系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病因复杂的全身性疾病[1]，其异常免疫产生的大量自身抗体与自身抗原形成免疫复合物沉积，可导致多种脏器和结缔组织损伤。肾脏是SLE病情发展变化过程中常见的受累脏器，多发展为狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)，LN不仅是影响SLE预后的重要因素，也是引起终末期肾脏病的常见原因，需要进行积极防治。辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)在SLE和慢性炎症性疾病的发生、发展中起着至关重要的作用。白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)是Th17细胞分泌的一种促炎细胞因子，与多种自身免疫病发病机制有着密不可分的联系[2-3]。在SLE患者和易患狼疮的小鼠中发现Th17细胞数量增加和IL-17水平升高，患者血浆中IL-17水平与肾脏病变及狼疮活动指数呈正相关[4]，这些都提示Th17和IL-17的水平与SLE疾病发生发展相关。
芍药苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)为本课题组合成的新型化合物。研究发现，CP-25可调节T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞等多种免疫细胞功能，对类风湿关节炎、干燥综合征等自身免疫性疾病动物模型均具有较好的治疗作用[5]。SLE以T细胞、B细胞等多种免疫细胞功能紊乱造成的自身免疫为特征，临床主要以激素类和免疫抑制剂治疗，缺少高效、低毒的治疗药物。CP-25作为天然药物来源的小分子化合物，是否可以通过抑制Th17细胞分化、调节炎症免疫反应对SLE发挥治疗作用尚未见报道。MRL/lpr小鼠由于Fas基因缺失，表现为淋巴细胞异常增殖、肾功能损伤、抗双链DNA(anti-dsDNA)水平升高，表现与人类狼疮样临床特征类似，故常用作SLE的动物模型。基于此，本实验拟探究CP-25对MRL/lpr狼疮小鼠肾脏损伤的治疗作用及调控Th17细胞分化的机制，为CP-25临床用于LN防治提供实验依据。
1 材料 1.1 药物与试剂CP-25为纯度大于98%的白色粉末，由安徽医科大学临床药理研究所提供，使用时溶解于羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中。醋酸泼尼松(批号：180505)为浙江仙琚制药产品；抗小鼠CD3-PE(批号：8051834)、CD4-FITC(批号：8361803)、IL-17A-PE(批号：8302116)、CD69-PE-cy7(批号：8046564)流式抗体为BD Biosciences公司产品；STAT3(批号：7)和p-STAT3(批号：34)抗体为CST公司产品；抗RORγt抗体(批号：NBP2-24449)为Novus公司产品；CD3(批号：B302116)、CD28(批号：B308009)单克隆抗体、重组小鼠TGF-β(批号：B302236)、IL-6(批号：B309018)和IL-23(批号：B304416)为Biolegend公司产品；抗小鼠IL-17A预包被ELISA检测盒(批号：1211702)购自达科为生物技术公司、小鼠抗双链DNA(IgG)Elisa检测盒(批号：M10014300)购自武汉华美生物技术公司；佛波肉豆蔻醋酸(PMA)(批号：B302116)、离子霉素(批号：FMS20190819001)、布雷非德菌素A(BFA)(批号：FMS2019122301)和刀豆蛋白(ConA)(批号：FMS20190619001)购自福麦斯公司。
1.2 动物SPF级MRL/lpr小鼠，♀，40只，(25-35) g，10-12周，购自上海斯莱克有限责任公司, SCXK(沪) 2017-0005；SPF级BALB/c小鼠，♀，8只，(20-25) g，10-12周，购于安徽医科大学SPF级实验动物中心, SCXK(皖)2017-001。本实验已通过安徽医科大学临床药理研究所动物实验伦理审查委员会批准。
1.3 主要仪器瑞士Tecan公司全波长多功能酶标仪(型号：Infinite M1000 Pro)、美国Beckman公司流式细胞仪(型号：CytoFLEX)、美国GE公司荧光及化学发光成像系统(型号：ImageQuant LAS 4000)、ABI公司实时荧光定量PCR系统(型号：7500)。
