2. 山东国际生物科技园发展有限公司，山东 烟台 264670
2. Shandong International Biotechnology Park Development Co., Ltd, Yantai Shandong 264670, China
胰腺癌是消化道肿瘤中恶性程度极高的一种，其解剖位置的特殊性导致早期症状不明显、病情恶变快、预后极差，且在癌症早期就发生转移，80%的胰腺癌患者确诊时已失去手术切除的时机，所以胰腺癌的非手术治疗在延长胰腺癌患者生命、改善患者预后方面起着重要作用[1-2]。内科药物治疗是胰腺癌患者主要的非手术治疗手段，包括化疗和靶向治疗。然而，化疗药物毒副作用大，而现有的分子靶向药物如吉非替尼、厄洛替尼等很容易产生耐药，因此临床上亟需探索新的胰腺癌治疗药物。
随着肿瘤免疫学的发展及对肿瘤发生发展机理的不断深入认识，肿瘤疫苗已成为肿瘤免疫治疗的研究热点之一。肿瘤疫苗即利用肿瘤抗原，通过调节机体的免疫应答反应以抑止肿瘤的发生、发展，从而实现肿瘤治疗的目的[3]。我们前期对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)疫苗进行了持续研究，证实HUVEC疫苗可以诱发特异性的靶向肿瘤新生血管的免疫应答，通过阻断血管新生可以产生良好的抗肿瘤效应。但跟其它抗原形式的肿瘤疫苗面临类似的问题，即HUVEC疫苗虽然在预防性免疫中显示了良好的抗肿瘤作用，但其在治疗性免疫中的抗肿瘤作用仍有待提升[4-7]。
吉西他滨(gemcitabine，GEM)是一种脱氧嘧啶类似物，可通过抑制细胞DNA的合成以发挥抗肿瘤作用，已广泛应用于胰腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的临床治疗[8]。研究证实低剂量GEM可以降低细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells，CIK细胞)培养体系中CD4+ CD25+调节性T细胞的比例，提高CIK细胞的抗肿瘤效应[9]。含有GEM的胰腺癌细胞培养基能有效刺激树突状细胞成熟，诱导T细胞增殖，诱发细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)抗肿瘤免疫应答[10]，这都提示我们小剂量GEM可以提升疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答。在本实验中，我们将小剂量GEM引入HUVEC疫苗方案，以Pan02胰腺癌作为研究对象，考察小剂量GEM能否提升HUVEC疫苗在治疗性免疫中的抗胰腺癌作用，并研究可能的机制，为优化HUVEC疫苗临床治疗方案提供新思路。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物和细胞株♂ C57BL/6小鼠，4-5周龄，购自济南朋悦实验动物有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20190003，SPF级条件下饲养，符合滨州医学院伦理委员会认可；Pan02小鼠胰腺癌细胞购自中科院上海细胞库，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置于5% CO2培养箱于37 ℃条件下培养。HUVEC细胞购自美国ATCC细胞库，使用ECM内皮细胞专用培养基，置于5% CO2培养箱于37 ℃条件下培养。
1.1.2 试剂注射用盐酸吉西他滨购自江苏南京正大天晴制药有限公司(批准文号：国药准字H20093403)；RPMI-1640培养基(货号：SH30809.01)、胰酶消化液(货号: SH30042.01)购自美国Hyclone公司；胎牛血清(货号：11011-8611)购自杭州四季青试剂有限公司；细胞培养用青/链霉素混合液(货号：P1400)、TMB单组分显色液(货号：PR1200)，购自北京索莱宝科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA，货号：C7642)购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗小鼠IgG抗体(货号：ZB2305)购自北京中杉金桥生物科技有限公司；CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(货号：G1780)购自美国Promega公司；小鼠IFN-γ检测试剂盒(货号：SEA049Ra)购自武汉云克隆科技股份有限公司；其它试剂均为市售。
