2. 安徽医科大学基础医学院，安徽 合肥 230032;
3. 安徽医科大学第一附属医院新生儿科，安徽 合肥 230032;
4. 中国科学技术大学附属第一医院产科，安徽 合肥 230032
2. School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. Dept of Neonatology, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230000, China;
4. Dept of Obstetrics, the First Affiliated Hospital of USTC, Hefei 230036, China
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤，在男性和女性最常被诊断出的癌症中分别位列第3位和第2位，也是全世界癌症死亡的第2大主要原因[1]。随着医学研究的发展，结直肠癌的治疗方法日趋多元化，外科切除配合放射、药物疗法、靶向治疗等不同综合治疗方法不断出现，但是患者预后仍未见显著变化，并且随着肿瘤耐药机制的产生，药物治疗效果变差，新的治疗方法亟待产生[2-3]。中脑新型胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)是一种内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)诱导的分泌性蛋白[4]，在多种ER应激相关疾病中具有保护作用[5-8]。MANF在炎症刺激下入核，与p65的DNA结合结构域结合，抑制NF-κB通路，发挥抗炎作用[9]。近期研究发现，SUMO1可以促进MANF的核转位，抑制NF-κB通路，发挥抑制肝癌的作用[10]。有研究表明NF-κB通路的激活也是结直肠癌的重要发病机制之一[11]，但目前尚无MANF在胃肠道肿瘤中相关作用的报道。故该实验拟通过在结直肠癌细胞系Caco-2中过表达MANF来研究其对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响，并探索可能的作用机制，为结直肠癌的治疗提供新型药物作用方案。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株及质粒细胞系Caco-2细胞购自武汉Procell公司；pEGFP-C2-MANF质粒与pEGFP-C2质粒为安徽医科大学沈玉先课题组惠赠；
1.1.2 试剂转染试剂jetprim buffer购自法国保利嘉公司；DMEM培养基(美国HyClone, 批号AE29431646)；TRIzol(美国Ambion, 批号190903)SYBR Green(日本TOYOBO, 批号9283373)；MANF、caspase-3/cleaved caspase-3抗体(英国Abcam)；β-actin antibody、羊抗兔IgG-HRP(沈阳万类生物)；ECL发光液(康为世纪，批号03782/60319)、CCK8试剂盒(南京Vazyme，批号806051)；Matrigel胶(美国Corning，批号0042321)；PE Annexin Ⅴ Apoptosis Detection Kit (美国BD，批号9283373)；荧光素酶检测试剂盒(美国Promega)；重组人TNF-α(中国义翘神州)；上下游引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.1.3 仪器超净工作台(苏州苏洁医疗器械有限公司)；电泳仪(美国BIO-RAD)；凝胶成像系统(美国BIO-RAD)；流式细胞仪(美国BD)
1.2 方法 1.2.1 MANF过表达Caco-2细胞系的建立与验证参照jetPRIME试剂说明书分别转染GFP空载体和MANF-GFP质粒进入Caco-2细胞，1 d后通过荧光判断转染效率。分别提取MANF-GFP组和GFP组细胞总RNA，测定浓度后，进行逆转录得到相应的cDNA。取上述cDNA作为模板，上下游引物(MANF上游引物：5′-CGACTGCGAAGTTTGTATTT-3′，MANF下游引物：5′-GTGGCTGCATCATCTGTG-3′；β-actin上游引物：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，β-actin下游引物：5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′)、SYBR Green mastermix、H2O，按照说明书指示进行荧光定量，利用2-△△CT方法对结果进行分析。
1.2.2 细胞迁移侵袭试验将Caco-2细胞分为NC组、GFP组和MANF-GFP组，NC组不进行转染处理，GFP组和MANF-GFP组分别转染GFP空载体质粒和MANF-GFP质粒。将转染好的各组Caco-2细胞制成1×106个·mL-1浓度的细胞悬液。用稀释好的基质胶涂布到上室膜上，预先包被。迁移实验：下室内加入500 μL培养基，放入未包被的小室，加入100 μL细胞悬液；侵袭实验：下室内加入500 μL培养基，放入包被的上室，加入100 μL细胞悬液。培养48 h后，分别计数底室Caco-2细胞数目。
