柚皮素(naringenin)即4′, 5, 7-三羟基黄烷酮(4′, 5, 7-trihydroxyflavanone)属于二氢黄酮类化合物，是柑橘属植物的次生代谢产物。柚皮素作为柚皮苷的苷元，广泛存在于柠檬、橘子、胡柚等天然产物的果皮和果肉中。柚皮素具有消炎、抗氧化等多种生物学、药理学活性[1]。动物实验结果证实，柚皮素对于多种疾病，如糖尿病、肥胖、高血压癌症、神经退化、肾损伤等具有良好的预防和保护作用[2-3]。研究发现，柚皮素还可以改善血脂，降低肝脏脂质积累，减少动脉粥样硬化斑块形成[4]。
药物以及其他的外源性物质在体内代谢过程中，经过氧化、还原及水解等第一相反应外，经常还要与极性更强的葡萄糖醛酸、硫酸等结合，提高溶解度，即第二相反应，参与反应的酶统称为Ⅱ相解毒酶。核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是应激诱导的的转录因子，在维护机体氧化还原平衡过程中起着关键作用[5]。在细胞的正常状态时，无活性的Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 (kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)结合而被泛素化并降解；细胞应激产生时，Nrf2被释放、移入核内，与DNA上的抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合，启动下游抗氧化靶基因的转录[5]。药物代谢过程中的Ⅱ相解毒酶如NAD(P)H: 醌氧化还原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase1，NQO-1)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)等均受Nrf2调控[5]。
动脉粥样硬化病变的发生、发展与机体炎症关系密切。在病变早期，多余脂质以氧化的低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein，ox-LDL)形式沉积在血管壁，诱发血管炎症，使单核/巨噬细胞、平滑肌细胞向内膜间隙迁移，促进斑块的形成。在病变末期，血管炎症降低斑块的纤维帽、使斑块不稳定。所以，降低血管炎症可有效抑制动脉粥样硬化的发生与发展。本研究拟分析柚皮素对Nrf2介导的Ⅱ相解毒酶活性的调节作用；同时利用载脂蛋白E(apolipoprotein, apoE)基因敲除的动脉粥样硬化模型小鼠(apoE-/-)作为实验动物，分析柚皮素对主动脉血管炎症的作用。
1 材料与方法 1.1 试剂巨噬细胞系RAW264.7细胞购于中科院细胞库(货号：TCM13)；DMEM培养基购于Gibco(批号：8120206)；血清购于杭州四季青公司(批号：20090301)；NQO-1 (批号：00091222)、GST(批号：00056400)、GCLc(批号：00091423)和GCLm(批号：00091314)等抗体购自武汉三鹰公司、各种酶活性检测试剂盒购自南京建成公司；ECL发光液(货号：P0018M)购自江苏碧云天公司；apoE-/-小鼠(货号：J002052)购置于南京大学模式动物研究所；其他生物试剂使用国产试剂。
1.2 细胞培养RAW264.7巨噬细胞培养在含10% 胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃，5% CO2环境中培养。当细胞生长70%左右融合度时，进行分组，并分别处理24 h：用50 mg·L-1, ox-LDL孵育，使其转变为荷脂细胞[6]；ox-LDL(50 mg·L-1)与不同浓度柚皮素(10 μmol·L-1和50 μmol·L-1)共同孵育；ox-LDL(50 mg·L-1)、柚皮素(50 μmol·L-1)以及Nrf2抑制剂ML385(5 μmol·L-1)共同孵育。
1.3 小鼠处理ApoE-/-小鼠饲养于(20±2)℃、相对湿度40%-70%、自然昼夜采光环境中，将6周龄、体质量为(18-20) g的小鼠进行高脂肪饲料喂养(21%脂肪和0.15%胆固醇)，其中一部分进行80 mg·kg-1柚皮素喂养8周；另外一组在柚皮素诱导的过程中，通过腹腔注射ML385(10 mg·kg-1)，两天一次，处理两周。
1.4 Ⅱ相酶含量和活性检测NQO-1含量的检测通过酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒进行；GST和GCL活性检测通过酶活性试剂盒进行。均按照南京建成生物工程研究所提供的操作步骤进行。以Biotek Epoch微孔板分光光度计(Biotech)测定相应指标的吸光度值。
