development | 6 | 7.66E-04 |
| BP | positive regulation of cell migration | 4 | 1.68E-03 |
| BP | positive regulation of I-κB kinase/NF-κB cascade | 4 | 2.15E-03 |
| BP | leukocyte adhesion | 3 | 2.49E-03 |
| BP | positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter | 6 | 2.83E-03 |
| BP | epithelium development | 5 | 2.98E-03 |
| BP | leukocyte differentiation | 4 | 5.02E-03 |
| CC | extracellular region part | 11 | 1.35E-04 |
| CC | cytosol | 12 | 4.42E-04 |
| CC | organelle lumen | 13 | 4.11E-03 |
| CC | membrane-enclosed lumen | 12 | 5.79E-03 |
| CC | nuclear lumen | 10 | 1.14E-02 |
| CC | cell surface | 5 | 1.32E-02 |
| CC | basement membrane | 3 | 1.82E-02 |
| MF | steroid hormone receptor activity | 5 | 9.65E-06 |
| MF | ligand-dependent nuclear receptor activity | 5 | 1.90E-05 |
| MF | cysteine-type endopeptidase activity | 4 | 1.02E-03 |
| MF | sequence-specific DNA binding | 8 | 1.20E-03 |
| MF | protein complex binding | 5 | 2.03E-03 |
| MF | transcription factor activity | 8 | 1.61E-02 |
KEGG通路富集结果显示雷公藤-狼疮性肾炎主要富集在细胞凋亡途径(apoptosis)、黏着斑途径(focal adhesion)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、p53信号通路(p53 signa-ling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、RIG-I样受体信号通路(RIG-I-like receptor signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)等，见Tab 2。
| Pathway | Count | Gene |
| Focal adhesion | 7 | COL4A4, CCND1, FLT1, BCL2, VEGFA, MAPK8, BIRC2 |
| NOD-like receptor signaling pathway | 4 | RELA, CASP8, MAPK8, BIRC2 |
| p53 signaling pathway | 4 | CCND1, CASP3, CASP9, CASP8 |
| Toll-like receptor signaling pathway | 4 | FOS, RELA, CASP8, MAPK8 |
| RIG-I-like receptor signaling pathway | 3 | RELA, CASP8, MAPK8 |
| MAPK signaling pathway | 5 | FOS, CASP3, RELA, MAPK8, MYC |
根据KEGG通路富集结果分析，雷公藤对LN治疗作用主要表现在抑制免疫及炎症、肾间质纤维化和血管损伤等方面，见Fig 5。①调控免疫及炎症：NOD样受体家族、RIG-Ⅰ受体家族和Toll样受体家族等模式识别受体是免疫系统的重要组成部分。NOD样受体信号通路在狼疮性肾脏疾病中介导早期炎症反应、炎症因子的致纤维化作用、诱导肾脏固有细胞转分化、促使肾小球系膜细胞增殖等[3]。核心靶点RELA、CASP8、MAPK8等富集在此通路中，RELA作为NF-κB的组分可能通过上调促炎症介质和促进巨噬细胞浸润而加剧肾组织炎症的发生；MAPK8激活胞内转录因子c-jun氨基末端激酶等调节肾组织炎症反应和纤维化过程[4]，在狼疮样小鼠肾组织中表达上调, 成分雷公藤甲素使MAPK8进核受阻从而抑制促炎细胞因子的释放[5]。RIG-Ⅰ受体信号通路和TOLL样受体信号通路也可促进促炎因子和干扰素IFN等分子的表达，引起LN的异常炎症反应，参与肾脏增生性改变[6]。富集在这两条通路中的核心靶点FOS组成激活子蛋白AP-1，通过下游促炎分子网络参与LN肾小管间质损伤[7]。②抑制肾间质纤维化和血管损伤：P53信号通路可通过诱导凋亡和抑制增殖促进肾脏系膜细胞增生的恢复[8]。在此通路中，细胞周期调控蛋白CCND1能够促使细胞持续增殖，研究证明CCND1与肾小球增殖程度密切相关, 而雷公藤中雷公藤红素等多种成分能够下调CCND1的表达从而抑制细胞增殖[9]。黏着斑(focal adhesion)是细胞骨架的重要结构，既维持细胞整体形态，又参与信号传递等生命活动。富集在黏着斑通路中的靶点BCL2可调节细胞调亡, 雷公藤成分川陈皮素能够增加BCL2表达水平以调节抗凋亡机制[10]。
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| Fig 5 KEGG pathway of Tripterygium wilfordii Hook. f.-lupus nephritis treatment targets |
