2. 宁波大学医学院，浙江 宁波 315000;
3. 台州市中心医院（台州学院附属医院），浙江 台州 318000;
4. 台州市立医院，浙江 台州 318000
2. School of Medicine, Ningbo University,Ningbo, Zhejiang 315000, China;
3. Taizhou Central Hospital (Taizhou University Hospital), Taizhou, Zhejiang 318000, China;
4. Taizhou Municipal Hospital, Taizhou, Zhejiang 318000, China
肺癌是现在世界上最为常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤相关的死亡原因中占第一位[1]。在中国，肺癌也是最为常见的癌症，在癌症相关死亡中占30% [2]。非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最为常见的类型[3]，对于一些早期和局部晚期的NSCLC，手术治疗加辅助化疗是最佳选择，但易引起术后复发[1]。强心苷类药物(地高辛、洋地黄毒苷等)作为临床上用于治疗心力衰竭和心房颤动的常用药，能够减少癌症发生和复发的概率，降低癌症发生时患者的病死率[4]，具有潜在的抗肿瘤应用前景。近年来，随着人们对于强心苷类药物认识的深入，已有部分强心苷类化合物及其衍生物作为抗肿瘤药物进入了临床试验阶段[5]。此外，强心苷类药物与抗肿瘤药物联合应用来提高疗效理论上也成为一种可能[4]。
选择合适的动物模型对发展有效的治疗疾病的方法或手段至关重要。目前研究肺癌的裸鼠模型主要有皮下移植瘤模型、肾包膜下移植瘤模型、原位移植瘤模型等。基于肿瘤生长、侵袭和转移的“种子和土壤”学说，肿瘤细胞在体内的生长和扩散具有器官特异性[6]。皮下和肾包膜下移植瘤模型由于肿瘤细胞没有植入肺中，被认为不能很好地体现临床转移特征和反映药物敏感性[7-8]；而原位移植有助于肺肿瘤细胞保持原有的组织学特征，所以该模型提供的药代动力学、药效学特征被认为比皮下或肾包膜下移植瘤模型更能反映肺癌的特征[7-8]。因此，本研究拟构建裸鼠皮下移植瘤模型和裸鼠原位移植瘤模型，以地高辛为例，初步探究其对两种人肺癌移植瘤模型的敏感性差异及抗肿瘤作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物BALB/c-NULL裸鼠，雌性，6-8周龄，(18-20)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪) 2017-0005，饲养于SPF级动物房，屏障系统的洁净层流架内，温度(25±1)℃，相对湿度40%-60%，生长所需的垫料、饲料和饮水均经灭菌处理，每日保持10 h的光照，14 h无光的阴暗周期。开展的实验均经浙江省实验动物中心实验动物福利伦理委员会和台州学院医学院医学伦理委员会审核批准(No ZJCLA-IACUC-20080012、TZYXY2018-003)，符合国家实验动物伦理相关规定。
1.1.2 细胞NCI-H460细胞，购自上海盖宁生物科技有限公司；Luc-H460细胞株购于南京福克赛生物科技有限公司。
1.1.3 药物和试剂地高辛购自成都德思特生物技术有限公司(货号：DD 0086)；注射用盐酸吉西他滨购自江苏豪森药业集团有限公司(批号：170803)；鼠源p-p38抗体(货号：sc-166182)、鼠源p-ERK抗体(货号：sc-136521)购自Santa Cruz；兔源Nur77抗体购自Cell Signaling Technology(货号：#3960)；HRP标记山羊抗兔IgG二抗购自上海威奥生物科技有限公司(货号：WB2177)；免疫组化试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司(货号：SP-9000)；异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司(货号：R510-22)；基质胶购自美国BD BioCoat(货号：354248)。
