2. 北京中医药大学研究生院，北京 100029
2. Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
抑郁症(depression)是以心境情绪障碍为主的一种临床症状，情绪低落、思维迟缓、认知功能损害、意志活动减退和躯体症状为其主要特征。目前因经济负担、工作压力、情感问题等导致的抑郁患者越来越多，随着人们对情绪疾病所致危害的认识，许多患者开始接受药物治疗。临床一线药物中常用的如舍曲林、氟西汀、帕罗西汀等均属5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，此类药物为临床抗抑郁首选[1]。其他类型的第二代抗抑郁药物也多应用于临床，这些药物虽疗效较为确切，但其花费高、易复发、周期长等问题给抑郁患者带来一定的困扰。由此，越来越多的患者寻求中医药的治疗。
抑郁症属中医“郁证”范畴，历代医家对其病机阐述各不相同，但不外乎气郁、阳虚、血瘀等。越来越多活血化瘀类中药被证实具有抗抑郁的作用，其中藏红花近年来被国内外学者广泛深入研究。Vahdati等[2]发现藏红花能够改善抑郁症大鼠海马中基因的蛋白质表达和转录水平，可能通过提高神经肽前体蛋白转录水平和活性磷酸化CREB从而发挥抗抑郁作用。同时，也有临床研究证实藏红花有关成分对于抑郁症患者的症状具有良好的改善效果, Akhondzadeh等[3]进行了一个随机、双盲、对照临床试验，比较西红花柱头提取物与丙咪嗪的抗抑郁疗效。研究结果显示，两个治疗组均能明显降低HAM-D评分，且组间无显著性差异，证实藏红花相关提取物具有抗抑郁疗效。
网络药理学是计算机系统生物学时代到来的产物，是一门运用网络分析技术将药物成分、靶点、疾病间复杂的网络关系与中医药整体性、系统性相结合，体现中药多成分、多途径、多靶点等特点的综合学科[4]。本研究旨在通过网络药理学的方法探讨藏红花抗抑郁机制并进行初步分析，为藏红花在抑郁症的临床应用中提供更准确的科学依据。
1 材料与方法 1.1 获取藏红花药物候选靶点登录中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP Databases)，检索并获取藏红花已知的化学成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18为条件进一步筛选藏红花的有效化合物。将获得的藏红花有效化合物导入TCMSP数据库及Genecards数据库中获取成分作用靶点，并排除重复靶点。运用Uniprot数据库査询靶点蛋白对应的基因简称，得到藏红花活性成分调控的疾病靶点。
1.2 获取藏红花治疗抑郁症的作用靶点登录Genecards数据库获取疾病靶点，以depression为关键词，人类基因为背景，提取数据库中信度较高的相关基因靶点(score≥10)。运用Cytoscape软件中的merge功能将藏红花药物成分候选靶点与抑郁症疾病靶点取交集，获得藏红花治疗抑郁症的作用靶点。
1.3 藏红花活性成分-抑郁症靶点网络构建将上述获得的藏红花抗抑郁作用靶点与藏红花成分重新对接，获得藏红花治疗抑郁症的具体活性成分。运用Cytoscape软件构建藏红花活性成分-抑郁症靶点网络(C-T network)，并用“Network Analyzer”功能进行网络可视化拓扑分析。
1.4 GO生物进程及KEGG通路分析将藏红花药物成分治疗抑郁症的相关靶点导入Cytoscape软件的ClueGO分析工具中，进行GO生物学进程及KEGG通路富集分析。
1.5 分子对接验证选择C-T network中获得的degree值较高的关键化合物与KEGG富集分析中获得的相关通路中的关键蛋白，运用Autodock vina软件进行分子对接验证，预测关键蛋白与关键化合物小分子的相互作用，并运用Pymol软件将化学成分与关键靶点之间的对接效果进行可视化呈现。
2 结果 2.1 藏红花药物化学成分筛选利用TCMSP数据库，以藏红花、西红花、番红花为检索词，以OB≥30%、DL≥0.18为条件筛选得到5个化合物，并参考文献加入2个藏红花常用活性成分[5-6]，共得到7个藏红花的有效活性成分，筛选结果见Tab 1。
| MOL ID | Molecule name | OB/% | DL |
| MOL001389 | n-heptanal | 79.74 | 0.59 |
| MOL001406 | crocetin | 35.3 | 0.26 |
| MOL000354 | isorhamnetin | 49.6 | 0.31 |
| MOL000422 | kaempferol | 41.88 | 0.24 |
| MOL000098 | quercetin | 46.43 | 0.28 |
| MOL001409 | picrocrocin_qt | 33.71 | 0.04 |
| MOL000720 | Safranal | 39.56 | 0.04 |
将上述获得的7个藏红花活性成分引入TCMSP数据库及Genecards数据库，获得7个活性成分对应107个作用靶点。运用Uniprot数据库査询靶点蛋白对应的基因简称, 最终得到藏红花调控的疾病靶点103个(4个为非人源靶点)。