2 方法 2.1 实验分组与给药将MRL/lpr小鼠随机分为5组，分别为模型组、CP-25组(20、40、80 mg·kg-1)和醋酸泼尼松(5 mg·kg-1)组，另设BALB/c小鼠为正常对照。动物饲养在SPF级动物实验室，给予正常饮食饮水，采用半定量尿蛋白试纸测量小鼠的尿蛋白水平，当尿蛋白大于1 μg·L-1时开始给药，正常组和模型组均给予等量溶媒。给药6周后，眼眶取血，颈椎脱臼处死小鼠。将眼眶血静置2 h，2 000 r·min-1离心10 min，收集上清，即为血清，-80 ℃保存备用。
2.2 组织病理学检查处死小鼠，打开腹腔，取出肾脏，置于组织固定液中24 h，石蜡包埋后，制成薄的组织切片，HE染色。置于40倍物镜下观察，拍照，分析各组小鼠肾脏组织病理学改变情况。
2.3 脾脏指数以及T细胞增殖的检测无菌环境中取出脾脏，称量脾脏重量，按照每100 g体质量的脾脏质量比，计算脾脏指数。
将脾脏置于无菌培养皿中，加淋巴细胞分离液研磨，过200目筛后800×g离心30 min，取中间玻璃层，加生理盐水洗涤，离心，得到的淡黄色沉淀即是脾脏淋巴细胞。加生理盐水重悬，调整脾脏淋巴细胞悬液浓度(1×1010个·L-1)，在96孔培养板上每孔加入100 μL细胞悬液(终浓度为5×109·L-1)和ConA(终浓度3 mg·L-1)，终容积为200 μL，各设3个复孔，置37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h，加入20 μL CCK-8试剂，避光37 ℃孵育1-3 h，酶标仪检测A450 nm值，分析统计。
2.4 体外诱导Th17细胞分化制备小鼠脾淋巴细胞悬液并调整适宜细胞浓度。先用抗CD3单抗(5 mg·L-1)包被96孔板，37 ℃孵育2 h后置于4 ℃备用。在孔板中先加入100 μL细胞，再加入CD28(2.5 mg·L-1)、TGF-β(20 mg·L-1)、IL-6(10 mg·L-1)和IL-23(30 μg·L-1)建立诱导Th17分化条件，最后分别加入不同浓度的CP-25(1×10-5，1×10-6和1×10-7 mol·L-1)，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养5 d，定向诱导T细胞向Th17细胞分化。另设立分化对照组，不加CP-25。培养5 d后离心取上清，下层细胞团加入TRIzol置于-80 ℃备用。
2.5 流式细胞术检测T细胞亚群常规制备小鼠脾脏淋巴细胞悬液，调细胞至适宜浓度，分别加入CD3-PE、CD4-FITC和CD69-PE-cy7流式抗体，4 ℃孵育40 min后洗涤离心，重悬后上机检测CD3+细胞及CD4+CD69+细胞比例。
Th17细胞比例检测：收集小鼠脾脏淋巴细胞和体外诱导后的细胞，用PMA、离子霉素和BFA混合物刺激处理4 h后，离心，收集细胞团重悬，加入CD4-FITC，4 ℃避光孵育45 min；经固定破膜处理后加入IL-17A-PE，4 ℃避光30 min，洗涤离心，重悬上机，检测CD4+IL-17A+细胞比例。
2.6 荧光定量PCR检测IL-17A的mRNA水平用TRIzol一步法获取小鼠脾脏和体外诱导后细胞中的总RNA，定量合成cDNA，将扩增试剂、引物和cDNA按照说明书混合，按说明书设定程序扩增，以GAPDH为参照，采用相对定量法=2-ΔΔT分析荧光定量结果。相关引物序列如下：
IL-17A：F 5′-TTCAGGGTCGAGAAGATGCT-3′，R 5′-AAACGTGGGGGTTTCTTAGG-3′；
GAPDH：F 5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，R 5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′。
2.7 Western blot检测相关蛋白表达收集小鼠脾脏组织和实验细胞，按比例(组织裂解液∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂=100 ∶1 ∶1)加入，充分研磨，冰上裂解30 min后离心取上清得到总蛋白，BCA蛋白定量；电泳；转膜；室温5%牛奶封闭90 min；加入一抗(STAT3、p-STAT3、RORγt和β-actin)4 ℃孵育过夜；次日洗涤后加入二抗37 ℃孵育90 min；洗膜显影。采用Image J软件进行目的蛋白的灰度值检测并进行统计分析。