1.1.4 实验仪器Multicut半自动石蜡切片机(德国徕卡)；ASP300S全自动组织脱水机(德国徕卡)；LBP-5196-Ⅱ全自动抗原修复仪(广州安必平医药科技股份有限公司)；Dako Coverstainer全自动染色封片一体机(丹麦安捷伦Dako)；IVIS Lumina LT小动物活体成像系统(美国珀金埃尔默)。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养人肺癌H460细胞于RPMI 1640(含10% FBS，1%链-青霉素混合液)培养液中，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。胰酶-EDTA消化传代，2-3 d传代1次。
1.2.2 皮下移植模型裸鼠适应性喂养1周后，取两只裸鼠，将对数生长期的H460细胞悬液每只0.2 mL接种至裸鼠右腋后线皮下，待肿瘤长到一定程度，将瘤块无菌剥离，剪成2×2×2(mm3)的组织小块，通过套管针，把组织块接种至裸鼠右腋后线皮下完成造模。造模成功后的裸鼠共30只，分为5组，每6只，分别为对照组(C)、阳性药吉西他滨120 mg·kg-1组(G)、地高辛(4 mg·kg-1)高剂量组(D-H)、地高辛(2 mg·kg-1)中剂量组(D-M)和地高辛(1 mg·kg-1)低剂量组(D-L)，通过腹腔注射给药，按0.2 mL/20 g体质量计算药量，对照组腹腔注射生理盐水0.2 mL/只，每周给药2次。每次给药前测量裸鼠体质量和肿瘤体积(肿瘤长径(a)和短径(b)，计算体积[V=(a×b2)/2)]，待对照组瘤块体积超过2 000 mm3时停止给药，处死裸鼠，无菌剥离瘤块。将瘤块保存于-80 ℃和福尔马林固定液中，进行病理学检查。
1.2.3 原位移植模型裸鼠适应性喂养1周后，把消化收集的Luc-H460细胞(H460细胞带有萤光素酶标记)，稀释到8×1010个·L-1，按照1 ∶ 1配比与基质胶混合后备用。裸鼠用异氟烷气麻，将制备好的Luc-H460细胞悬液直接肺穿刺注射到裸鼠肺部，25 μL/只。饲养一周后，活体成像观察肺部成瘤情况。造模成功后的裸鼠共40只，分为5组，每组8只，分组及给药情况同皮下移植模型。每次给药前测量裸鼠体质量并对裸鼠进行生物发光活体成像。实验结束后，处死裸鼠，解剖观察心肝脾肺肾等重要器脏肿瘤病灶，并拍照记录。分离肺部肿瘤组织。将内脏组织保存于-80 ℃和福尔马林固定液中，进行病理学检查。
1.2.4 HE染色及免疫组织化学染色皮下移植瘤组取剥离的瘤块，常规脱水，经石蜡包埋后切片。HE染色经全自动染色机进行染色、制片，完成后在光学显微镜下观察、拍照。免疫组化检测将切片脱蜡后置于自动抗原修复仪中98 ℃水煮热修复25 min，于室温冷却，滴加一抗(1 ∶ 100稀释)，室温孵育1 h，滴加二抗(1 ∶ 100稀释)，室温孵育20 min，DAB显色5 min，苏木精复染25-30 s，烘干，封片，完成后在光学显微镜下观察p38、细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的磷酸化水平和Nur77的表达情况，并拍照记录。免疫组化光镜下黄色或棕黄色颗粒为阳性结果，且黄色或棕黄色颗粒越多，即蛋白的表达水平越高。
1.3 统计学分析统计学方法采用SPSS 17.0软件进行方差分析，多组之间采用LSD法进行两两比较，所得结果以x±s表示。
2 结果 2.1 皮下移植瘤模型 2.1.1 各组小鼠体质量变化d 14，各组小鼠体质量均下降，其中吉西他滨组小鼠体质量下降最为明显，下降1.6 g；d 21，吉西他滨组小鼠体质量继续下降，其余各组小鼠体质量均有回升；d 38，吉西他滨组小鼠体质量最小，为17.2 g，其余各组小鼠体质量范围为22.0-23.6 g(Tab 1)。统计学分析结果显示，吉西他滨组小鼠体质量差别较为明显(P＜0.05)，其余各组间小鼠体质量并无差异(P>0.05)。
| Group Control | Control | Gemcitabine 120 mg·kg -1 | Digoxin 4 mg·kg -1 | Digoxin 2 mg·kg -1 | Digoxin 1 mg·kg -1 |
| Day 7 | 21.4±0.5 | 21.7±1.7 | 21.7±0.6 | 22.5±1.0 | 21.8±1.0 |
| Day 14 | 20.3±0.7 | 20.1±1.3 | 21.0±0.5 | 22.4±0.9 | 21.2±1.3 |