1.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)细胞或组织冰上裂解后，通过BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白于10% SDS-PAGE蛋白电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭2 h后，相继进行一抗、二抗孵育，最后将膜用TBST充分洗涤，并加入ECL发光液，在Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像分析系统(Bio-Rad)获取图像。
1.6 逆转录荧光实时定量PCR(RT-qPCR)获取血管组织，用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，取1 μg总RNA逆转录合成cDNA第一条链，以此为模板进行PCR反应。用β-actin作为内参照，计算各目的基因相对于内参的表达量。
1.7 细胞免疫荧光取6-8 μm的主动脉根部冰冻切片，经丙酮固定后，进行0.2%Triton X-100(磷酸盐缓冲液配制)通透处理。封闭之后，分别用鼠抗白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)和鼠抗单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)孵育过夜，再与荧光标记的二抗室温孵育2 h，经洗涤、封片之后，在倒置荧光显微镜(Nikon)下观察、采集图像。
1.8 免疫共沉淀将细胞接种于10 cm培养皿中，经各种相应的处理后进行裂解，并将预先洗好的蛋白A/G琼脂糖珠子、抗Keap-1一抗加入到裂解液中，于4 ℃摇转孵育2-3 h，进行免疫沉淀。混合物于4 ℃ 3 000 r·min-1离心3 min，弃上清，用1 mL预冷的细胞裂解液洗涤3次，弃去上清。最后加入25-50 μL 2×SDS上样缓冲液重悬，沸水煮5 min，游离抗原、抗体和珠子。再于4 ℃、10 000 r·min-1离心1 min，收集上清，取20 μL样品进行Western blot实验。
1.9 统计学分析数据均以x±s表示，用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，两组间的比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 柚皮素激活Nrf2活性对RAW264.7细胞分别进行ox-LDL处理、ox-LDL和不同浓度柚皮素共处理，结果发现ox-LDL促进核内Nrf2的水平，细胞质中的Nrf2含量并没有明显增加。而10 μmol·L-1和50 μmol·L-1的柚皮素均可进一步提高核内Nrf2，其中50 μmol·L-1的柚皮素处理的细胞中的Nrf2水平比单独ox-LDL处理的细胞的Nrf2水平提高了1.25倍(Fig 1A, B)。同时，免疫共沉淀结果显示，柚皮素降低Nrf2与Keap1的结合(Fig 1C)。该结果说明，柚皮素促进其核内转移，激活Nrf2。
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| Fig 1 Nrf2 nuclear accumulation in RAW264.7 cells promoted by naringenin (x±s, n=3) A: Nrf2 level in nucleus and cytoplasm, respectively; B: The relative level of cytosolic/nuclear ratio of Nrf2; C: Coimmunoprecipitation assay for Nrf2/Keap1 interaction. 1:Control; 2:ox-LDL; 3: ox-LDL+N10;4:ox-LDL+N50. *P < 0.05 vs untreated control; #P < 0.05 vs ox-LDL-treated cells. N10: naringenin (10 μmol·L-1); N50: naringenein (50 μmol·L-1). |
分别对RAW264.7细胞进行处理：ox-LDL(50 mg·L-1)、ox-LDL+柚皮素(50 μmol·L-1)以及ox-LDL+柚皮素(50 μmol·L-1)+ ML385。对直接受控于Nrf2的Ⅱ相解毒酶NQO-1、GST、GCLc催化亚基(GCLc)以及GCL调节亚基(GCLm)的表达进行检测，Western blot结果显示与单独的ox-LDL处理组相比，柚皮素(50 μmol·L-1)提高了上述解毒酶的蛋白水平(Fig 2)。另外，利用Nrf2抑制剂ML385对细胞进行处理后发现ML385均能明显降低NQO1、GST、GCLc和GCLm的表达(Fig 2)，说明柚皮素可能通过Nrf2的作用，参与对Ⅱ相解毒酶的调节。
