肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration，HLD)，即Wilson病(Wilson disease，WD)，是一种ATP7B基因缺陷所致的慢性进行性铜代谢障碍性疾病，全球平均患病率约为1/30 000，认知障碍是其主要的神经症状^[1]。目前现代医学在治疗WD认知障碍方面尚无特效方法，一般用药包括铜螯合剂和脑细胞活化剂等，此类药物虽可在一定程度上缓解患者的相关症状，但存在副作用大、疗效欠佳等问题，从而限制了其临床应用^[2]。中药复方因其副作用小，且具有多成分、多靶点、多通路的特点，近年来逐渐成为WD认知障碍防治的研究热点。

肝豆灵是安徽中医药大学第一附属医院所创制的具有自主知识产权的院内制剂，由丹参、莪术、姜黄、鸡血藤、黄连、生大黄六味中药组成^[3]。该方重用姜黄、黄连为君，活血行气、化痰燥湿，取“治痰先治气，气顺痰自消”之意；以丹参、莪术、鸡血藤为臣，活血化瘀，软坚散结，通经活络以祛铜浊毒邪外出；佐以大黄通腑利湿、排铜解毒。诸药合用，共奏行气活血、化痰祛瘀、排铜解毒之功。临床研究表明，肝豆灵可显著改善WD引起的认知障碍^[4]，但其作用机制尚待明确。

近年来，网络药理学的兴起为中药复方的作用机制研究提供了新的方向^[5]，其可通过构建中药复方与疾病间的“化学成分-交集靶点”多向性网络，进而从分子层面揭示两者之间的关联作用。基于此，本研究依托网络药理学方法及分子对接技术，旨在探讨肝豆灵治疗WD认知障碍的作用机制，以期为今后肝豆灵的实验研究及临床应用提供新的理论支撑。

1 方法 1.1 肝豆灵化学成分筛选及潜在靶点预测

通过TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库，分别以肝豆灵中各单味中药的名称(丹参、莪术、姜黄、鸡血藤、黄连、生大黄)为关键词进行检索，其中生大黄按大黄进行检索，以口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18为过滤条件，筛选出肝豆灵中各单味中药的有效化学成分及其相对应的潜在靶点，并利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库，将所获靶点名称转换成标准基因名，从而得到肝豆灵的基因靶点。

1.2 疾病相关靶点获取

通过GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)数据库，以“cognitive impairment in Wilson disease”为关键词，检索与WD认知障碍相关的作用靶点，并将所获靶点进行合并去重。

1.3 交集靶点筛选及“化学成分-交集靶点”网络构建

将肝豆灵的基因靶点和WD认知障碍的疾病靶点上传至Veen在线作图工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行Veen分析后，得到其交集靶点名称。利用Cytoscape 3.8.0软件构建肝豆灵与WD认知障碍间的“化学成分-交集靶点”多向性网络图并筛选出其核心节点。

1.4 蛋白质与蛋白质相互作用(PPI)网络构建及核心靶点筛选

将肝豆灵与WD认知障碍的交集靶点导入到String(https://www.string-db.org/)数据库中进行PPI分析，限定物种为Homo Sapiens，设置最低置信度为0.9，同时隐藏游离的点，构建PPI网络图，下载对应的tsv文件并将其导入到Cytoscape 3.8.0软件中，应用CytoNCA插件计算各节点的BC、CC、DC、EC、LAC及NC值，对结果进行拓扑分析后得到关联度最大的靶点，即为核心靶点。

1.5 基因本体(GO)生物功能和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

借助DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库进行GO生物功能和KEGG通路富集分析(选取条件为P < 0.05)，并利用R 4.0.3软件所获结果进行可视化处理，绘制条形图及气泡图，以期从生物功能和信号通路的角度分析肝豆灵治疗WD认知障碍可能的作用机制。

1.6 分子对接

将度值排名前3的核心靶点与其对应的化学成分进行分子对接。利用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载化学成分的小分子配体文件，将其导入到Chem3D软件中进行空间结构转化及能量优化后，输出为mol2格式文件，再经AutoDockTools 1.5.6软件处理后将文件保存为pdbqt格式。从Uniprot数据库检索核心靶点的基因ID，并在PDB数据库(http://www1.rcsb.org/)下载其所对应的PDB格式文件，经Pymol软件进行水分子去除及受配体分离后，将所获核心靶点的大分子受体文件导入到AutoDockTools 1.5.6软件进行加氢处理并以pdbqt格式进行文件保存。借助Autodock vina 1.1.2软件将核心靶点及其对应的化学成分进行分子对接，并以结合能作为对接评价指标。

