缺血性心脏病是临床上常见的致死疾病，早期对缺血的心肌组织采用各种方式恢复血供是改善临床预后的最有效方式[1]，但是心肌缺血/再灌注损伤降低了血供恢复带来的益处。研究表明，心肌缺血/再灌注损伤可能涉及中枢神经系统的调控[2-3]。下丘脑室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus，PVN)位于下丘脑内侧区，能够直接通过神经元调节交感神经紧张性，而心肌缺血/再灌注损伤则是由于交感神经系统的异常激活所致[3-4]。谷氨酸能神经元是PVN脑区内主要的兴奋性神经元，与交感神经活性密切相关[5-6]，然而PVN核团是否通过调控谷氨酸能神经元的兴奋性参与心肌缺血/再灌注损伤目前尚不清楚。
化学遗传是利用遗传学原理，通过生物活性小分子与蛋白相互作用来研究生物学系统功能的一种方法[7]，具有高效、可逆、特异性地干扰靶蛋白或靶细胞的功能。化学遗传的核心为特定药物激活的受体(designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs), DREADD被一种特殊的药物氯氮平-N-氧化物(clozapine N-oxide，CNO)激活后可以选择性地作用于不同的G蛋白(Gi/Gq)受体，最终实现神经元的抑制或者激活效应。hM4Di在抑制性DREADD中应用最为广泛，在中枢可与纳摩尔级别的CNO结合，并被激活实现神经元的抑制效应[8]。CAMKⅡα为谷氨酸能神经元特异性启动子，可实现病毒对谷氨酸能神经元的特异性感染[9-12]。本研究将探讨通过化学遗传技术调控PVN脑区谷氨酸能神经元兴奋性对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物选择SPF级雄性C57BL6小鼠，8-10周龄，体质量(20~25) g，购买于安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(皖)2017-006。小鼠分笼饲养，可自由饮水及摄食，饲养环境温度保持在(21~25) ℃。
1.2 药物与试剂氯化三苯基四氮唑(TTC)(批号：BCCC7515，Sigma公司，美国)，腺病毒(AAV)载体：rAAV-CaMKⅡα-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGHpA(批号：9-524-K200629，武汉枢密脑科学有限公司)和rAAV-CaMKⅡα-EGFP-WPRE-hGHpA病毒载体(批号：9-290-K200917，武汉枢密脑科学有限公司)，ELISA检测试剂盒(批号：BJ11112020，AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)。Cleaved caspase-3 Antibody(批号：22，Cell Signaling Technology，美国)，ERK(批号：20，Cell Signaling Technology，美国)，pERK(批号：24，Cell Signaling Technology，美国)。
1.3 实验设备PowerLab动物实验数据采集系统(AD公司，澳大利亚)，小动物呼吸机(成都泰盟软件有限公司)，脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，微型手持颅骨钻(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，微量输注泵(KDS)，显微镜(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，动物保温系统(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。
1.4 PVN置管模型小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg·kg-1，麻醉起效后置于37 ℃保温毯，固定于脑立体定位仪，手术区域皮肤消毒，暴露颅骨，确定前囟。根据George Paxinos小鼠脑立体定位图谱(第二版)，定位双侧PVN坐标(前囟后0.7 mm，中线左右旁开0.13 mm，深度4.75 mm)。颅骨钻孔，置入导管(导管带有基座)，并插入内芯，牙科粉固定于颅骨表面，涂抹青霉素软膏后缝合皮肤，皮肤表面再次涂抹青霉素软膏。置管后小鼠单笼饲养3 d，术后出现感觉或运动功能障碍的小鼠弃用。
1.5 心肌缺血/再灌注损伤模型腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg·kg-1，固定于37 ℃保温板上，气管插管后连接小动物呼吸机，设置呼吸频率(100~120)次/min，潮气量(0.5~1.2) mL。连接PowerLab Systems，监测心电图(ECG)。沿左锁骨中线切开皮肤约1~2 cm，左4~5肋间处进入胸腔，谨慎分离胸腺，剪开心包膜，于肺动脉圆锥与左心耳之间采用8-0 Prolene线穿线，稳定15 min后，心脏表面置一4-0棉线，采用方结结扎左前降支(LAD)，并作一活结，拉紧线结，即造成LAD闭塞致心肌缺血，并可见LAD支配区域心肌发绀，同时ECG出现明显的ST段弓背抬高。缺血60 min后松开线结，轻提棉线，方结即松开，则开始再灌注。