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| Fig 2 The promoting effect of naringenin on phase Ⅱ detoxifying enzymes mediated by Nrf2 in RAW264.7 cells (x±s, n=3) A: Expression of NQO-1, GST, GCLc and GCLm detected by Western blot. B: Quantification of the expressions. 1:Control; 2:ox-LDL; 3: ox-LDL+Nar; 4:ox-LDL+Nar+ML385. *P < 0.05 vs untreated control; #P < 0.05 vs ox-LDL cells; &P < 0.05 vs cell group treated with ox-LDL and naringenin. Nar: naringenin. |
进一步分析柚皮素在细胞炎症反应中的作用，结果显示，ox-LDL明显提高IL-6、MCP-1、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和细胞间黏附分子1 (intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)蛋白水平，而柚皮素降低这些炎症因子表达(Fig 3)；ML385处理破坏柚皮素的作用，促进炎症因子IL-6、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的产生(Fig 3)，说明柚皮素的抑制炎症作用与Nrf2的活化有关。
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| Fig 3 Protein levels of IL-6, MCP-1, VCAM-1 and ICAM-1 in RAW264.7 cells (x±s, n=3) 1:Control; 2:ox-LDL; 3: ox-LDL+Nar; 4:ox-LDL+Nar+ML385. *P < 0.05 vs untreated control; #P < 0.05 vs ox-LDL cells; &P < 0.05 vs cell group treated with ox-LDL and naringenin. Nar: naringenin. |
对apoE小鼠进行高脂饮食(high fat diet, HFD)、HFD+柚皮素以及HFD+柚皮素+ML385处理后，发现HFD小鼠中肝脏的NQO-1、GST、GCLc以及GCLm的蛋白表达均明显提高；柚皮素进一步促进这些Ⅱ相解毒酶的蛋白含量(Fig 4A)。而Nrf2抑制剂ML385则明显降低小鼠肝脏NQO-1、GST、GCLc以及GCLm的水平(Fig 4A)。进一步我们通过ELISA对肝脏内NQO-1含量进行检测，发现柚皮素提高了1.75倍(0.28 μg·g-1 vs 0.77 μg·g-1)；而ML385处理组与柚皮素组相比，降低了60% (0.31 μg·g-1 vs 0.77 μg·g-1)(Fig 4B)。同时，对GST、GCL两种酶的活性进行检测我们获得相似的结果，即HFD和柚皮素均提高这两种酶的活性，而ML385则对这些酶的活性有抑制作用(Fig 4C, D)。
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| Fig 4 Protein levels and activities of NQO-1, GST, GCLc and GCLm in livers (x±s, n=8) 1:Normal diet; 2: HFD; 3:HFD+Nar; 4:HFD+Nar+ML385. *P < 0.05 vs normal diet mice; #P < 0.05 vs HFD mice; &P < 0.05 vs HFD+ Nar mice. Nar: naringenin; HFD: high fat diet. |
