脑卒中是由于血液循环受阻而引起的疾病，约有75%的患者产生不同水平的残疾，且极易复发。缺血性脑卒中是脑卒中的主要类型，约占87%[1]。组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)是临床首选治疗药物，其治疗时间窗窄(仅4.5 h左右)，且只对3%~5%的脑卒中病人有治疗效果[2]。因此，迫切需要研发更安全、更有效的药物。
红景天苷(salidroside，sal)见Fig 1，是中药红景天的主要有效成分及药效物质基础的标志物。课题组前期研究证明，红景天苷具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡的作用[3-5]。由于红景天苷是多羟基化合物，极性大，水溶性极好，脂溶性差，作用于中枢神经系统时具有局限性。一方面，红景天苷难以通过脂质膜，不易被肠胃吸收进入组织，亦难透过血脑屏障; 另一方面，其在体内易被代谢，药效降低，药理活性减弱。一次给药后，3 h后在血液和脑组织中几乎检测不到红景天苷，其在血液中的半衰期约40 min[6-7]。
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| 图 1 Salidroside |
为改善红景天苷的脂溶性、优化传输、提高在体内的稳定性，达到增强药效的目的，课题组对红景天苷进行了结构修饰，通过酯化红景天苷分子中苷元上的酚羟基以及糖基上的醇羟基，接入不同的基团，合成了29个红景天苷衍生物，并进行体外药效筛选，优选出具有更好疗效的衍生物对苯甲酰红景天苷(pOBz，见Fig 2)[8]。课题组已就pOBz的结构及其应用申报国家发明专利(申请号：201710756613.1)[9]。pOBz对于在体内是否具有更好的改善脑卒中疗效，本研究将进一步探讨。
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| 图 2 pOBz |
SPF级健康♂SD大鼠72只，体质量(260±10)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK(沪)2014-0002，合格证号：2015000518015。于福建中医药大学实验动物中心进行饲养，使用合格证：SYXK(闽)2014-0005，适应性喂养1周。本动物实验均遵循动物实验伦理要求。
1.2 实验药物与主要试剂对苯甲酰红景天苷(福建中医药大学药学院提供，纯度≥99%，用含5% Tween-80的生理盐水配制成10 g·L-1); 红景天苷(福建中医药大学药学院提供，纯度≥99%，用0.9%生理盐水配制成10 g·L-1); NeuN抗体(Abcam，货号：ab177487);β-actin抗体(Trans Gen Biotech，货号：110813);Bax抗体(货号：#2772)，Bcl-2抗体(货号：#2762)，均购自CST; EGR1抗体(Santa Cruz Biotech，货号：sc-110)。
1.3 实验仪器凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司，型号：ChemiDoc XRS+); 7.0T小动物核磁共振成像仪(德国Broker公司，型号：Biospec70/20 USR); 荧光倒置显微镜(Leica公司，型号：DMI8);石蜡切片机(Thermo公司，型号：HM325);紫外可见分光光度计(Thermo公司，型号：ND2000C); 多功能酶标仪(TECAN公司，型号：Infinite M200 Pro); 大鼠脑模具(瑞沃德公司，型号：68709);线栓(广州佳灵，货号：L3600)。
2 方法 2.1 分组及给药 2.1.1 不同剂量pOBz对MCAO大鼠的影响30只健康成年♂SD大鼠，随机分为Sham组、MCAO组、MCAO+pOBz低、中、高剂量组(25、50、100 mg·kg-1)，每组6只。造模成功后，Sham组和MCAO组大鼠腹腔注射(ip)生理盐水(10 mL·kg-1)，对MCAO+pOBz给药组分别ip 25、50、100 mg·kg-1pOBz，每天记录体质量，连续给药2 d后取材。
2.1.2 pOBz和Sal对MCAO大鼠的影响24只健康成年♂SD大鼠，随机分为Sham组、MCAO组、MCAO+pOBz组和MCAO+Sal组，每组6只。Sham组和MCAO组大鼠ip生理盐水(10 mL·kg-1)，MCAO+pOBz组ip pOBz(50 mg·kg-1)，MCAO+Sal组红景天苷(50 mg·kg-1)，给药1 d后取材。2.1.3 pOBz对MCAO大鼠大脑皮层NeuN表达的影响18只健康成年♂SD大鼠，随机分为Sham组、MCAO组和MCAO+pOBz组，每组6只。Sham组和MCAO组大鼠ip生理盐水(10 mL·kg-1)，MCAO+pOBz组ip pOBz(50 mg·kg-1)，连续给药2 d后灌注固定取脑。
2.2 MCAO模型的制备大鼠禁食(不禁水)12 h后，2%戊巴比妥钠(2 mL·kg-1)麻醉。分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，在颈总动脉剪一小口，插入线栓, 结扎颈内动脉。阻塞2 h后拔线栓，实现再灌注。Sham组除不插入线栓外，其余操作同MCAO组。手术中维持大鼠体温，术后自由摄食饮水。待大鼠清醒参考Zea-Longa 5级评分制[10]进行神经功能损伤评分，2~3分说明模型成功，可用于后续实验。