1.6 实验分组取PVN置管成功的24只小鼠，随机数字表法分为4组(n=6)：假手术组(Sham组)，心肌缺血/再灌注组(IR组)，腺病毒对照组(AAV-con + IR组), 谷氨酸能神经元抑制病毒组(AAV-M4 + IR组)。Sham组、IR组通过导管PVN双侧微量注射0.9%生理盐水，每侧100 nL。AAV-con + IR组通过导管PVN双侧微量注射带绿色荧光基团的空病毒载体rAAV-CaMKⅡα-EGFP-WPRE-hGHpA，每侧100 nL，AAV-M4 + IR组通过导管PVN双侧微量注射化学遗传抑制病毒rAAV-CaMKⅡα-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGHpA, 同样每侧100 nL。4组小鼠单笼饲养3周后，Sham组和IR组术前1 h腹腔注射生理盐水(2 mg·kg-1)，AAV-con + IR组、AAV-M4 + IR组术前1 h腹腔注射CNO(2 mg·kg-1)，CNO腹腔注射后在体内大约经过60-120 min起效，并且具有长时程稳定的效应[13]。随后AAV-con + IR组、IR组、AAV-M4 + IR组缺血1 h，再灌注2 h，Sham组开胸后穿线不结扎。
1.7 病毒感染效率及注射位置小鼠注射病毒后3周，取大脑，4%多聚甲醛固定24 h，10%~30%蔗糖阶梯沉糖后以40 μm厚度冰冻切片，PBS清洗5次，每次8 min。0.3%PBST通透15 min，CAMKⅡα(1 ∶500)一抗孵育4 ℃过夜，PBS清洗5次，每次8 min，二抗采用山羊抗兔IgG(H+L)抗体(1 ∶1 000)，孵育2 h，PBS清洗5次，每次8 min，封片液封片，荧光显微镜下观察谷氨酸能神经元荧光，并与病毒荧光双标，验证病毒感染效率。
实验结束后，小鼠取大脑，4%多聚甲醛固定24 h，10%~30%蔗糖阶梯沉糖后以40 μm厚度冰冻切片，荧光显微镜观察病毒荧光，验证注射位置是否准确，将病毒注射位置不准确小鼠排除，并采用随机数字表法重新补足至每组6只。
1.8 PVN内c-fos免疫荧光实验结束后，小鼠取大脑，4%多聚甲醛固定24 h，10%-30%蔗糖阶梯沉糖后以40 μm厚度冰冻切片，PBS清洗5次，每次8 min。0.3%PBST通透15 min，c-fos(1 ∶1 000)一抗孵育4 ℃过夜，PBS清洗5次，每次8 min，二抗采用山羊抗兔IgG(H+L)抗体(1 ∶1 000)，孵育2 h，PBS清洗5次，每次8 min，封片液封片，荧光显微镜下观察, ImageJ软件分析免疫荧光强度[14]。
1.9 心电图记录观察小鼠缺血前、缺血后及再灌注后心电图变化。记录心肌缺血前5 min(T0)、心肌缺血即刻(T1)、心肌缺血60 min(T2)、再灌注120 min(T3)时的心率。
1.10 心肌梗死面积测定再灌注结束后处死小鼠，取出心脏，PBS灌注，冲洗出血液，重新结扎LAD。在显微镜下主动脉置管，从主动脉逆行灌注1%伊文氏蓝溶液0.2 mL左右，置于-80 ℃冰箱速冻1 h。将心脏置于小鼠心脏模具中，自心尖至LAD结扎处将心脏平切为厚度1 mm的薄片3~4片，置于1% TTC溶液中，37 ℃(pH7.4)孵育10 min放入4%多聚甲醛中浸泡固定12 h。Image J软件计算右心室面积(RV)、左心室面积(LV)、梗死区面积(IS)与缺血危险区面积(AAR)之比、危险区面积与心室总面积(RV + LV)之比。
1.11 血清cTnI浓度测定再灌注结束时从左心室抽取血样0.5 mL，置于离心机中13 200 r·min-1转速离心15 min，取上清液置于-80 ℃保存，ELISA法测定血清cTnI浓度。
1.12 Western blot再灌注结束后处死小鼠，提取小鼠左心室组织，预冷PBS冲洗，匀浆前先称重。将小鼠左心室组织剪碎，碾磨至粉状，置于匀浆器中，冰上裂解，匀浆器中加入RIPA裂解液。裂解至澄清后将匀浆液以3 500 r·min-1的速度离心5 min，取上清液置于-20 ℃保存备用。BCA蛋白定量试剂盒测定570 nm处OD值进行蛋白定量。取适量上清液按1 ∶4加入上样缓冲液，100 ℃加热10 min。待冷却后对蛋白质进行12% SDS-PAGE凝胶电泳浓缩胶70 V, 30 min，分离胶110 V, 60 min。随后转移至PVDF膜上200 mA恒流, 50 min。用5%脱脂牛奶在室温下封闭2 h。加入GAPDH(1 ∶1 000)、cleaved caspase(1 ∶1 000)、pERK(1 ∶2 000)、ERK(1 ∶2 000)一抗4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，二抗采用山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)或山羊抗鼠IgG(1 ∶1 000)室温孵育90 min，TBST洗涤4次，每次5 min，采用化学发光法ECL显影，凝胶成像系统拍照，Image J软件计算蛋白条带灰度值。