2.3 藏红花治疗抑郁症作用靶点筛选应用Genecards数据库，以depression为关键词检索，获得数据库中信度较高的相关基因靶点(score≥10)共557个。利用Cytoscape软件中的merge功能，将上述获得的103个藏红花活性成分作用靶点与557个抑郁症疾病相关靶点取交集，筛选得到25个藏红花治疗抑郁症的关键靶点。
2.4 藏红花活性成分-抑郁症靶点网络构建将上述筛选得到的藏红花治疗抑郁症的相关靶点对接回成分，并应用Cytoscape软件构建藏红花活性成分-抑郁症靶点网络(C-T network)，见Fig 1，并用“Network Analyzer”功能对该网络进行可视化拓扑分析。网络包含32个节点，57条边。其中，7个橘黄色节点代表藏红花活性成分，形状越大表示该成分的degree值越高；25个蓝色节点代表藏红花作用于抑郁症的靶点(基因简称)并且形状越大表示该靶点的degree值越高。在化合物方面，由图可见degree值较高的化合物分别是quercetin槲皮素(degree=20)、kaempferol山奈酚(degree=11)、Safranal藏红花醛(degree=7)、crocetin藏红花酸(degree=7)、isorhamnetin异鼠李素(degree=6)。说明在藏红花治疗抑郁症的过程中，槲皮素、山奈酚、藏红花醛、藏红花酸以及异鼠李素5个活性成分起主要作用。
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| Fig 1 C-T Network |
将藏红花作用于抑郁症的25个基因靶点导入Cytoscape软件的ClueGO分析工具中进行GO生物进程及KEGG通路富集分析，得到藏红花治疗抑郁症的生物进程及KEGG通路结果。
2.5.1 生物进程聚类分析结果通过GO生物进程分析，如Fig 2，可得知藏红花治疗抑郁症可能主要是通过参与影响以下体内生物进程相关：①神经递质代谢过程; ②过氧化氢的生物合成过程；③活性氧生物合成过程等。由此可知，藏红花抗抑郁主要体现在调节神经递质的代谢过程和氧化应激等方面。
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| Fig 2 GO cluster analysis results |
为进一步探究藏红花治疗抑郁症的具体机制，应用ClueGo分析工具对藏红花抗抑郁的相关靶点进行通路分析，结果如Fig 3所示。由图可知，藏红花抗抑郁的相关通路包括IL-17信号通路、HIF-1信号通路及TOLL样受体信号通路等炎症通路以及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、松弛素信号通路、Th17细胞分化等通路。经进一步文献检索[7]，藏红花治疗抑郁症的重要通路可能是PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路，本研究对这两条通路进行分析，具体见Fig 4, 5。图中通路靶点标记为绿色，藏红花治疗抑郁症的靶点标记为粉色。在PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路中，提示藏红花抗抑郁通过调节其中几个环节起作用，主要靶点为BDNF、GSK3B、NOS3、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN等。
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| Fig 3 KEGG pathway cluster analysis results |
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| Fig 4 PI3K-Akt signaling pathway |
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| Fig 5 MAPK signaling pathway |
由KEGG聚类分析结果得知，在PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路中，藏红花抗抑郁主要靶点为BDNF、GSK3B、NOS3、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN。经进一步文献查阅，脑源性神经营养因子(BDNF)是影响海马结构和功能改变的关键因子，许多药物均通过BDNF从而发挥抗抑郁作用[8]。在配体方面，由于异鼠李素、山奈酚、槲皮素是很多中药的化学成分，不具有代表性，因此选择2个藏红花中具有代表性的关键化合物藏红花酸和藏红花醛与PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路中共有的靶点蛋白BDNF进行分子对接验证。通过PDB数据库获得BDNF靶点的晶体结构文件，TCMSP数据库获得关键化合物藏红花酸和藏红花醛的mol2格式文件。运用Autodock vina分子对接软件上传靶点蛋白以及藏红花酸、藏红花醛的结构文件进行分子对接并用Pymol软件将分子对接模拟验证结果进行可视化。2种化学成分与靶蛋白均可对接成功，见Fig 6, 7。故预测藏红花中藏红花醛和藏红花酸在抗抑郁作用机制PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路中发挥关键作用。
