2. 西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730070;
3. 北京市延庆区疾病预防控制中心，北京 102100
2. School of Life Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China;
3. Beijing Yanqing Center For Diseases Prevention and Control, Beijing 102100, China
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的慢性、炎症性和进行性自身免疫性疾病。RA患者的早期病理特征主要是滑膜炎和关节腔内血管翳的形成[1]。慢性炎症促进RA的发展，在发展过程中巨噬细胞的极化、成纤维样滑膜细胞的异常增殖、炎性因子等原因导致关节软骨的破坏和周围组织的损伤[2]。如果患者得不到及时、正规的治疗，就会造成关节畸形，甚至最终发展为肢体残疾。此外，RA患者易合并脑卒中、心肌梗死等疾病，是致残的主要原因，在一定程度上导致社会劳动的丧失[3]。根据流行病学资料，全世界RA发病率约为1%[4]，因此，RA已成为严重的公共卫生问题。
在现代治疗的帮助下，大多数RA患者可以有效地控制病情，改善症状，减轻疼痛，保护关节功能[5]。但到目前为止，还没有治疗RA的特效药，治疗方法主要包括药物治疗、物理治疗、手术治疗和免疫吸附治疗，其中，药物治疗作为应用最广泛和最有效的方法，在RA的治疗中起着关键作用[6]。亚油酸是一种功能性的多不饱和脂肪酸，据报道其具有降低血清胆固醇水平、抑制动脉血栓形成、预防癌症、参与人类心血管疾病的控制、免疫调节、细胞生长和细胞凋亡等作用。此外，亚油酸用于治疗关节和肌肉的炎症和疼痛[7]。还有文献报道，亚油酸可促进伤口愈合，减少伤口愈合过程中的炎症细胞数量，并显著抑制炎症因子水平[8]。然而，亚油酸在RA治疗中的潜在作用和可能机制尚未阐明。
RA的病因尚不清楚，但已发现NF-κB信号通路在RA的发展中具有重要作用，相关研究表明可以通过抑制NF-κB信号通路发挥抗RA作用[9]。此外，近年来TLR4已被发现对RA的病理反应有重要影响，其作用机制与RA患者滑膜中TLR4的表达水平高于健康人有关[10]；随着研究的不断深入，姜黄素、青藤碱等植物提取物均可通过阻断或抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻和预防炎症反应，改善RA，成为治疗RA的潜在药物。因此，TLR4/NF-κB信号通路在RA的发病机制中起着重要作用。
因此，本研究旨在探讨亚油酸在治疗RA中的作用及其可能的机制。研究发现亚油酸通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻炎症反应，改善胶原诱导的RA，研究结果为亚油酸在RA中的生物学功能提供了新的认识，并为RA的治疗提供了一种新的药物。
1 材料与方法 1.1 实验动物从上海实验动物研究中心(中国)购买的36只体质量为(250-300)g的雄性SD大鼠。所有动物都被安置在控制温度(22 ℃)、湿度(50%)和光照(12 h光照/黑暗)下，自由获得标准饮食和水。
1.2 大鼠RA模型的建立及实验分组RA大鼠模型的建立，将Ⅱ型胶原溶解于0.05 mol·L-1醋酸溶液中，配成浓度为2 g·L-1的溶液，等体积加入胶原溶液与完全弗氏佐剂乳化，采用免疫注射法在尾根部皮内注射100 μg胶原乳剂，在d 7加强免疫。将SD大鼠分为6组，每组6只，包括：对照组、RA模型组、RA+亚油酸(0.1 mL)组、RA+亚油酸(0.2 mL)组、RA+亚油酸(0.4 mL)组和RA+甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)(20 mg·kg-1)组。对照组和模型组只给予0.9%生理盐水，其他组给予各体积亚油酸及10 mL·kg-1 MTX处理，连续灌胃7 d。然后处死大鼠，分别在不同时间测定各组大鼠的关节肿胀、足体积、足厚、关节周长。亚油酸(中国食品药品检定研究院，批号：111622-201704、含量：99.8%、规格：0.2 mL/支)、MTX(中国食品药品检定研究院，批号：100138-201606、含量：99.8%、规格：400 mg/支)。
1.3 HE染色关节软骨组织固定于4%多聚甲醛，石蜡包埋，切片厚4 μm，用苏木精染色10 min，室温用伊红处理5 min，组织学图像在光学显微镜下放大200倍获得。CX43光学显微镜(奥林巴斯株式会社，日本)。
1.4 ELISA检测采集血清样本，分析细胞因子释放情况。300 g血清在4 ℃下离心(2 000-3 000 r·min-1)15 min，收集上清液。用ELISA法检测血清样本中的IL-1、IL-6、TNF-α和IL-10蛋白水平。ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，中国)，MK3酶标仪(美国热电公司，美国)。
1.5 qRT-PCR用TRIzol(碧云天生物技术研究所，中国)法从关节软骨组织中提取总RNA，用TaqMan一步法将RNA反转录成cDNA。通过ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司，美国)进行qRT-PCR实验。用2-ΔΔCt法计算IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的相对mRNA表达水平。以GAPDH为内标，特异性引物如Tab 1所示：
| Primer | (5′-3′) primer sequence |
| F-IL-1β | TAACCTGCTGGTTGGTGATCC |
| R-IL-1β | TCTTCTTTTGGGATGTGGG |
| F-IL-6 | GAGACTTCCATCCAGCCTTC |
| R-IL-6 | GATTGTTTTCTCAGAGTGCATCA |
| F-TNF-α | TGACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAATGATC |
| R-TNF-α | CATGCTGGAGACAGTT |
| F-IL-10 | AGCTGGAGAGAGAGAATG |
| R-IL-10 | GACCAGCCTTAGGAATCGA |