2.3 取材麻醉大鼠后，使用采血针对腹主动脉放血，剪断大鼠颈部，剪开头部的皮肤，暴露头骨并用线剪剪开，使用手术钳翻开头骨，使整个脑组织暴露，取出大脑并分离左右脑，迅速放入做好标记的冻存管中，移入液氮保存。
2.4 MRI检测MCAO大鼠脑梗死体积将大鼠用异氟烷麻醉，俯卧位固定于动物床上，利用大鼠头部表面线圈检测，冠状定位扫描，采用T2W1增强系列。成像参数：T2W1采用TSE序列，TE 33 ms，TR 2700 ms，24层，矩阵30 mm×30 mm，Rfov 60%，NSA 15，扫描5 min 50 s。
2.5 Western blot检测蛋白表达提取总蛋白，测定蛋白浓度，经电泳分离总蛋白后，转膜，5%BSA封闭，一抗4 ℃孵育过夜，各一抗稀释倍数分别为NeuN(1 ∶3 000)、EGR1(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)及Bax(1 ∶1 000)。TBST洗3次，10 min/次，二抗室温孵育2 h，TBST洗3次，10 min/次。检测目标条带并分析条带的灰度值。
2.6 免疫荧光染色观察NeuN的表达将固定24 h的脑组织进行切片、脱水、透化、石蜡包埋及制作组织片。之后脱蜡复水、热抗原修复，5% BSA封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，NeuN抗体稀释倍数(1 ∶200)。次日复温40 min，PBS摇洗3次，3 min/次。荧光二抗室温避光孵育2 h，PBS避光摇洗3次，3 min/次。甩去PBS，DAPI染色8 min，PBS避光摇洗3次，每次3 min。采用抗淬灭剂封片，于荧光倒置显微镜观察组织染色情况。
2.7 统计学分析采用SPSS 21.0软件对数据统计分析，数据用x±s表示，进行One-way ANOVA分析。
3 结果 3.1 不同剂量pOBz对MCAO大鼠的影响 3.1.1 pOBz对MCAO大鼠脑梗死体积的影响同MCAO组比较，MCAO+pOBz中剂量组(50 mg·kg-1)和MCAO+pOBz高剂量组(100 mg·kg-1)的脑梗死体积明显减少(P < 0.01)，且50 mg·kg-1pOBz的脑梗死体积改善优于100 mg·kg-1(P < 0.05)，见Fig 3，4。
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| 图 3 Effect of pOBz on cerebral infarction volume in rats |
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| 图 4 Effects of different doses of pOBz on volume of cerebral infarction in MCAO rats (x±s, n=6) ##P < 0.01 vs sham; **P < 0.01 vs MCAO; △P < 0.05 vs MCAO+pOBz (100 mg·kg-1) |
大鼠神经功能损伤评分在2-3分视为造模成功，pOBz给药后，大鼠神经功能损伤评分呈下降趋势，50 mg·kg-1pOBz给药2 d后评分下降(P < 0.05)，见Fig 5。
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| 图 5 Effects of different doses of pOBz on neurological function damage score of MCAO rats (x±s, n=6) ##P < 0.01 vs sham; *P < 0.05 vs MCAO |
造模后，大鼠的体质量减轻，同MCAO组比较，MCAO +pOBz中剂量组(50 mg·kg-1)(P < 0.01)和MCAO+pOBz高剂量组(100 mg·kg-1)(P < 0.05)的体质量减轻小于模型组，见Fig 6。
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| 图 6 Effects of different doses of pOBz on body weight of MCAO rats (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs MCAO |
与Sham组相比，MCAO组大鼠脑组织的NeuN表达减少(P < 0.05)，pOBz给药组和Sal给药组NeuN的表达升高，且pOBz给药组升高的程度明显高于Sal给药组(P < 0.05或P < 0.01)，见Fig 7。
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| 图 7 Effects of pOBz and salidroside on NeuN in MCAO rats (x±s, n=6) #P < 0.05 vs Sham; *P < 0.05, **P < 0.01 vs MCAO; △P < 0.05 vs MCAO+Sal |
与Sham组相比，MCAO大鼠脑组织的EGR1表达减少，pOBz给药组表达升高，Sal给药组无明显变化(P < 0.05或P < 0.01)，见Fig 8。