2 结果 2.1 肝豆灵化学成分筛选及潜在靶点预测结果

通过TCMSP数据库共收集得到肝豆灵的化学成分146个，其中丹参65个，莪术3个，姜黄24个，鸡血藤24个，黄连14个、大黄16个，化学成分-潜在靶点一一对应后得到肝豆灵的有效化学成分118个(Tab 1列出OB值排名前20位的有效化学成分)，对应潜在靶点254个，利用Uniprot数据库将所获靶点名称转换成标准基因名，合并去重后共得到肝豆灵的基因靶点218个。

2.2 疾病相关靶点筛选结果

通过GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD数据库，以“cognitive impairment in Wilson disease”为关键词进行检索，将所获靶点进行合并去重后，得到与WD认知障碍相关的作用靶点4 858个(Fig 1)。

2.3 交集靶点筛选及“化学成分-交集靶点”网络构建结果

将218个肝豆灵的基因靶点和4 858个WD认知障碍的疾病靶点上传至Veen在线作图工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行Veen分析后，共得到交集靶点189个(Fig 2)。利用Cytoscape 3.8.0软件构建肝豆灵与WD认知障碍间的“化学成分-交集靶点”多向性网络。结果显示，网络共包含284个节点及1 221条边，其中肝豆灵化学成分节点95个，交集靶点节点189个。以大于节点度值中位数的2倍作为筛选条件，得出槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、丹参酮ⅡA(tanshinone iia)为度值排名前3的化学成分，其度值依次为108、50、37，这些化学成分可能在肝豆灵治疗WD认知障碍中起着关键作用。

2.4 PPI网络构建及核心靶点筛选结果

将189个肝豆灵与WD认知障碍的交集靶点导入到String数据库中进行PPI分析，限定物种为Homo Sapiens，设置最低置信度为0.9，同时隐藏游离的点，构建PPI网络。结果显示，网络共包含188个节点及790条边，平均节点度值为8.4。下载对应的tsv文件并将其导入到Cytoscape 3.8.0软件中，应用CytoNCA插件计算各节点的BC、CC、DC、EC、LAC及NC值，并对结果进行拓扑分析后，最终得到关联度最大的前14个靶点，依次为JUN、STAT3、TP53、MAPK1、MAPK14、MYC、IL6、TNF、RB1、CCND1、AKT1、EGFR、RELA、CXCL8(Fig 3)，这些靶点可能是肝豆灵治疗WD认知障碍的核心靶点。其中，JUN、STAT3、TP53为度值排名前3的靶点。

2.5 GO生物功能富集和KEGG通路富集分析结果

借助DAVID数据库进行GO生物功能富集，结果得到GO条目2 922个，其中生物过程(BP)条目2 555个，细胞组成(CC)条目122个，分子功能(MF)条目245个(选取条件为P < 0.05)。由于P值代表富集显著性，故选取BP、CC、MF中P值最小的前10个条目，利用R 4.0.3软件制作成GO生物功能富集条形图及气泡图(Fig 4、Fig 5)。结果显示，肝豆灵与WD认知障碍交集靶点基因的BP主要集中在药物反应(response to drug)、金属离子反应(response to metal ion)、氧化应激反应(response to oxidative stress)等；CC主要集中在膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)等；MF主要集中在DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)等。

借助DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，结果得到KEGG信号通路175条。由于P值代表富集显著性，故选取P值最小的前30条信号通路，利用R 4.0.3软件制作成KEGG信号通路富集条形图及气泡图(Fig 6、Fig 7)。结果显示，肝豆灵与WD认知障碍交集靶点基因的信号通路主要涉及PI3K-AKT信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway)、脂质与动脉粥样硬化信号通路(lipid and atherosclerosis)等。

2.6 分子对接结果

将“2.4”项中度值排名前3的核心靶点与其对应的化学成分进行分子对接(见Tab 2)。结果显示，核心靶点与其对应的化学成分之间均有较强的相互作用，其中JUN与槲皮素的结合性最好，运用Pymol软件对其进行可视化分析(Fig 8)。从Fig 8可以看出，JUN主要通过Arg263、Asn262两个氨基酸残基与槲皮素发生H键作用，氢键的结合能为-9.2 kcal·mol^-1。