1.2 实验方法 1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立及分组将C57BL/6小鼠随机分为4组：PBS对照组，GEM组，HUVEC疫苗组和GEM与HUVEC疫苗联合(HUVEC-GEM)组。收集对数生长期的Pan02小鼠胰腺癌细胞，调整细胞浓度为5×109个·L-1，于小鼠左肋皮下接种0.1 mL(接种量为5×105细胞/小鼠)。在接种后的d 2、8、14皮下注射0.1 mL HUVEC疫苗(含1×106 HUVEC)，吉西他滨组于肿瘤接种后d 1、7、13腹腔注射100 μL GEM，使用剂量为30 mg·kg-1，HUVEC-GEM组腹腔注射100 μL GEM并且皮下注射100 μL的HUVEC疫苗，阴性对照组皮下注射100 μL PBS。待肿瘤成瘤后隔天用游标卡尺测量肿瘤长径和宽径，肿瘤体积按V=0.52×长径×宽径2计算，接种肿瘤后的d 18处死所有小鼠，剥取肿瘤并称重，计算抑瘤率，抑瘤率/%=(1-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%，并将剖取的肿瘤组织切片，HE染色后作病理分析。各组小鼠处死前眼眦静脉丛取血分离血清，-80 ℃保存备用。在实验过程中，观察小鼠的日常行为活动、毛发以及饮食情况等，并每周称量小鼠体质量，以评估小鼠整体健康状况。
1.2.2 免疫血清中HUVEC抗体检测用反复冻融的HUVEC裂解物作为包被抗原，将其溶解在pH 9.6碳酸盐缓冲液中，以100 μL/孔加入96孔酶标板，置于4 ℃冰箱中过夜。使用PBST洗涤3次，每孔加入100 μL 1 ∶50倍稀释的免疫血清，37 ℃孵育2 h，PBST洗涤3次，每孔加入1 ∶10 000倍稀释的HRP标记的兔抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h，使用TMB显色液室温避光显色20 min，用4 mol·L-1硫酸终止反应，酶标仪读取450 nm波长下吸光度值。
1.2.3 淋巴细胞增殖实验按治疗性免疫程序免疫小鼠，第三次免疫结束后7 d，脱颈处死各组小鼠，无菌分离小鼠脾脏，研磨过200目筛网，PBS洗涤重悬，加入等量的红细胞裂解液裂解红细胞，离心取沉淀，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×1010·L-1，于96孔细胞培养板接种，每孔接种100 μL(1×105细胞)，每组脾细胞中分别加入空白1640培养基、5 mg·L-1 ConA、100 mg·L-1的HUVEC裂解物，每个样品设置4个复孔。于37 ℃ CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，避光孵育1-2 h，酶标仪读取450 nm波长下吸光度值。
1.2.4 CTL杀伤活性实验脾淋巴细胞悬液制备同1.2.3部分，使用美国Promega公司CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒检测CTL细胞杀伤活性。各组小鼠脾淋巴细胞经HUVEC裂解物刺激2 d后作为效应细胞使用，取对数生长期的HUVEC细胞和Pan02细胞作为靶细胞。按照200 ∶1，100 ∶1，50 ∶1，25 ∶1的效靶比将脾淋巴细胞和HUVEC或Pan02细胞共培养于96孔U型细胞培养板中，并设置相应的效应细胞和靶细胞对照组，37 ℃共孵育4 h，吸取50 μL培养上清至96孔平底细胞培养板中，加入50 μL检测试剂，室温避光孵育30 min，每孔加入50 μL终止液，酶标仪读取490 nm波长下吸光度值，释放率按下列公式计算：释放率/%=(实验组OD490-效应细胞自发OD490-靶细胞自发OD490)/(靶细胞最大OD490-靶细胞自发OD490)×100%。
1.2.5 小鼠血清中IFN-γ检测按治疗性免疫程序免疫小鼠，第三次免疫结束后7 d，眼眦静脉丛取血分离各组血清，按照小鼠IFN-γ ELISA检测试剂盒说明书检测各组小鼠血清中IFN-γ水平。
1.3 统计学分析实验结果以x±s来表示，采用SPSS 11.5统计软件分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Student′s t test。