1.2.3 CCK-8检测细胞增殖将Caco-2细胞分为NC组、GFP组、MANF-GFP组接种于96孔培养板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h后，测定OD值。
1.2.4 免疫印迹实验提取细胞总蛋白，沸水浴10 min，分别测定GFP组与MANF-GFP组蛋白浓度。经过SDS-PAGE胶分离蛋白，转印蛋白至硝酸纤维素膜，以BSA溶液封闭1 h，分别用MANF、caspase-3、β-actin抗体于4 ℃冰箱过夜，二抗在25 ℃条件下孵育2 h，显影进行灰度分析。
1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡分别收集GFP组和MANF-GFP组Caco-2细胞。以1 000 r·min-1转速离心沉淀细胞，PBS清洗，重复上述操作2遍。加入结合缓冲液，用移液器缓慢吹打，将Caco-2细胞制成悬液，吸取100 μL悬液到流式管中，分别添加5 μL的PE Annexin Ⅴ、Propidium Iodide和7-AAD，混匀后于暗处室温孵育15 min。各管补加400 μL binding buffer, 混匀后在仪器上检测。
1.2.6 荧光素酶报告实验将细胞分为GFP组、MANF组、GFP+TNF-α组、MANF+ TNF-α组，按分组加入TNF-α(0.01 ng·L-1)刺激8 h。吸去培养液，PBS洗2遍，每组细胞加入200 μl的lysis solution，室温裂解15 min后，收集裂解液作为样品。分别测量样品的Firefly和Renilla值，记录荧光素酶的比值。
1.2.7 统计学方法采用GraphPad Prism 8分析，实验结果以x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。
2 结果 2.1 外源性MANF在Caco-2细胞中成功表达收集MANF-GFP与空载体GFP转染Caco-2细胞，分别提取RNA与总蛋白，用RT-PCR和Western blot方法检测MANF mRNA和蛋白表达水平。结果显示外源性MANF成功转入Caco-2细胞(Fig 1)。
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| Fig 1 Result of transfection(x±s, n=3) A：MANF mRNA level was detected by RT-PCR; B：MANF protein level was detected by Western blot. **P < 0.01 vs GFP. |
Transwell Caco-2细胞迁移实验结果如Fig 2A所示，与NC组比较，GFP组Caco-2细胞迁移能力没有减弱；与GFP组比较，MANF-GFP组Caco-2细胞迁移能力明显减弱(P < 0.01)；Transwell Caco-2细胞侵袭实验结果如Fig 2B所示，与NC组比较，GFP组Caco-2细胞侵袭能力差异无统计学意义；与GFP组比较，MANF-GFP组Caco-2细胞侵袭能力减弱(P < 0.01)。结果表明在Caco-2细胞中过量表达MANF可有效下调细胞的迁移和侵袭能力。
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| Fig 2 Influence of MANF on Caco-2 cell migration and invasion(x±s, n=5) A：The influence of MANF on Caco-2 cell migration was detected by transwell; B：The influence of MANF on Caco-2 cell invasion was detected by transwell. **P < 0.01 vs GFP. |
CCK-8细胞增殖检测发现，MANF-GFP组(OD值=0.275±0.035)显著低于GFP组(OD值=0.371±0.047)(P < 0.01，Fig 3)。结果表明细胞中过量表达MANF可以抑制Caco-2细胞的增殖。
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| Fig 3 Influence of MANF on Caco-2 cell sensitivity detected by CCK-8 assay(x±s, n=5) **P < 0.01 vs GFP. |
WB结果显示，转染MANF-GFP质粒可以提高Caco-2细胞中cleaved caspase-3蛋白的生成；flow cytometry实验显示，GFP组发生凋亡的Caco-2细胞比例(0.0273)，低于MANF-GFP组发生凋亡的Caco-2细胞比例(0.1884)(Fig 4)。结果表明过表达MANF可以促进Caco-2细胞凋亡。