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| 图 8 Effects of pOBz and salidroside on EGR1 in MCAO rats (x±s, n=6) ##P < 0.01 vs sham; **P < 0.01 vs MCAO; △△P < 0.01 vs MCAO+Sal |
与Sham组相比，MCAO大鼠脑组织的Bcl-2/Bax比值降低，pOBz给药组和Sal给药组增加了Bcl-2/Bax的比值，升高的程度相同，见Fig 9。
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| 图 9 Effects of pOBz and salidroside on Bcl-2/Bax in MCAO rats (x±s, n=6) #P < 0.05 vs sham; *P < 0.05 vs MCAO |
与Sham组相比，MCAO大鼠脑组织的NeuN表达减少，且形态上发生改变; pOBz给药组(50 mg·kg-1)NeuN表达增加，形态上也得到很大程度的恢复，见Fig 10。
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| 图 10 Effects of pOBz on NeuN immunofluorescence expression in MCAO rats (400×) |
本研究采用MCAO模型能够较好地模拟脑缺血疾病。MRI结果确认了pOBz能够改善48 h的MCAO大鼠脑梗死体积，并确定最佳给药剂量是50 mg·kg-1。课题组前期TTC结果显示pOBz给药2 d能够显著改善MCAO大鼠的脑梗死体积，而Sal给药2 d没有改善梗死体积，到d 6 Sal才表现出改善梗死面积。刘俊杰[11]、谢秀利[12]等也报道连续给药6 d后观察到Sal改善脑梗死体积。
神经功能损伤评分结果显示pOBz给药后评分均呈下降趋势，50 mg·kg-1pOBz给药组大鼠的神经功能损伤评分得到显著改善。课题组前期报道Sal给药d 6可以观察到神经功能损伤评分的改善[3]，与脑梗死体积结果一致。同时本研究还观察到，50和100 mg·kg-1pOBz给药2 d可以显著改善MCAO大鼠体质量的减少，这在Sal的研究中未见报道。临床上脑卒中患者发病后机体大量蛋白质损失，加上进食减少，导致营养不良、体质量下降，使得患者预后较差，死亡率提高[13]。神经功能损伤的程度越高，体质量恢复能力就越差，Long等[14]研究表明，促进体质量的恢复可以改善神经功能缺损，二者相辅相成。pOBz给药2 d可以改善体质量的降低，也反映了对神经缺损的改善，同时体质量的增加促进MCAO大鼠神经功能的改善，有益于疾病预后恢复。
不管是脑梗死还是神经功能损伤，其本质都是由于脑供血中断导致的神经元损伤和神经功能丧失。目前已经发现Sal在MCAO模型中具有神经保护作用[3, 12, 15]。神经元核抗原(NeuN)是成熟神经元细胞的标记，MCAO大鼠NeuN减少，是神经元特异质基因的改变[16]。从免疫荧光染色结果中可见pOBz给药2d对MCAO大鼠NeuN蛋白表达在形态和数量上都有明显的改善。课题组前期研究显示，Sal可以升高24h MCAO大鼠NeuN的表达[4]，而本研究显示pOBz诱导NeuN的升高程度优于Sal。EGR1是早期生长反应蛋白之一，缺血性脑卒中发生后关键差异表达的基因，其表达可以预防神经元损伤以及减轻脑卒中后的血栓形成和炎症[4, 17]。课题组前期发现，Sal在缺血后24 h不改善EGR1的表达，而48 h后能够观察到EGR1升高[3]，本研究中pOBz在24 h时即可显著升高MCAO大鼠EGR1的表达。这些结果提示pOBz在蛋白表达水平对脑缺血/再灌注大鼠的神经保护作用优于Sal。
线粒体在细胞凋亡过程中扮演重要角色。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax蛋白同属Bcl家族，对调节线粒体膜通透性、线粒体功能及Cyt-c释放起至关重要的作用。缺血性脑卒中发生后，Bax在脑中表达增加，抑制Bax或表达Bcl-2可减轻缺血性损伤发挥脑保护作用[18]。与Lai等[4]报道Sal改善缺血后24 h MCAO大鼠中Bcl-2和Bax比值相吻合，研究发现红景天苷与pOBz均能改善MCAO大鼠脑组织Bcl-2 /Bax的比值降低，并且pOBz的改善程度与Sal相当，分析可能的原因有：(1)患侧半脑除了神经细胞，胶质细胞、内皮细胞也含有Bcl-2和Bax，检测结果为患侧半脑总蛋白结果，pOBz和Sal抑制神经细胞凋亡的结果并未检测到; (2)线粒体凋亡相关的蛋白不只有Bcl-2和Bax，还有Bad、Bak、Bcl-xl、Mcl-1等其他指标，本研究中并未全部筛选检测，pOBz表现出优于Sal的神经保护作用，也有可能是通过其他凋亡靶蛋白来抑制MCAO大鼠脑组织凋亡; (3)pOBz对MCAO大鼠的神经保护作用不仅通过改善线粒体诱导细胞凋亡途径，还可能通过其它途径，如通过对大脑炎症的调控，改善脑内炎症环境来增强对神经的保护作用。
综上，pOBz给药2 d可降低MCAO再灌注大鼠的脑梗死体积，改善体质量减轻，具有优于红景天苷的神经保护作用，该研究为进一步研究pOBz对MCAO大鼠的神经保护作用打下坚实基础。
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