| Day 21 | 20.8±1.0 | 19.6±1.5 | 22.0±0.2 | 23.1±1.0 | 21.9±1.4 |
| Day28 | 21.1±1.1 | 19.4±1.0 | 21.3±0.5 | 22.7±1.5 | 22.1±1.8 |
| Day 35 | 21.4±1.4 | 17.2±1.1 | 22.7±0.8 | 24.2±1.6 | 22.0±2.3 |
| Day38 | 22.0±1.4 | 17.2±1.2 * | 22.4±1.1 | 23.6±1.7 | 22.0±2.0 |
| *P＜0.05 vs Control. | |||||
d 7，各组小鼠的肿瘤体积范围为81-98 mm3；d 14，地高辛中剂量组瘤体积最小，平均为273 mm3；d 21，吉西他滨组瘤体积最小(平均627 mm3)，小于地高辛中剂量组(平均709 mm3)；d 38，对照组小鼠瘤块平均体积为2 315 mm3(终止实验)，吉西他滨组和地高辛高、中、低剂量组小鼠肿瘤体平均积分别为958 mm3、1 677 mm3、1 559 mm3、1 970 mm3，其抑瘤率分别为59%、28%、37%、15%，与35 d时相比，地高辛低剂量组抑瘤率有所下降，其余各组均上升(详见Fig 1，实验中实际瘤体积测量频率为每周两次)，结果显示，与对照组相比，吉西他滨组瘤体积差异有显著性(P＜0.05)；地高辛各剂量组肿瘤体积虽较对照组小，但差异并无显著性(P>0.05), 见Fig 2。
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| Fig 1 Subcutaneous tumor model: Measurement of tumor volume in mice (x±s, n=6) |
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| Fig 2 Subcutaneous tumor model: Anatomical results of tumor mass in mice |
HE染色法观察皮下移植瘤各组中裸鼠移植瘤的组织结构，结果显示，对照组肿瘤细胞未见明显坏死，细胞排列紧密，密度较大，细胞异型性明显；地高辛中、高剂量组可见较明显的细胞坏死和纤维增生，细胞排列密度较对照组降低，吉西他滨组与地高辛低剂量组细胞虽有坏死，但不如前两组明显(Fig 3)。
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| Fig 3 Subcutaneous tumor model: HE staining results: Morphology of transplanted tumor (×400) |
Fig 4结果显示，对照组p38、ERK磷酸化水平低并且仅少量表达Nur77 (＜10%)，结果呈阴性；吉西他滨组和地高辛高剂量组p38，ERK的磷酸化水平相近，两组p-p38的阳性率约为60%，p-ERK的阳性率约为40%；地高辛中、低剂量组的p38、ERK蛋白磷酸化水平则稍高于前两组，近80%；Nur77的阳性表达，吉西他滨组和地高辛高剂量组则明显高于地高辛中、低剂量组，约90%。我们的结果显示吉西他滨也可诱导核受体Nur77表达的增加和活化MAPK信号通路。
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| Fig 4 Subcutaneous tumor model: Immunohistochemical staining results (×400)(↑ represents a positive result) |
d 7，对照组、吉西他滨组和地高辛高剂量组小鼠体质量上升，其中以吉西他滨组小鼠体质量升高最多，升高1.2 g，地高辛中、低剂量组小鼠体质量下降，且低剂量组小鼠体质量下降较多，下降1.1 g；d 10，各组小鼠体质量均上升，吉西他滨组小鼠体质量达到最高；d 14，地高辛高剂量组小鼠体质量达到最高；d 17，地高辛中、低剂量组小鼠体质量达到最高。统计学结果分析显示，各组间小鼠体质量并无差异(P>0.05)，(Tab 2)。