2.8 ELISA法检测自身抗体与细胞因子水平检测小鼠血清中抗dsDNA、IL-17A水平以及细胞培养上清中IL-17A的水平，按照试剂盒说明书进行实验操作，将稀释好的标准品和样品加入酶标板中，设空白对照，加检测抗体，孵育，洗涤，加酶孵育，再次洗涤，加显色液反应5-30 min后，加终止液，10 min内，采用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的IOD值，依据说明书以及蛋白标准曲线计算蛋白浓度。
2.9 统计学处理应用SPSS 20.0软件分析实验所得数据，采用One-Way ANOVA分析方法比较多组间数据，使用GraphPad Prism 6.0软件绘制结果统计图。
3 结果 3.1 CP-25对MRL/lpr小鼠肾脏病理的影响检测小鼠肾脏组织病理学(Fig 1)结果显示，MRL/lpr小鼠肾脏体积明显增大，镜下可见肾小球球体增大变形，肾小球基底膜断裂(a)，入球小动脉玻璃样变性(b)，肾间质有大量炎性细胞浸润(c)，系膜细胞异常增生(d)；CP-25给药可明显抑制肾小球形变，减轻肾小球炎性细胞浸润，抑制系膜细胞的异常增生，对小鼠肾脏病理有明显改善作用。
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| Fig 1 Effect of CP-25 on renal pathology in MRL/lpr mice (×400) |
脾脏指数统计结果(Fig 2A)显示，与正常组比较，MRL/lpr小鼠的脾脏指数明显增高(P < 0.01)；CP-25(20、40、80 mg·kg-1)和醋酸泼尼松(5 mg·kg-1)给药均可明显降低小鼠脾脏指数(P < 0.01)。T细胞增殖能力统计结果显示(Fig 2B)，与正常组比较，模型组动物的T细胞增殖能力增加(P < 0.01)，CP-25和醋酸泼尼松给药可不同程度地抑制T淋巴细胞增殖(P < 0.05，0.01)。
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| Fig 2 Effect of CP-25 on spleen index and T cell proliferation of splenic lymphocytes of MRL/lpr mice (x±s, n=6) A: The index of spleen. B: The proliferation of splenic lymphocytes. **P < 0.01 vs normal; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model |
流式细胞术检测结果(Fig 3)显示，与正常组相比较，MRL/lpr小鼠总T细胞(CD3+)、活化T细胞(CD4+CD69+)与Th17细胞(CD4+IL-17+)的比例均明显升高(P < 0.05)；CP-25(20、40和80 mg·kg-1)及醋酸泼尼松(5 mg·kg-1)给药均可不同程度地降低其比例(P < 0.05, 0.01)。
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| Fig 3 Effect of CP-25 on T cell subsets in splenic lymphocytes of MRL/lpr mice (x±s, n=6) A: Effect of CP-25 on CD3+T cells, CD4+CD69+T cells and CD4+ IL-17A+T cells rate in splenic lymphocytes of MRL/lpr mice; B: Quantification of A. **P < 0.01 vs normal; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model |
qPCR检测结果表明(Fig 4)，与正常组比较，MRL/lpr小鼠脾脏组织中的IL-17A mRNA表达升高(P < 0.01)；与模型小鼠比较，CP-25和醋酸泼尼松给药均可降低IL-17A的mRNA表达水平(P < 0.05)。
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| Fig 4 Effect of CP-25 on IL-17A mRNA expression level in spleen tissues of MRL/lpr mice (x±s, n=6) **P < 0.01 vs normal; #P < 0.05 vs model |