蛋白质相互作用网络显示degree＞13的核心靶点还有TIMP1、PPARG、MCL1、ESR1、ICAM1、VCAM1、MYC等。TIMP1能够抑制细胞外基质的降解促进肾小球硬化进程，还能够抑制系膜细胞的凋亡，加剧细胞外基质的蓄积，雷公藤成分雷公藤红素抑制肾脏TIMP1的表达，对狼疮鼠模型的肾小球硬化有明显的延缓作用[11]。MCL1在多种自身免疫性疾病中过表达，可能通过异常调控细胞增殖与凋亡参与LN肾小球增生性病变。ESR1编码雌激素受体α，其表达水平与红斑狼疮抗ANA抗体、抗RAP抗体和临床症状严重程度呈正相关[12]。ICAM-1、VCAM-1被多种细胞因子与炎性介质诱发表达，募集白细胞黏附于肾脏，加重炎症反应引起组织损伤，造成肾组织微循环障碍和组织灌溉失调，最终导致肾脏功能受损，而雷公藤的多种成分对细胞表面黏附分子表达具有抑制作用[13]。原癌基因MYC, 广泛参与细胞周期、细胞凋亡、细胞转化过程，尤其与增殖活跃的组织密切相关，可能通过诱导免疫细胞增殖紊乱而影响狼疮发病。
3.3 潜在毒副作用预测通过查阅文献对研究结果进行分析发现，雷公藤的主要化学成分对肾组织也具有潜在副作用，如Fig 6。CASP3能够启动凋亡过程，研究表明在狼疮性肾炎中CASP3表达上调导致肾小球足细胞凋亡、蛋白尿症状加重，而雷公藤成分雷公藤甲素上调CASP3和CASP9的表达[14]，可能加重蛋白尿症状。VEGFA在PPI网络中是核心靶点，与其受体FLT1具有保护内皮细胞和血管系统完整性的功能，能在炎症环境中保护肾小球滤过屏障[15]，在狼疮性肾炎中VEGFA合成降低且血清受体FLT1升高，导致肾组织内VEGFA不足，致使纤维化和蛋白尿的发生，但实验发现雷公藤甲素等成分能在乳腺癌等疾病中下调VEGFA的表达抑制血管形成[16]，若雷公藤甲素在肾脏组织中具有相同效应，则可能加重肾脏损害；PPARG在受损肾脏细胞上表达增强，具有抗肾脏纤维化作用，雷公藤成分山柰酚和β-谷甾醇被证实分别在骨髓充质干细胞和心肌中表现出对PPARG的抑制作用[17]，其在肾组织中是否具有同样的抑制作用并促使肾脏纤维化还需进一步研究。雄激素受体AR则在SLE发生发展中起保护性作用，雷公藤中多种成分可作用于AR降解途径阻断AR信号通路[18]，干扰雄激素对LN的保护作用。
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| Fig 6 Schematic diagram of corresponding targets of effective-toxic components Pink: up-regulation; blue: Down-regulation; dotted line: potential toxicity |
本研究发现雷公藤成分雷公藤甲素、雷公藤红素、川陈皮素等可能通过RELA、CASP8、MAPK8、BIRC2、FOS、CCND1、BCL2等靶点，在NOD样受体信号通路、RIG-Ⅰ受体信号通路、Toll样受体信号通路、p53信号通路和黏着斑通路中发挥治疗狼疮性肾炎作用，其他核心靶点TIMP1、PPARG、MCL1、ESR1、ICAM1、VCAM1、MYC虽未富集在上述通路中，但也可通过蛋白质相互作用网络发挥治疗作用。有效成分雷公藤甲素具有治疗作用，同时也因作用于靶点CASP3、CASP9、VEGFA可能导致蛋白尿症状加重、肾脏纤维化进程提前。其他成分如山柰酚和β-谷甾醇等也可能通过靶点PPARG、AR促使肾脏纤维化。
本研究运用网络药理学及文献信息整合方法探讨了雷公藤对狼疮性肾炎可能的效-毒作用及其机制，为雷公藤的现代研究、靶向给药和安全应用提供基础。此研究中所预测的雷公藤治疗LN的有效成分、作用通路和效-毒作用需更进一步深入研究、测定和临床验证。
| [1] |
李德平, 翟华强, 曹炜, 等. 雷公藤的药性文献回顾及其作用机制研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(13): 299-303. Li D P, Zhai H Q, Cao W, et al. Literature review of medicinal properties and mechanism research process analysis about Tripterygium wilfordii[J]. Chin J Exp Tradit Med Form, 2012, 18(13): 299-303. doi:10.3969/j.issn.1005-9903.2012.13.083 |
| [2] |
冯雪, 方赛男, 高雨鑫, 等. 雷公藤制剂安全性的循证评价研究[J]. 中国中药杂志, 2018, 43(3): 425-39. Feng X, Fang S N, Gao Y X, et al. Evidence-based evaluation on safety of Tripterygium wilfordii preparations[J]. Chin J Chin Mater Med, 2018, 43(3): 425-39. |
| [3] |
Qu H, Bian W, Xu Y. A novel NF-κB inhibitor, DHMEQ, ameliorates pristane-induced lupus in mice[J]. Exp Ther Med, 2014, 8(2): 100-4. |
| [4] |
杨强, 钦丹萍, 杨新艳, 等. Fas/FasL, p38MAPK通路在溃疡性结肠炎大鼠中的表达及雷公藤多苷的作用[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(2): 218-23. Yang Q, Qin D P, Yang X Y, et al. Effect of Tripteryginum wilfordii polyglycoside on Fas/FasL and p38 MAPK signaling pathway expression in ulcerative colitis rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(2): 218-23. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2019.02.015 |
| [5] |
卢彦. 雷公藤内酯醇调控巨噬细胞功能的新靶标-TAB1[D]. 南京: 南京大学, 2012. Lu Y. TAB1-a new target of triptolide in macrophage[D]. Nanjing: Nanjing Univ, 2012. |
| [6] |