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| Fig 6 BDNF-Safranal molecular docking |
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| Fig 7 BDNF-crocetin molecular docking |
藏红花具有化瘀解毒、凉血活血和解郁安神的功效。《饮膳正要》载其“主心忧郁结，气闷不散，久服令人心喜”。近年来，相关研究表明，藏红花在改善精神疾病包括抗抑郁，焦虑以及改善认知障碍和睡眠障碍等方面有一定进展。但很少有实验涉及到藏红花在抗抑郁过程中产生的作用机制。
本研究运用网络药理学及分子对接手段，通过分析藏红花与抑郁症分子网络在生物功能方面的异同，初步探索藏红花抗抑郁的作用机制。研究发现在藏红花治疗抑郁症的过程中，作用较强的化合物是槲皮素、山奈酚、藏红花醛、藏红花酸和异鼠李素。藏红花醛和藏红花酸作为藏红花中特有的成分，近年来的相关药理研究表明，它们都具有神经保护作用。Tashakori-Sabzevar等[9]的研究显示，藏红花酸对慢性脑低灌注大鼠的大脑皮质及海马区域神经元具有保护作用，并可有效防止因慢性脑灌注不足导致的神经病理改变，改善大鼠空间学习记忆能力。Sadeghnia等[10]证明藏红花醛可抑制自由基的产生和增加抗氧化活性，通过降低脂质过氧化水平，对抗氧化应激损伤保护大鼠海马，并预防海马硫醇氧化还原和抗氧化状态的减弱。
通过GO生物进程聚类分析和KEGG通路聚类分析，可得知藏红花抗抑郁可能主要通过参与调节神经递质的代谢过程和氧化应激等生物进程。神经递质稳态调节机制的损伤是目前广泛研究的一类抑郁症发病机制。5-羟色胺(5-HT)作为一种单胺类神经递质参与多种脑内生理功能及病理状态，有研究表明抑郁、焦虑症模型大鼠脑组织中5-HT明显低于正常大鼠[11]。抑郁症与氧化应激损伤关系密切[12]，是一种慢性的心理及生理应激过程，在此过程中体内神经内分泌系统的功能随之变化，进而引起氧化应激系统的激活，导致中枢神经系统的氧化损伤，并可能进一步诱发抑郁症的发生发展[13]。在信号通路的调控方面，藏红花治疗抑郁症可能主要调控IL-17信号通路、HIF-1信号通路及TOLL样受体信号通路等炎症通路以及PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、松弛素信号通路、Th17细胞分化等通路。本研究重点对PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路进行分析，发现藏红花可通过BDNF、TNF、IL-1、IL-6、MAPK8、JUN、GSK3B、NOS3等靶点参与治疗抑郁症，主要体现在神经营养因子的调节、抗炎、抗氧化应激等方面。MAPK信号通路存在于人体大多数细胞内，具有广泛的生理作用。而MAPK信号通路之一的ERK1/2通路能够介导神经营养因子、生长因子发挥抗抑郁作用[14]。PI3K-Akt信号通路与抑郁症的发生发展密切相关，中枢神经元和海马干细胞的功能可因PI3K-Akt信号通路受抑制而下降，相反，提高PI3K-Akt信号通路的表达，能够有效降低海马神经元凋亡并促进其再生，增加海马神经突触可塑性，缓解抑郁，减少精神类疾病的产生[15]。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族中的重要成员，是脑内5-HT、多巴胺(DA)能神经元的生长因子，促进5-HT、DA等神经递质的合成[16]。NO是重要的神经递质和炎症介质，可以通过NOS/NO系统调节多种神经递质释放[17]。相关证据表明，情绪障碍与炎症系统的激活和免疫系统的改变密切相关。抑郁症患者血液中含有大量的炎性因子，可以引起抑郁不同的临床表现。相关单核细胞研究发现，GSK3可以通过激活不同种类的Toll样受体诱发炎症反应，也可促进前炎症因子如IL-6、IL-1β、TNF-α的产生[18]。
综上所述，藏红花治疗抑郁症的作用机制主要通过调节神经营养因子促进五羟色胺及多巴胺等神经递质的合成；抑制炎症因子释放减缓炎症反应，改善抑郁状态；调节体内氧化应激反应，保护中枢神经系统，减缓抑郁症发生发展的进程。本研究从网络药理学的角度阐述了藏红花治疗抑郁症的作用机制，为藏红花治疗抑郁症并进一步提高临床疗效提供了有效证据。
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