2 结果 2.1 GEM增强HUVEC疫苗抗胰腺癌作用如Fig 1所示，PBS组小鼠肿瘤生长迅速，肿瘤生长曲线较陡直，HUVEC、GEM及HUVEC-GEM治疗均在一定程度上延缓了肿瘤生长，其中HUVEC-GEM治疗抑制肿瘤生长的作用最显著。接种Pan02胰腺癌细胞18 d后PBS组肿瘤体积达到(1321.12±398.12) mm3，GEM、HUVEC和GEM+HUVEC组肿瘤体积分别为(1 058.52±327.08) mm3、(892.19±287.52) mm3及(575.33±128.37) mm3。实验结束后剖取的肿瘤瘤重结果与肿瘤体积结果一致，HUVEC-GEM组平均瘤质量明显低于HUVEC组及GEM单药组(P < 0.05 vs HUVEC, P < 0.01 vs GEM)，各组瘤质量分别为PBS: (1.01±0.11) g，GEM: (0.84±0.12) g，HUVEC: (0.65±0.17) g，HUVEC-GEM: (0.44±0.10) g。以上实验结果显示GEM的引入增强了HUVEC疫苗的抗肿瘤生长作用。
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| Fig 1 Therapeutic antitumor effect induced by GEM and HUVEC vaccine in subcutaneous pancreatic cancer-bearing mice (x±s, n=3) A: In vivo measurement of tumor growth; B: Subcutaneous tumor excised from mice (Ⅰ: PBS group, Ⅱ: GEM group, Ⅲ HUVEC group, Ⅳ HUVEC-GEM group); C: Wight of tumor from mice. *P < 0.05 vs HUVEC group; ##P < 0.01 vs GEM group. |
为进一步研究GEM增强HUVEC疫苗的抗胰腺癌药效学，我们对剖取的肿瘤进行切片后HE染色分析，光学显微镜下观察染色切片。实验结果如Fig 2所示，PBS组肿瘤细胞生长活跃，细胞结构较完整，未发现明显的坏死及炎症细胞浸润。GEM、HUVEC及HUVEC-GEM组均出现了一定程度的细胞坏死，伴随核固缩或溶解，其中HUVEC-GEM组肿瘤细胞坏死情况最明显，可见较大面积细胞坏死(坏死区域如箭头所示)，这说明GEM增强了HUVEC疫苗诱导的肿瘤细胞坏死。
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| Fig 2 Histopathology study of tumor tissues (200×) |
采用ELISA检测各组治疗方案诱导产生的抗体水平，实验结果如Fig 3所示，HUVEC及HUVEC-GEM组小鼠免疫血清中抗体水平有一定程度的上升，而GEM组未有HUVEC抗体产生。与HUVEC组比较，HUVEC-GEM组抗体水平也有上升(P < 0.01)，这说明低剂量的GEM引入HUVEC疫苗后，不会对小鼠免疫系统产生抑制，反而在一定程度上会提升HUVEC疫苗诱导的体液免疫应答水平。
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| Fig 3 Detection of anti-HUVEC humoral immune responses (x±s, n=3) **P < 0.01 vs HUVEC group; ##P < 0.01 vs GEM group. |
采用淋巴细胞增殖实验检测各组治疗方案诱导的细胞免疫应答强度，如Fig 4所示，PBS对照组与GEM组淋巴细胞未显示明显的增殖活性，而HUVEC和HUVEC-GEM组淋巴细胞均显示了一定的增殖活性，其中HUVEC-GEM给药组淋巴细胞增殖活性最明显，与HUVEC组差异有统计学意义(P < 0.01)，这说明低剂量GEM可以增强HUVEC疫苗诱导的淋巴细胞增殖活性。
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| Fig 4 Effect of different treatment on lymphocyte proliferation (x±s, n=4) **P < 0.01 vs HUVEC group; ##P < 0.01 vs GEM group. |