对不同处理小鼠的主动脉血管炎症进行分析，免疫荧光检测结果显示，柚皮素抑制HFD诱导的IL-6、MCP-1的表达，而ML385处理则消除这种抑制作用，使IL-6和MCP-1的表达上调(Fig 5A，B)。最后，我们利用RT-qPCR对血管炎症介质的mRNA水平进行检测，发现MCP-1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-18、ICAM-1、VCAM-1、E-选择素(E-selectin)的表达均受柚皮素抑制，而且也被ML385所激活(Fig 5C)。该结果说明，柚皮素通过调节Nrf2的活性抑制体内主动脉血管的炎症。
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| Fig 5 Vascular inflammation at aortic root in apoE-/- mice (x±s, n=8) A, B: Immunofluorescence assay for IL-6 and MCP-1 expressions (×100); C: Transcription level of the indicated inflammatory mediators. 1:Normal diet; 2:HFD; 3: HFD+Nar; 4:HFD+Nar+ML385. *P < 0.05 vs normal diet mice; #P < 0.05 vs HFD mice; &P < 0.05 vs HFD+Nar mice. Nar: naringenin; HFD: high fat diet. |
本研究证实柚皮素激活Nrf2介导的抗氧化以及Ⅱ相解毒反应，通过该调控作用抑制血管炎症因子的产生。柚皮素之前已被证明在降低细胞毒性和氧化应激中具有重要的作用，研究发现柚皮素可抑制6-羟多巴胺诱导的线粒体损伤、防止神经退化Kesh；柚皮素对于各种杀虫诱导的毒性均有较好的抑制作用[7]。另外，柚皮素还可以缓解CCl4、砷、镉、铅和铁引起的细胞毒性[8-12]。而且人们发现柚皮素的解毒效果与其抑制氧化应激有关[13]。本研究中，我们进一步证实柚皮素还可以直接促进Ⅱ相反应，特别是提高NQO-1活性降低机体炎症，参与细胞调控作用。NQO-1酶是一种典型的Ⅱ相酶，属于黄素酶，可催化醌类物质从NAD(P)H接受双电子，而被还原为活性更低的氢醌类化合物，从而参与醌及其衍生物的解毒反应。这为我们对柚皮素的药理作用研究提供一个新的方向。
Ⅱ相解毒反应主要是药物、激素以及其他外源性物质如食品添加剂等经过第一相反应，特别是在细胞色素P450氧化酶为主的氧化反应之后，再与极性分子如葡萄糖醛酸、谷胱甘肽等的结合反应，降低活性、增强极性并顺利排出体外。其中的Ⅱ相酶除了NQO-1外，我们还证明柚皮素可调控GCL、GST的活性。GCL包含GCL催化亚基(GCLc)和GCL调节亚基(GCLm)，是谷胱甘肽合成的限速酶。GST催化谷胱甘肽与底物结合，使其极性和水溶性增加。除此之外，在Ⅱ相酶中，还有UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGT)、硫酸转移酶(sulfotransferase，SULT)、N-乙酰转移酶(N-acetyltransferase，NAT)等，分别负责转葡萄糖醛酸、硫酸根和乙酰基的结合。本研究中，我们只对Nrf2关系比较密切的NQO1、GCL和GST进行分析，而柚皮素是否通过UGT、NAT和SULT等改善细胞生理状况，还需要进一步研究。
Nrf2在机体的抗氧化还原反应中起中心位置。当机体活性氧如超氧阴离子自由基、过氧化氢以及羟自由基等增加，即产生氧化应激时，Nrf2被活化，进入核内促进具有ARE元件的基因转录。除了NQO-1和GSH-ST外，机体中抗氧化还原的因子如血红素加氧酶1(hemeoxygenase1，HO-1)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、硫氧还蛋白(thioredoxin)等均受Nrf2的调控[5]。本研究中，我们证实柚皮素可活化Nrf2，我们推测柚皮素还可能通过Nrf2调控这些氧化应激相关因子，即联合抑制氧化应激和促进Ⅱ相解毒酶活性共同作用，抑制机体的炎症反应。
在动脉粥样硬化的发生过程中，过量的ox-LDL在血管壁的沉积是一个重要的事件，由此触发血管炎症和动脉粥样硬化斑块的形成。之前人们报道过柚皮素可以降低单核/巨噬细胞黏附，降低血脂、抑制机体抗炎，从而降低动脉粥样硬化的发生[14-16]，本研究则从另外一个角度，即Nrf2介导的Ⅱ相解毒酶的活性调控上分析其抗炎作用和抗动脉粥样硬化作用，将体内代谢调控与抗炎作用进一步联系起来。
总之，本研究证实柚皮素上调Nrf2活性，促进下游与Ⅱ相解毒酶相关的分子如NQO-1、GCL和GST的表达，从而降低血管炎症。这使我们对柚皮素的药理作用有了进一步的认识，同时也促进人们对柚皮素的抗动脉粥样硬化机制的了解。
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