| Group | Control | Gemcitabine 120 mg·kg -1 | Digoxin 4 mg·kg -1 | Digoxin 2 mg·kg -1 | Digoxin 1 mg·kg -1 |
| Day 0 | 16.9±1.2 | 17.0±1.2 | 17.1±1.3 | 16.9±1.1 | 16.7±1.2 |
| Day 7 | 17.1±1.9 | 18.2±1.2 | 17.7±1.2 | 16.5±0.9 | 15.8±1.2 |
| Day 10 | 17.3±1.8 | 17.9±1.1 | 18.0±1.5 | 16.8±0.9 | 15.8±1.2 |
| Day14 | 17.6±1.4 | 17.1±1.6 | 18.4±1.2 | 17.3±1.3 | 16.2±1.1 |
| Day17 | 17.1±1.6 | 16.6±2.1 | 18.3±1.2 | 17.9±1.3 | 16.7±1.3 |
| Day20 | 17.0±1.5 | 16.9±2.5 | 17.6±1.3 | 17.6±1.4 | 16.4±1.2 |
| Day23 | 17.0±1.5 | 16.6±2.5 | 16.7±1.5 | 17.5±1.5 | 16.5±1.4 |
d 10，各组小鼠活体荧光值无显著差别(P>0.05)；d 20，吉西他滨组与地高辛中剂量组荧光值较小；d 23，吉西他滨组和地高辛高、中、低剂量组小鼠抑瘤率分别为63%、-102%、80%、32%，与20d时相比，除地高辛低剂量组外，各组抑瘤率均上升；高剂量地高辛反而促进肿瘤生长(Tab 3、Fig 5)。统计学分析结果显示，与对照组相比，肿瘤接种后20 d时，吉西他滨组和地高辛中剂量组抑瘤效果较为明显(P＜0.05)；接种后23 d时，仅地高辛中剂量组抑瘤效果较为明显(P＜0.05)，地高辛高剂量组反而加重了肿瘤的发展(P＜0.05)。
| Time | Control | Gemcitabine 120 mg·kg -1 | Digoxin 4 mg·kg -1 | Digoxin 2 mg·kg -1 | Digoxin 1 mg·kg -1 |
| Day10 | 5.79±2.12 | 3.37±1.88 | 4.56±2.04 | 4.57±2.29 | 3.71±4.51 |
| Day14 | 7.81±5.39 | 5.86±7.05 | 10.30±4.52 | 5.24±2.44 | 11.60±13.70 |
| Day17 | 11.60±4.47 | 18.00±24.40 | 27.20±18.10 | 10.30±7.94 | 20.10±16.00 |
| Day20 | 56.60±31.00 | 7.98±6.67 * | 62.30±41.70 | 19.10±12.20 * | 31.70±11.80 |
| Day23 | 73.10±28.90 | 26.90±22.80 | 148.00±93.70 # | 14.30±8.55 * | 49.90±16.50 |
| *P＜0.05 vs Control, inhibit tumor development; #P＜0.05 vs Control, aggravating tumor development. | |||||
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| Fig 5 Orthotopic transplantation tumor model: In biolumine- scence imaging results of mice |
由Fig 6可知，对照组肺部组织被肿瘤浸润严重，正常肺组织极少；吉西他滨组瘤块大，但小鼠正常肺组织形态结构基本保留；地高辛高剂量组瘤块比模型组大，正常肺组织被肿瘤侵占所剩无几；地高辛中、低剂量组瘤块较小，肺组织相对完整。所有组肿瘤均未出现心、肝、脾、肾的转移。
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| Fig 6 Orthotopic transplantation tumor model: Tumor growth and metastasis in situation a: Heart; b: Lung; c: Kidney; d: Liver; e: Spleen; yellow circle marked as tumor tissue |