检测小鼠血清中抗dsDNA和IL-17A水平(Fig 5)发现，模型小鼠血清中抗dsDNA和IL-17A水平均明显升高(P < 0.01)；CP-25和醋酸泼尼松给药可降低小鼠血清中抗dsDNA(P < 0.01)和IL-17A水平(P < 0.01)。
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| Fig 5 Effect of CP-25 on serum level of anti-dsDNA and IL-17A in MRL/lpr mice (x±s, n=6) **P < 0.01 vs normal; ##P < 0.01 vs model |
检测小鼠脾脏组织中的RORγt和p-STAT3的蛋白表达水平，模型小鼠RORγt和p-STAT3水平升高(P < 0.01)，但总的STAT3水平无明显差异(Fig 6A)；CP-25和醋酸泼尼松给药后，各给药组脾脏组织中上述目的蛋白表达相对于模型组均有不同程度降低(P < 0.05, P < 0.01)(Fig 6B)，各组总STAT3无明显变化。
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| Fig 6 Effect of CP-25 on expression of p-STAT3 and RORγt protein in spleen tissues of MRL/lpr mice (x±s, n=3) A: Expression of p-STAT3 and RORγt protein was detected by Western blot; B: Quantification of A. **P < 0.01 vs normal; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model |
为了进一步观察CP-25对Th17细胞分化的影响，体外采用TGF-β、IL-6和IL-23诱导小鼠脾脏单个核淋巴细胞向Th17细胞分化。流式细胞术检测结果显示(Fig 7)，诱导刺激后的Th17细胞百分比明显升高(P < 0.01)，体外给予CP-25(10-5、10-6、10-7 mol·L-1)后，Th17细胞亚群比例减少(P < 0.01)。
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| Fig 7 Effect of CP-25 on Th17 cell percentage in vitro (x±s, n=4) **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs stimulation |
进一步检测体外诱导的小鼠脾脏淋巴细胞的RORγt和p-STAT3蛋白表达情况，结果显示(Fig 8)，与非刺激诱导组比较，诱导刺激细胞的RORγt(P < 0.01)和p-STAT3(P < 0.05)的蛋白表达水平明显升高，CP-25均可不同程度降低RORγt(P < 0.05)和p-STAT3(10-5、10-6 mol·L-1，P < 0.05)蛋白表达水平，各组总STAT3水平无明显变化。
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| Fig 8 Effect of CP-25 on expression of p-STAT3 and RORγt protein in mouse splenic lymphcytes (x±s, n=3) A: Expression of p-STAT3 and RORγt protein was detected by Western blot; B: Quantification of A. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Normal stimulation; #P < 0.05 vs Model |
在刺激剂诱导细胞向Th17方向分化后，细胞培养上清中的IL-17A水平相对于对照组明显上升(Fig 9A)，CP-25(10-5、10-6、10-7 mol·L-1)可明显降低IL-17A水平(P < 0.01)。收集细胞，检测IL-17A mRNA水平结果显示(Fig 9B)，刺激剂诱导后IL-17A mRNA水平明显升高，CP-25(10-5、10-6、10-7 mol·L-1)同样可以降低IL-17A mRNA水平(P < 0.01)。