3 讨论

WD认知障碍虽在中医典籍中并无相对应的病名记载，但依据其临床表现，一般可将其归属于“健忘”“善忘”“呆病”等范畴。中医认为，痰瘀互结是本病最主要的证候特征，其发病机制为“铜毒内蕴，痰瘀阻络”。肝豆灵作为化痰祛瘀法的典型院内制剂，经临床研究证实，其对清除WD患者脑部沉积铜有积极作用，可有效改善其神经病变^[6]；同时, 动物实验亦表明，肝豆灵可降低WD模型TX小鼠神经细胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平^[7]，并可阻止炎症小体激活，具有抑制神经细胞凋亡，改善认知障碍的作用^[4]。

本研究发现，槲皮素、木犀草素、丹参酮ⅡA等化学成分是与WD认知障碍相关靶点作用最多的化学成分，提示其可能与肝豆灵治疗WD认知障碍密切相关。有文献报道，槲皮素、木犀草素、丹参酮ⅡA均可通过抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种途径来发挥其神经保护的效用^[8-10]。槲皮素可减缓认知障碍细胞模型和动物模型的病理进程^[11-12]，其作用机制可能与抑制海马TLR4/NF-κB信号通路，阻断炎症因子参与的“级联事件”及增加AKT信号通路中AKT蛋白磷酸化的程度，减轻海马神经细胞凋亡有关^{[8, 13]}。木犀草素可通过调节机体的抗氧化系统，降低ROS水平，减轻炎症反应，增强突触传递，减少认知障碍大鼠在Morris水迷宫试验中的逃避潜伏期，改善记忆能力，提高认知功能^[9]。丹参酮ⅡA可降低海马组织中Tau蛋白过度磷酸化及β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)过度沉积，并可通过激活PI3K-AKT信号通路，抑制神经细胞凋亡，促进神经细胞的修复和再生^[14]。

PPI网络分析结果显示，JUN、STAT3、TP53为PPI网络中度值排名前3的靶点，提示其可能是肝豆灵治疗WD认知障碍的核心靶点。研究表明，JUN、STAT3及TP53均具有诱导神经细胞凋亡的作用，其机制可能与Tau蛋白的过度磷酸化、Aβ的过度激活及炎症因子的介导有关。目前，对于肝豆灵治疗WD认知障碍的实验研究多集中在测定IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子的表达上，而对于JUN、STAT3、TP53改善WD认知障碍，发挥神经保护的作用机制临床却鲜有报道，故需进一步实验验证。

结合GO生物功能富集结果及相关文献可知，大量铜离子蓄积于脑，可提高脑组织中ROS水平，引发氧化应激反应^[7]。氧化应激信号汇集到下游，可促使caspase-3活化并对AKT进行剪切，抑制PI3K-AKT信号通路传导，导致Tau蛋白过度磷酸化及Aβ过度沉积，同时激活相关转录因子的转录活性，诱导神经细胞凋亡，进而影响认知功能^[15]。KEGG通路富集结果显示，肝豆灵治疗WD认知障碍的核心通路主要涉及PI3K-AKT、AGE-RAGE信号通路等。PI3K-AKT信号通路可通过诱导细胞自噬，促进海马神经细胞内Aβ的清除及Tau蛋白的去磷酸化，减轻神经突触损伤，增强神经突触形态，抑制海马神经细胞凋亡，改善学习记忆能力^[15]；AGE-RAGE信号通路可通过触发机体氧化应激及神经炎症反应^[16-17], 促使海马神经细胞凋亡，导致认知功能损害^[18]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法和分子对接技术，探讨了肝豆灵治疗WD认知障碍的作用机制，发现肝豆灵的主要化学成分槲皮素、木犀草素、丹参酮ⅡA等可能作用于JUN、STAT3、TP53等核心靶点，并通过PI3K-AKT、AGE-RAGE等信号通路来降低ROS水平，减轻炎症反应，抑制神经细胞凋亡，发挥其保护神经细胞、改善认知功能的效用，表现出多成分、多靶点、多通路的作用特点，为今后的实验研究及临床应用提供了新的理论支撑。