| F-GAPDH | GCTCGACGGCGGGGG |
| R-GAPDH | CACAGAACGACGATGCTGATCAT |
反应体系为：2×SYBR® Green Realtime PCR预混液12.5 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模版2 μL，加ddH2O至25 μL。循环为：95 ℃变性5 min；95 ℃持续15 s、55 ℃持续15 s、72 ℃持续10 s，进行40个循环；72 ℃延伸5 min。
1.6 Western blot检测用RIPA裂解缓冲液分离关节软骨组织中的蛋白质，BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)定量。再用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白质，并转移到PVDF膜上(Millipore，MA，美国)。然后，用5%脱脂乳封闭膜，并在4 ℃下过夜，用抗TLR4(1∶1 000，ab22048)、抗p-NF-κB p65(1∶1 000，ab86299)、抗NF-κB p65(1∶1 000，ab16502)和抗GAPDH(1∶2 000，ab181602)等一抗处理。用HRP结合二次抗体(1∶2 000，ab6728)在室温下冲洗1 h。最后，用增强化学发光试剂盒(ECL，Millipore，Bedford，MA，美国)观察蛋白质印迹。所有抗体均来自Abcam(MA，美国)。
1.7 免疫组织化学法用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片5 μm。用TLR4(1∶100，ab22048)、p-NF-κB p65(1∶100，ab86299)抗体对组织进行免疫染色。然后用生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G二次抗体孵育，在37 ℃下1∶500稀释，再次孵育30 min，用DAB作显色剂。图像在光学显微镜下获取，CX43光学显微镜(奥林巴斯，日本)；所有抗体均来自Abcam (MA，美国)。
1.8 统计分析数据用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，所有数据以x±s表示，进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Tukey's检验比较多组之间的差异。
2 结果 2.1 亚油酸对RA大鼠关节肿胀的影响构建Ⅱ型胶原诱导的RA大鼠模型，通过不同剂量亚油酸和MTX的处理，探讨亚油酸对RA大鼠关节肿胀的影响。如Fig 1A所示，Ⅱ型胶原诱导的RA大鼠关节与对照组相比肿胀明显，而亚油酸显著改善了RA大鼠的关节肿胀。此外，还测量了不同组在相应天数下的足部体积、足部厚度和关节周长，如Fig 1B-D所示，RA大鼠足部体积、足部厚度和关节周长数据明显大于对照组，而经过亚油酸处理后都得到了显著改善(P < 0.01)。实验结果表明，亚油酸有效改善了Ⅱ型胶原诱导的大鼠RA导致的关节肿胀。
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| Fig 1 Effects of linoleic acid on joint swelling in RA rats (x±s, n=6) (A) The image of joints in rats treated with different doses of linoleic acid. (B) Foot volume, (C) Foot thickness and (D) Circumference of joint were measured. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs RA group. |
对不同分组的RA大鼠关节软骨组织进行了HE检测。如Fig 2A所示，对照组大鼠关节软骨表面光滑，层次完整，滑膜下层细胞分散且少，无炎症或骨质破坏。而RA大鼠关节部位表现出典型的病理特征，如滑膜细胞显著增加、滑膜增生、伴有炎性细胞浸润和血管翳形成，关节软骨和骨严重破坏，经亚油酸处理后明显减轻了RA大鼠的上述现象。结果表明亚油酸可改善RA大鼠关节病理损伤。
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| Fig 2 Effects of linoleic acid on joint pathological injury in RA rats (x±s, n=6) A: Histological changes of articular cartilage were observed by HE analysis (×200); B: The score of HE (infiltration degree of inflammatory cells).**P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs RA group. |
采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等炎性因子的表达水平。如Fig 3A所示，与对照组相比，Ⅱ型胶原诱导的RA大鼠TNF-α等炎性因子表达量明显增加，而与模型组相比，亚油酸处理后抑制RA大鼠炎性因子表达(P < 0.05)。同时，qRT-PCR对炎性因子的mRNA测定也得到了相同的结果，如Fig 3B所示，与模型组相比，随着亚油酸的增加明显降低了Ⅱ型胶原诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的mRNA表达水平。这些数据表明亚油酸能改善RA大鼠的炎症反应。