1.13 统计学处理采用Prism 5.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，重复测量设计资料采用重复测量设计的方差分析。
2 结果 2.1 病毒转染效率及注射位置荧光显微镜下观察小鼠脑片PVN病毒荧光，对照脑图谱证实病毒注射位置准确; 观察PVN病毒荧光与谷氨酸能神经元免疫荧光共标，确定病毒成功转染谷氨酸能神经元，图Fig 1。
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| 图 1 rAAV-CamKIIα-EGFP-expressing PVN neurons A: Mouse brain atlases; B: CamKIIα-EGFP-expressing PVN neurons(Scale bar=50 μm); C: The localisation of rAAV-CamKIIα-EGFP and glutamatergic neurons(Scale bar=100 μm); PVN: hypothalamic paraventricular nucleus; 3 V: third ventricle. |
与Sham组相比，各组PVN内c-fos表达升高(P < 0.05)，与IR组及AAV-con + IR组相比，谷氨酸能神经元抑制病毒组c-fos表达降低(P < 0.05)，见Fig 2, 表明CNO成功激活hM4D(Gi)并诱导谷氨酸能神经元兴奋性降低。
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| 图 2 C-fos expression in each group(x±s, n=6) A: Representative immunofluorescence image of c-fos(Scale bar=50 μm); B: Statistical analysis of c-fos immunofluorescence intensity. *P < 0.05 vs Sham; #P < 0.05 vs AAV-con + IR. |
与Sham组相比，IR组及AAV-con+IR组T1时HR升高，T2-3时HR降低(P < 0.05);与IR组及AAV-con+IR组相比，谷氨酸能神经元抑制病毒组T1-2时HR降低(P < 0.05)，T3时HR无差异(P>0.05)，见Fig 3。
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| 图 3 Heart rate of different time points in each group (x±s, n=6) T0: Baseline, T1: The onset of ischemia, T2: The end of ischemia, T3: The end of reperfusion. HR: heart rate. *P < 0.05 vs Sham; #P < 0.05 vs AAV-con+IR. |
与Sham组相比，各组IS体积、IS/AAR增大(P < 0.05，Fig 4)，与AAV-con+IR组及IR组相比，谷氨酸能神经元抑制病毒组IS面积、IS/AAR减小(P < 0.05，Fig 4)，IR组与AAV-con+IR组相比，IS体积、IS/AAR之比均无差异(P>0.05，Fig 4)，表明抑制谷氨酸能神经元兴奋性能明显减少心肌缺血/再灌注小鼠心肌梗死面积。
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| 图 4 Myocardial infarct size (x±s, n=6) A: Representative photographs of TTC staining, the non-ischaemic area was stained in blue, area at risk (AAR) was in brick red, and infarct size (IS) was in white. B: Statistical analysis of IS/AAR and AAR/(LV + RV). Myocardial infarct size was expressed as a ratio of IS/AAR. *P < 0.05 vs Sham; #P < 0.05 vs AAV-con + IR. |
