酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是长期饮酒引起的肝脏损害，是进展期肝脏疾病非常重要的原因之一。ALD疾病谱酒精性脂肪肝的发病率也逐渐增高，若得不到有效治疗可导致酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、肝硬化，对患者身体健康有着严重影响[1]。因此，探明ALD的发病机制，以期为探索有效的ALD治疗靶点提供坚实的理论依据尤为重要。白杨素(chrysin，CHR)是广泛存在于蜂蜜、蔬菜、水果中的天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌的活性[2]。该研究采用小鼠Lieber-DeCarli酒精液体饲料联合单剂酒精灌胃模型，探讨白杨素对酒精性肝损伤中SIRT1/AMPK信号通路的调控作用。
1 材料 1.1 实验动物C57BL/6小鼠，♂，体质量(20±2)g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，SCXK(辽)2020-0001。
1.2 药物与试剂白杨素(HY-14589)、SRT1720(SIRT1激动剂，HY-15145)、AICAR(AMPK激动剂，HY-13417)均购买于MCE上海皓元生物公司；Lieber-DeCarli酒精液体饲料(南通特洛菲公司)；甘油三酯(TG)试剂盒(A110-1-1)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(C010-2-1)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(C009-2-1)均购买于南京建成生物工程研究所；AMPKα抗体(cs-5831)、p-AMPKα抗体(cs-2535)、SIRT1抗体(cs-2028)、GAPDH抗体(cs-2118)均购买于CST公司。
2 方法 2.1 动物分组48只C57BL/6小鼠随机分成6组：正常组、酒精模型组(EtOH)、SRT1720组(EtOH+SRT1720)、AICAR组(EtOH+AICAR)、CHR组(EtOH+CHR 25、50 mg·kg-1)，每组8只。
2.2 造模及给药采用Gao-Binge模型方法建立小鼠酒精性肝病模型[3]，应用Lieber-DeCarli的对照饮食适应性喂养5 d后，除正常组外，其余5组给予含5%酒精的Lieber-DeCarli液体饲料喂养。每天1次对CHR组进行不同浓度的CHR灌胃，SRT1720组50 mg·kg-1 SRT1720灌胃，AICAR组500 mg·kg-1 AICAR灌胃，持续喂养10 d。d 11对照组灌胃麦芽糖糊精，其余5组给予5 g·kg-1酒精灌胃，9 h后采用乙醚麻醉小鼠，眼球采血，取出肝脏左前叶用多聚甲醛固定，其余置-80 ℃冻存备用。
2.3 血清生化指标测定使用检测试剂盒测定AST、ALT、TG血清中含量。
2.4 肝组织病理及免疫组织化学检测肝组织病理切片，进行常规HE染色及SIRT1、p-AMPKα免疫组化染色，200倍光学显微镜下观察病理改变。
2.5 肝脏中蛋白表达检测取肝组织匀浆提取蛋白，采用Western blot检测SIRT1、AMPKα、p-AMPKα的表达水平。
2.6 统计学分析采用GraphPad Prism 6.0软件统计分析，实验结果以x±s表示，采用单因素方差分析及Tukey’s多因素分析组间差异。
3 结果 3.1 CHR对小鼠血清中AST、ALT、TG含量的影响如Tab 1结果显示，与正常组相比，EtOH组小鼠血清中AST、ALT、TG含量明显升高(P < 0.01)，与EtOH组相比，CHR给药组呈剂量依赖性降低，SRT1720、AICAR组3者水平均明显降低(P < 0.01)，且CHR高剂量组要低于各激动剂组。
| Group | AST/U·L-1 | ALT /U·L-1 | TG /mmol·L-1 |
| Control | 48.51±4.65 | 12.16±4.49 | 2.89±1.55 |
| EtOH | 89.57±3.56## | 47.74±5.93## | 6.63±1.35## |
| EtOH+SRT1720 | 61.33±4.58** | 20.65±4.96** | 4.68±1.16* |
| EtOH+AICAR | 55.36±3.37** | 21.64±4.83** | 4.35±0.89* |
| EtOH+CHR (25 mg·kg-1) | 59.57±4.23** | 22.78±5.43** | 3.87±0.62** |
| EtOH+CHR (50 mg·kg-1) | 54.58±4.85** | 18.25±4.23** | 3.17±0.53** |
| ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs EtOH. | |||
HE染色结果显示，EtOH组肝细胞肿胀，有脂肪空泡、炎性细胞浸润等病理损伤，CHR给药组随着浓度增加，肝组织病理变化明显减弱，SRT1720、AICAR组小鼠肝组织病理变化明显减轻。
3.3 CHR对小鼠肝脏SIRT1、AMPKα、P-AMPKα表达的影响免疫组化染色结果显示，正常组SIRT1、P-AMPKα细胞染色有大量黄色或棕黄色，EtOH模型组小鼠肝脏SIRT1、P-AMPKα表达明显减少。与EtOH组相比，CHR给药组、SRT1720及AICAR组的SIRT1、P-AMPKα表达明显增加。同时，采用Western blot检测SIRT1、AMPKα、P-AMPKα蛋白表达水平，与正常组比较，EtOH组SIRT1、AMPKα表达水平以及AMPKα的磷酸化水平明显减少(P < 0.01)，与EtOH组比较，CHR给药组以及SRT1720、AICAR组SIRT1、AMPKα表达水平以及AMPKα的磷酸化显著增加，且有一定的剂量依赖性(P < 0.01)。
4 讨论Gao-Binge模型模拟了慢性加急性酒精性肝损伤的患者病程，这种慢加急性协同作用导致小鼠脂肪变性、炎症和肝损伤[4-5]。本研究显示，小鼠酒精模型组的肝脏甘油三酯蓄积，脂肪空泡形成，炎性细胞浸润，表明成功建立Gao-Binge酒精性肝病模型，且CHR给药组的小鼠肝脏脂肪变性减轻，血清中转氨酶指标AST、ALT及TG含量明显降低，表明CHR能够改善酒精性肝损伤。
SIRT1/AMPK信号通路在酒精性肝损伤中起关键作用[6]，本研究发现CHR能够增强SIRT1、AMPKα表达水平及AMPKα的磷酸化作用。综上所述，白杨素能够改善酒精性肝损伤进程，激活SIRT1/AMPK信号通路是其可能的分子机制。
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