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| Fig 3 Effects of linoleic acid on inflammatory response in RA rats (x±s, n=6) A: The levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-10 in serum from RA rats treated with linoleic acid were determined by ELISA assay; B: The mRNA levels of IL-1β, IL-6, TNF-α and IL-10 in articular cartilage from RA rats treated with linoleic acid were determined by qRT-PCR assay.**P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs RA group. |
采用免疫组化和Western blot方法检测亚油酸对TLR4/NF-κB信号通路表达的影响。如Fig 4A所示，亚油酸剂量的增加抑制了TLR4/NF-κB信号通路蛋白TLR4和p-p65在组织中的阳性产物表达；Fig 4B所示亚油酸抑制了TLR4/NF-κB信号通路TLR4的表达以及p65蛋白的磷酸化，通过免疫组织化学法和Western blot的检测结果可以明显看到抑制趋势(P < 0.05)。结果显示亚油酸抑制RA大鼠TLR4/NF-κB信号通路的表达，通过调节TLR4/NF-κB信号通路改善Ⅱ型胶原诱导的大鼠RA。
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| Fig 4 Effects of linoleic acid on expression levels of TLR4/NF-κB signaling pathway in articular cartilage tissues of RA rats (x±s, n=6) (A) Immunohistochemical test, and (B) Western blot assay were used to assess the effects of linoleic acid on the protein levels of TLR4/NF-κB signaling pathway in articular cartilage tissues of RA rats treated with linoleic acid.**P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs RA group. |
近年来，RA的临床治疗取得了很大进展，主要体现在生物改良抗风湿药物和小分子靶向抑制剂，包括TNF抑制剂、IL-6抑制剂、抗T细胞共刺激药物、抗B细胞药物等，尽管这些生物制剂的作用靶点不同，但研究人员发现这些药物最终都是通过干扰RA的炎症进程发挥作用[11]。虽然近年来RA的治疗取得了很大的进展，但目前这些治疗药物只能部分缓解病情的进展，在RA的治疗方面仍然存在巨大的挑战，这说明开发和筛选新的治疗药物仍然具有重要意义。植物提取物具有资源丰富、细胞毒性相对较小、易获得、成本低廉等诸多积极优势。因此，本研究旨在探讨亚油酸在RA发生发展过程中的可能作用及其机制，体内研究表明亚油酸能明显改善关节肿胀、足部体积、足部厚度，RA大鼠关节周长及关节病理损伤。
RA是一种自身免疫性疾病，其基本病理改变为滑膜炎[12]。研究表明，RA活动期血清和滑膜中炎性细胞因子的表达发生了变化，这些细胞因子中最重要的是TNF-α和IL-1β，它们通常同时存在于炎性细胞中，并且相互作用，其主要机制是激活血管内皮细胞，增强内皮细胞粘附分子的表达，从而聚集关节腔中的白细胞发挥炎症作用，引起相应的临床症状和的软骨破坏[13]，同时炎性反应可刺激TNF-α和IL-1β的合成，从而形成恶性循环。TNF-α主要影响滑膜炎的严重程度，而IL-1β对软骨破坏有更大的影响，IL-6和IL-10也与RA的进展密切相关[14]。所以，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10作为观察指标可以客观、系统地反映RA的病情。因此，本研究进行了ELISA和qRT-PCR检测，数据显示亚油酸可抑制Ⅱ型胶原诱导的RA大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的蛋白表达水平和mRNA表达水平。
NF-κB信号通路在RA的发生发展中起着重要作用，因此受到越来越多的关注[15]。NF-κB是一种多效性核转录因子，存在于几乎所有类型细胞的细胞质中，通常以非活性形式存在，在细胞活化、淋巴细胞发育、应激反应、凋亡等细胞活动中发挥重要作用。NF-κB的激活可提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、粘附分子、G-CSF和COX-2的转录水平，同时对TNF-α、IL-1β等多种炎症介质进行正调控和促进[16]，而TNF-α和IL-1β可进一步激活NF-κB的表达，从而形成恶性循环，并导致RA反应和结构损伤的维持和进展[17]，因此，阻断RA患者病理状态下NF-κB的激活可以下调炎性细胞因子的表达，从而阻断RA的发展。最近的研究表明TLR4与RA的进展和发展密切相关，并在RA患者中高度表达[18]，TLR4一种Ⅰ型跨膜蛋白，并表达于多种组织细胞中，并通过NF-κB途径启动细胞内的信号转导。TLR4/NF-κB信号通路是RA发病过程中重要的炎症相关通路之一，细胞膜上的TLR4将信号传递给细胞质中的NF-κB、p65，激活NF-κB二聚体从细胞质到细胞核的易位，指导相关基因的转录和翻译，促进细胞分泌下游产物，进一步影响RA的进展和发展，TLR4/NF-κB信号通路已被证明是RA治疗的靶向途径。在本研究中，通过免疫组化法发现亚油酸抑制RA大鼠TLR4/NF-κB信号通路中TLR4和p-p65的表达，同时WB检测也得到了相同的结果。
总之，亚油酸能够抑制RA导致的炎性反应，其机制与亚油酸能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路TLR4和p-p65的蛋白表达水平，进而抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10的表达有关，通过实验证实了亚油酸通过抑制炎症反应和阻断TLR4/NF-κB信号通路对RA具有潜在的治疗作用。因此，为亚油酸可能成为RA治疗药物提供了依据。
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