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| Fig 4 Influence of MANF on Caco-2 cell apoptosis A: Cleaved caspase-3 level in Caco-2 cells was detected by Western blot. B: Apoptosis rate of Caco-2 cells was detected by flow cytometry. |
NF-κB荧光素酶报告实验显示，空载体GFP组相对值(1.00±0.14)高于MANF组相对值(0.51±0.07)，差异具有统计学意义(P < 0.01)。TNF-α刺激后，空载体GFP组相对值(1.66±0.17)，仍高于MANF组相对值(1.18±0.13)，差异具有统计学意义(P < 0.05，Fig 5)。结果表明MANF可以有效抑制NF-κB信号通路的转录激活。
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| Fig 5 Influence of MANF on Caco-2 cell NF-κB pathway(x±s, n=5) *P < 0.05, **P < 0.01 vs GFP. |
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率不断上升[12]。对于Ⅲ期结直肠癌患者普遍推荐手术后氟尿嘧啶、奥沙利铂联合化疗，降低癌症复发率，提高患者生存率[13]。但是几乎所有结直肠癌患者都会出现耐药性，导致抗癌药物疗效下降，寻找新的更为有效的结直肠癌辅助治疗方法尤为重要[2]。
MANF是一个高度保守的可溶性蛋白，分子量约为18ku，ER应激可诱导其分泌[4]，MANF在多种ER应激相关疾病中具有保护作用[5-8]。目前关于MANF的研究大多集中在对缺血、缺氧的神经元细胞及心肌细胞的保护作用，在小鼠的心肌梗死模型中，给予外源重组MANF能减少组织损伤[5]；在慢性房颤患者中，MANF的下调可导致更多的心房细胞凋亡[14]；MANF可通过抑制ER应激和激活PI3K/Akt/mTOR通路对黑质纹状体多巴胺能系统发挥长期的神经保护和神经再生功能[7]；MANF可通过抑制自噬，明显改善6-羟多巴胺诱导的神经毒性作用[8]；MANF可改善脑缺血大鼠的行为，减少神经元的死亡，并减少大鼠脑梗塞面积[15]。近年来，有研究关注到MANF与肿瘤的关系，发现与邻近的非癌组织相比，肝细胞癌(HCC)组织中的MANF mRNA和蛋白水平较低。MANF表达水平高的患者比低水平的患者具有更好的生存率。体外实验表明MANF抑制了肝癌细胞的迁移和侵袭，肝细胞特异性缺失MANF会加速N-亚硝基二乙胺(DEN)诱导的HCC，提示MANF可能是抑癌因子[10]。本实验在Caco-2细胞中过表达MANF，通过CCK8试验、Transwell试验、免疫印迹试验、流式细胞试验，发现MANF可以抑制Caco-2细胞的增殖、迁移、侵袭的能力，并促进细胞凋亡，提示MANF具有抑制Caco2细胞生物学功能的影响。
NF-κB蛋白家族，又名Rel蛋白家族，是由一系列名为NF-κB1(p50)，NF-κB2(p52)，RelA(p65)，RelB和c-Rel的蛋白分子组成。基本的NF-κB信号通路过程为IκB蛋白通过遮盖RelA、RelB和c-Rel的核转移序列来阻止其入核与DNA结合。IκB激酶复合物IKK可被胞外刺激信号(如：TNF-α、LPS等)激活，使IκB磷酸化，继而通过泛素蛋白酶体途径降解，导致NF-κB的核定位序列暴露，NF-κB直接入核并结合DNA，调控多种细胞因子和抗凋亡基因[16]。NF-κB通路可以促进肿瘤细胞迁移、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡，是结直肠癌的重要发病机制之一[11]。研究表明，当转录因子NF-κB被激活，细胞中抗凋亡、促增殖以及免疫相关的基因就会表达上调[17]。结肠癌组织大量浸润T细胞产生大量Th17相关细胞因子，TNF-α和IL-6，激活NF-κB促进结肠癌细胞增殖[18]。MANF具有抑制NF-κB通路的作用[9-10]。在兔关节炎模型发现MANF在炎性增厚的滑膜组织表达增多，并且MANF能在炎症的诱导下由胞质向胞核转运，在神经细胞中也观察到同样现象。MANF入核后与p65的DNA结合结构域结合，抑制NF-κB通路，发挥抗炎作用[9]。深入研究MANF的入核机制发现：SUMO1可以促进MANF的核转位，增强MANF与p65的相互作用[10]。本研究用荧光素酶报告基因实验证明，在Caco-2细胞中，与对照组相比，MANF可以显著抑制NF-κB信号通路，提示MANF可能是通过调控NF-κB通路，从而发挥其抑癌基因的作用。但MANF在结直肠癌中具体通过何种机制调控NF-κB，有待进一步研究。
综上所述，本研究发现MANF可以抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭的能力，并促进其细胞凋亡，可能通过抑制NF-κB信号通路发挥抗肿瘤作用，有望成为治疗结直肠癌的新靶点。
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