高璠, 汪鑫, 杨冉, 等. HMGB1/TLR4介导狼疮性肾炎肾小球细胞增殖和细胞外基质沉积[J]. 中国药理学通报, 2021, 37(1): 125-31. Gao P, Wang X, Yang R, et al. HMGB1/TLR4 mediates proliferation and extracellular matrix deposition of glomerular mesangial cells in LN[J]. Chin Pharmacol Bull, 2021, 37(1): 125-31. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2021.01.020 |
| [7] |
Zheng L, Sinniah R, Hsu S.I. Pathogenic role of NF-kappaB activation in tubulointer-stitial inflammatory lesions in human lupus nephritis.[J]. J Histochem Cytochem, 2008, 56(5): 517-29. doi:10.1369/jhc.7A7368.2008 |
| [8] |
Lu Y, Wen J, Chen D, et al. Modulation of cyclins and p53 in mesangial cell proliferation and apoptosis during Habu nephritis[J]. Clin Exp Nephrol, 2016, 20(2): 178-86. doi:10.1007/s10157-015-1163-6 |
| [9] |
Lu C H, Yu X X, Zuo K Q, et al. Tripterine treatment improves endothelial progenitor cell function via integrin-linked kinase[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 37(3): 1089-103. doi:10.1159/000430234 |
| [10] |
Lee H J, Lee S K, Lee D R, et al. Ameliorating effect of Citrus aurantium extracts and nobiletin on β-amyloid (1-42)-induced memory impairment in mice[J]. Mol Med Rep, 2019, 20(4): 3448-55. |
| [11] |
Lesiak A, Narbutt J, Sysa-Jedrzejowska A, et al. Effect of chloroquine phosphate treatment on serum MMP-9 and TIMP-1 levels in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Lupus, 2010, 19(6): 683-8. doi:10.1177/0961203309356455 |
| [12] |
Drehmer M N, Andrade D, Pereira I A, et al. Estrogen receptor alpha gene (ESR1) polymorphism can contribute to clinical findings in systemic lupus erythematosus patients[J]. Lupus, 2016, 26(3): 294-8. |
| [13] |
Tu H Q, Li X Y, Gu H, et al. Triptolide inhibits IFN-γ signaling via the Jak/STAT pathway in HaCaT keratinocytes[J]. Phytother Res, 2011, 25(11): 1678-85. doi:10.1002/ptr.3471 |
| [14] |
Wang J, Zhang Z Q, Li F Q, et al. Triptolide interrupts rRNA synthesis and induces the RPL23-MDM2-p53 pathway to repress lung cancer cells[J]. Oncol Rep, 2020, 43(6): 1863-74. |
| [15] |
Zubair A, Frieri M. Lupus nephritis: Review of the literature[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2013, 13(6): 580-6. doi:10.1007/s11882-013-0394-4 |
| [16] |
Liu H T, Tang L B, Li X Y, et al. Triptolide inhibits vascular endothelial growth factormediated angiogenesis in human breast cancer cells[J]. Exp Ther Med, 2018, 16: 830-6. |
| [17] |
Zhu J, Tang H Y, Zhang Z H, et al. Kaempferol slows intervertebral disc degeneration by modifying LPS-induced osteogenesis/adipogenesis imbalance and inflammation response in BMSCs[J]. Int Immunopharmacol, 2017, 43: 236-42. doi:10.1016/j.intimp.2016.12.020 |
| [18] |
郭建全. 雷公藤红素抑制AR诱导前列腺癌细胞自噬的分子机制研究[D]. 哈尔滨: 哈尔滨工业大学, 2016. Guo J Q. A study on the molecular mechanisms of celastrol targetting AR induced autophagy in prostate cancer treatment[D]. Harbin: Harbin Inst Technol, 2016. |