近几十年来，皮下移植人源细胞到免疫缺陷动物一直是临床前肿瘤实验的黄金标准。然而，皮下移植瘤模型由于异种移植物的来源和宿主机体微环境之间存在差异，缺乏循环肿瘤细胞和无转移病灶，在评价药物时存有很大的风险。考虑到组织特异性和肿瘤微环境的影响，原位移植模型在过去的20年中逐渐发展起来[8-9]，它的转移率和转移模式更接近于临床[8]。本研究中，我们通过建立人肺癌裸鼠皮下移植与原位移植两种模型，比较吉西他滨和地高辛对两种肺癌模型抗肿瘤作用的差异。结果表明(Fig 1，(5，Tab 3)：在皮下移植模型中，吉西他滨表现出较好的抑瘤效果(P＜0.05)，地高辛则没有表现出较好的抑瘤效果(P>0.05)；而在原位移植模型中，仅有地高辛中剂量组表现出较好的抑瘤效果(P＜0.05)，吉西他滨并没有表现出较好的抑瘤效果(P>0.05)。我们推断其可能与上述两种模型之间的差异和药物本身的特性有关，因此提示我们进行药效学评价时需要选用合适的模型进行全面评价。例如，HIF-1α拮抗剂px-478显示对肺癌的皮下移植瘤没有较好的活性，但却能抑制原位人小细胞肺癌细胞的扩散和小鼠肺腺癌的恶化和蔓延，并最终进入Ⅰ期临床试验[10]。如果仅选用一种模型，会存在一些风险：一是把无疗效或疗效不显著的一种药物或一个药物组合推向临床，二是中断研发有潜能的抗肺癌药物。本次研究结果显示，在原位移植模型中，中、低剂量的地高辛有较好的抑制肿瘤生长和浸润的效果，其效果优于吉西他滨，并且各组小鼠心、肝、脾、肾等重要脏器肉眼均未见损伤，说明地高辛作为抗肿瘤药物可能有着潜在的应用前景。
在上述比较药物对不同模型敏感性的基础上，我们结合其他体外研究结果，利用肿瘤组织探索了吉西他滨和地高辛体内可能的抗肿瘤作用机制，如：是否活化MAPK信号传导通路，是否上调核受体Nur77的表达。
研究表明MAPK信号通路在细胞凋亡或自噬中发挥举足轻重的作用。到目前为止，已经在哺乳动物细胞中克隆并鉴定了6个MAPK亚家族，它们是：ERK1/2、ERK3/4、ERK5、ERK7/8、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1/2/3和p38MAPK (p38α/β/γ/δ)[11]。MAPK信号通路包含3条并行的MAPKs信号通路：ERK信号转导通路、JNK/SAPK信号转导通路和p38-MAPK通路[12]。Zhou等[13]的研究解释了JNK和p38的激活分别促进Nur77的出核及其在胞质的靶向线粒体并与Bcl-2共定位；而ERK信号通路调节的Nur77磷酸化和线粒体靶向促进了细胞凋亡的发生[14]。Nur77在细胞核中的转录激活可能具有促进细胞生长的作用[15]，而一些凋亡诱导剂(顺铂、乙酰紫草素)可通过诱导Nur77的表达和出核后靶向结合线粒体外膜蛋白，通过线粒体途径触发凋亡过程[16]。Wang等[17]发现THPN处理促进了原本定位在瘤细胞胞质中的Nur77与线粒体外膜蛋白Nix的结合，进入线粒体内膜后，促进膜孔通道复合体的开放导致线粒体膜电位的丧失，最终诱导不可逆和致死性的自噬。我们的免疫组化结果显示(Fig 4)，与对照组相比，地高辛各剂量组及吉西他滨组的移植瘤组织p-p38、p-ERK、Nur77蛋白阳性表达率增加，提示强心苷类药物地高辛和吉西他滨可能通过活化肿瘤组织的p38、ERK蛋白和上调Nur77蛋白的表达来诱导肿瘤细胞凋亡。
本研究中，我们发现强心苷类药物地高辛在中、低剂量时抑瘤效果较好。我们猜测，地高辛在中低剂量时抑瘤效果较好可能与其作用于Na+-K+-ATP酶(钠泵)有关。Cherniavsky-Lev等[18]的实验结果表明，强心苷可引起细胞表面钠泵的内吞，最终导致细胞生存能力下降。强心苷引起的钠泵内吞作用在强心苷浓度≤100 nmol·L-1的条件下呈剂量依赖性[18]，这可能解释了本次实验结果中强心苷类药物在中低剂量时抑瘤效果较好，且中剂量抑瘤效果优于低剂量, 详细的机制还有待探究。
综上所述，本研究同时建立了两种肺癌裸鼠移植瘤模型，证明了药物对不同肿瘤模型的敏感性存在差异，探讨了地高辛体内发挥抗肺癌作用的机制，为地高辛等强心苷类化合物用于肺癌治疗的可能性提供了理论依据。
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