我们进一步使用美国Promega公司CytoTox96细胞毒性检测试剂盒检测各组治疗方案诱导的CTL细胞杀伤活性。如Fig 5所示，随着E ∶T比值的增大，HUVEC及HUVEC-GEM组效应细胞对靶细胞的杀伤活性逐渐增高，其中HUVEC-GEM组杀伤活性最高(P < 0.05 vs HUVEC)。HUVEC-GEM组小鼠脾细胞在E∶T为50∶1、100∶1及200∶1时均高于HUVEC组，而PBS和GEM组小鼠脾淋巴细胞对HUVEC细胞无杀伤功能。当靶细胞为Pan02细胞时，所有组淋巴细胞未显示杀伤活性，这说明疫苗诱导的CTL杀伤活性是HUVEC特异的。
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| Fig 5 Level of CTLs induced by different treatment (x±s, n=4) A: Cytolytic activity against HUVEC cells; B: Cytolytic activity against Pan02 cells. *P < 0.05 vs HUVEC group; ##P < 0.01 vs GEM group. |
采用ELISA检测试剂盒检测各组小鼠免疫血清中IFN-γ含量，实验结果如Fig 6所示，HUVEC组[(158.33±9.51)ng·L-1]和HUVEC-GEM组[(225.32±11.99)ng·L-1]IFN-γ含量都有所升高，GEM单药组免疫血清中未检测到IFN-γ；此外，HUVEC-GEM治疗后小鼠免疫血清中IFN-γ含量也远高于HUVEC组，差异有统计学意义(P < 0.01)，以上结果均表明低剂量GEM可以增强HUVEC疫苗诱导的细胞免疫应答强度。
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| Fig 6 Detection of INF-γ content of immune sera (x±s, n=3) *P < 0.05 vs HUVEC group; ##P < 0.01 vs GEM group. |
随着医学免疫学等学科的迅猛发展及对肿瘤微环境的不断认识，肿瘤免疫治疗得到了更深入系统的研究。本论文所研究的HUVEC疫苗是一种靶向肿瘤新生血管的主动免疫治疗策略，可以依靠有限次数的治疗诱导机体产生持续的免疫反应，抑制肿瘤血管的生成，拮抗肿瘤细胞的生长和转移，能够克服单克隆抗体等传统血管生成抑制剂类药物用药频繁，毒副作用大，患者用药负担重的缺点[11]。在我们前期研究中发现HUVEC疫苗在预防性免疫中抗肿瘤作用明显，但该疫苗在治疗性免疫中的抗肿瘤药效并不能完全令人满意，故而提升HUVEC疫苗的治疗性抗肿瘤药效是疫苗研发中的重要问题。
肿瘤抗原特异性CTL细胞是起主要杀伤作用的效应细胞，如何诱导机体产生有效的CTL免疫应答反应是肿瘤疫苗研发中的关键技术。自上世纪80年代研究人员发现低剂量环磷酰胺不仅不会产生免疫制剂作用，反而可以增加抗肿瘤免疫反应以来，化疗药的免疫激活作用引起了研究人员的兴趣。大量研究已证实持续节拍性非治疗剂量化疗药能发挥免疫调节作用，可以协助肿瘤疫苗诱导更有效的CTL免疫应答，提升疫苗的抗肿瘤药效[12-14]。本论文中所考察的化疗药物GEM是胰腺癌一线化疗药物，临床上已应用多年，安全性有保障。本研究中，我们将其引入HUVEC疫苗，考察非治疗剂量的GEM能否提升HUVEC疫苗在治疗性免疫中的抗肿瘤作用，并以此为例探讨非治疗剂量化疗药增强HUVEC疫苗抗肿瘤作用的可能机制。
实验结果表明，低剂量GEM引入HUVEC疫苗免疫方案后，可以有效提升HUVEC疫苗的治疗性抗胰腺癌作用，HUVEC-GEM组在治疗性免疫中的抑瘤率可以达到56.44%；GEM的引入可以协助HUVEC疫苗有效改善荷瘤小鼠的肿瘤微环境，肿瘤组织HE染色结果证实HUVEC-GEM组出现了更多的肿瘤细胞坏死及炎性细胞浸润；GEM引入后，协助HUVEC疫苗更有效的激活了B淋巴细胞，在经过2、8及14 d 3次免疫后，HUVEC-GEM组小鼠免疫血清中产生了高水平的HUVEC-抗体；HUVEC-GEM组小鼠的T细胞应答水平也明显高于其它各治疗组，说明GEM也增强了HUVEC疫苗激活肿瘤抗原特异性T细胞反应的能力，提升了HUVEC疫苗的特异性CTL杀伤活性；给药过程中观察各组小鼠证实HUVEC-GEM治疗方案的毒副作用较单一给药组并没有明显增加，实验小鼠的耐受性良好。综上所述，本实验的结果证实低剂量GEM作为免疫佐剂能增强HUVEC疫苗诱导的免疫应答强度，提升HUVEC疫苗在治疗性免疫中的抗肿瘤药效，本研究为HUVEC疫苗临床治疗方案提供了新选择，有潜在巨大的临床应用价值。
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