与Sham组相比, 各组cTnI浓度升高(P < 0.05)，与AAV-con+IR组及IR组相比，谷氨酸能神经元抑制病毒组cTnI浓度降低(P < 0.05)，IR组与AAV-con+IR组比较，各时段cTnI浓度均无明显差异(P>0.05)，见Fig 5，表明抑制谷氨酸能神经元兴奋性明显减轻小鼠心肌损伤。
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| 图 5 Serum troponin concentration (x±s, n=6) *P < 0.05 vs Sham; #P < 0.05 vs AAV-con + IR. |
与Sham组相比，各组pERK表达降低(P < 0.05)，与IR组及AAV-con+IR组相比，AAV-M4+IR组即谷氨酸能神经元抑制病毒组pERK表达明显增加(P < 0.05)，且心肌凋亡蛋白cleaved caspase-3表达降低(P < 0.05)，见Fig 6，表明抑制谷氨酸能神经元兴奋性可通过ERK通路降低心肌缺血/再灌注小鼠心肌凋亡蛋白的表达。
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| 图 6 Protein expression of cleaved caspase-3 and pERK (x±s, n=6) *P < 0.05 vs Sham; #P < 0.05 vs AAV-con + IR. |
心肌缺血/再灌注损伤极大的降低了血管再通带来的益处，影响患者的预后和生活质量。心肌缺血/再灌注损伤的外周机制研究目前已较为成熟，但中枢机制特别是涉及PVN的调控目前尚不清楚。PVN位于下丘脑内侧区，参与调节及整合机体诸多生理功能，并在调节血压、心衰等心血管相关疾病中发挥不可忽视的重要作用[4]，因此，探索心肌缺血/再灌注损伤中PVN的作用对于进一步明确心肌缺血/再灌注损伤的中枢调控机制显得十分必要。
本研究中，结扎小鼠LAD后ST段明显抬高且心尖部发绀证明IR造模成功，荧光显微镜下观察小鼠脑片PVN内病毒绿色荧光，证明PVN置管模型成功。为了研究PVN谷氨酸能神经元兴奋性对心肌缺血/再灌注损伤的影响，病毒载体携带了谷氨酸能神经元特异性启动子CaMKⅡα，病毒荧光与谷氨酸能神经元特异性启动子CaMKⅡα免疫荧光共标确认病毒成功转染谷氨酸能神经元。AAV-M4 + IR组病毒载体携带了hM4D(Gi)插件，与CNO结合后，诱导谷氨酸能神经元兴奋性降低，未携带hM4D(Gi)插件的AAV-con + IR组谷氨酸能神经元兴奋性则不受影响。AAV-M4 + IR组即谷氨酸能神经元抑制病毒组PVN内c-fos免疫荧光表达较AAV-con + IR组明显减少证实CNO起效，化学遗传成功发挥作用。
如前所述，交感神经的异常激活导致心肌缺血/再灌注损伤，而交感神经兴奋性降低则减少儿茶酚胺释放，减少心肌耗氧量，降低心肌做功，同时降低心肌细胞各种促炎因子表达，最终减轻心肌缺血/再灌注损伤[15]。本实验中观察到，AAV-M4 + IR组即谷氨酸能神经元抑制病毒组小鼠心肌梗死面积减少，PVN中c-fos表达减少，心肌损伤标志物肌钙蛋白cTnI降低，心肌凋亡蛋白cleaved caspase-3也降低，表明PVN注射rAAV-CaMKⅡα-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-hGHpA后通过CaMKⅡα启动子转染谷氨酸能神经元，术前腹腔注射CNO激活hM4D(Gi)诱导核团内谷氨酸能神经元兴奋性降低，继而导致交感神经兴奋性下降[5]，减弱交感神经的异常激活，最终改善小鼠心肌缺血/再灌注损伤。同时，实验中观察到，与IR组及AAV-con + IR组相比，Western blot检测到谷氨酸能神经元抑制病毒组pERK蛋白表达升高，ERK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要亚族，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等等，ERK蛋白已被证实在多种物质或药物减轻心肌缺血/再灌注损伤的调控中发挥作用[16-17]，推测PVN通过核团内谷氨酸能神经元减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤的机制可能与上调ERK蛋白相关，但进一步的上下游通路机制尚需更深入的研究。
综上所述，通过腺相关病毒载体特异性感染下丘脑室旁核谷氨酸能神经元，同时利用化学遗传DREADD术介导使谷氨酸能神经元兴奋性下降可减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤。
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