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| Fig 9 Effect of CP-25 on level of IL-17A cytokines and expression of IL-17A mRNA in vitro (x±s, n=4) A: Level of IL-17 cytokines in culture supernatant; B: Expression of IL-17A mRNA of mouse splenic lymphocytes in vitro. **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs stimulation |
SLE是一种慢性系统性自身免疫病，由先天性和适应性免疫系统的异常激活引起。大量自身抗体的生成并沉积于脏器可导致多器官损伤，尤其是肾脏的损伤，出现蛋白尿、肾脏衰竭，严重的可危及生命。CP-25对小鼠胶原性关节炎、大鼠佐剂性关节炎以及小鼠干燥综合征等自身免疫病模型具有明显治疗作用[6]。MRL/lpr小鼠是经典的自发性SLE动物模型，以T细胞激活、产生大量自身抗体等免疫功能紊乱为特征、导致脾脏病理性肿大和明显的间质性肾炎。本研究结果表明，CP-25可降低MRL/lpr小鼠脾脏指数，降低血清中抗dsDNA水平，抑制肾小球形变，减轻肾小球炎症性细胞浸润，抑制系膜细胞的异常增生，提示CP-25对MRL/lpr小鼠的肾脏病变具有明显的治疗作用。
在SLE发病过程中，T细胞亚群比例和功能明显异常，在促进炎性细胞因子产生和浸润靶组织等方面发挥重要作用[7]。作为主要的促炎性T细胞亚群，Th17细胞主要分泌特异性促炎细胞因子IL-17，参与了SLE治疗中的糖皮质激素抵抗，募集单核细胞和中性粒细胞并刺激产生各种炎性介质，促进生发中心的形成和自身免疫发展[8]。SLE患者血清中IL-17水平与疾病活动度、抗dsDNA水平之间也存在正性相关。维A酸相关孤独受体γ-t(retinoic acid-related orphan nuclear hormone receptor γ-t，RORγt)是一种特异性转录因子，参与Th17细胞分化和功能调控，缺少RORγt会导致Th17细胞活性下降，IL-17表达水平严重降低。本研究中，CP-25给药可明显降低MRL/lpr小鼠总T细胞(CD3+)、活化T细胞(CD4+CD69+)以及Th17细胞(CD4+IL-17+)比例，降低小鼠血清中IL-17A水平，同时，还可以降低脾脏组织中IL-17A的mRNA表达水平以及RORγt的蛋白表达水平，这些结果均表明CP-25可有效降低MRL/lpr小鼠体内Th17细胞的比例。
信号转导子及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription proteins，STAT3)可调控IL-17分泌、T细胞分化和促进T细胞迁移，抑制STAT3信号可以延迟狼疮易发小鼠自身免疫的发生[9]，降低淋巴细胞积累，抑制T细胞迁移，从而改善肾脏损伤。STAT3信号在狼疮患者中明显异常，腹腔注射小分子STAT3抑制剂可延缓MRL/lpr小鼠的蛋白尿发作并降低自身抗体滴度[10]，在T细胞中不表达STAT3的狼疮小鼠也不会发展为淋巴结病、脾肿大或肾小球肾炎[11]。通过使用基因敲除小鼠模型，已证明STAT3能与Th17细胞的IL-17启动子直接结合[12]，提示T细胞特异性STAT3缺失可显著影响IL-17的表达。在本研究中，MRL/lpr小鼠脾脏组织中STAT3蛋白的磷酸化水平明显升高，给予CP-25治疗后的小鼠p-STAT3降低。在体外诱导小鼠脾脏淋巴细胞向Th17分化，加入CP-25后，STAT3磷酸化水平亦降低，RORγt转录因子蛋白表达减少，从而降低Th17比例，IL-17A mRNA相对表达水平下降，上清分泌的IL-17A细胞因子明显减少。这些结果提示CP-25可抑制T淋巴细胞向Th17细胞分化，降低Th17细胞比例和IL-17产生。
综上所述，CP-25可明显改善MRL/lpr小鼠肾脏病变，其机制与降低p-STAT3水平，抑制Th17分化和IL-17产生有关。
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