2. 重庆医科大学药学院，重庆 400016;
3. 重庆医科大学实验教学管理中心中医药实验室，重庆 400016
2. College of Pharmacy, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
3. The Experimental Teaching Management Center of Traditional Chinese Medicine Laboratory, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
糖尿病是由遗传与环境因素引起的代谢紊乱，主要体现为胰岛素不敏感、缺乏以及相关功能受损。由于这种疾病的高流行率以及相关的残疾和死亡率，它已成为全世界严重的健康问题之一[1]。流行病学结果调查显示，中国成年人中糖尿病的患病率从2007年的9.7%增长至2017年的11.2%，患者总数估计为1.298亿人[2]，无疑给社会和经济发展带来了沉重负担。病因上，世卫组织将糖尿病归类为1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、妊娠期糖尿病和其他特定类型的糖尿病[3]。T1DM是一种自身免疫系统疾病[4]，特征为淋巴细胞介导破坏胰岛β细胞，导致胰岛素绝对分泌不足[5]。T2DM是一种受年龄、怀孕和肥胖等生活方式因素影响的最常见的糖尿病，越来越多的证据表明，T2DM的胰岛素释放同样受损[6]。胰岛的大小、数目和功能是胰岛β细胞分泌胰岛素的关键，胰岛β细胞受损或凋亡会显著降低胰岛素分泌水平，导致糖尿病的发生发展[7]。由此可知，保护胰岛β细胞功能，减少其凋亡是防治糖尿病的有效手段。
橙皮苷(hesperidin，HSD)最初由法国化学家Lebreton从柑橘皮中分离出来[8]，是一种黄酮类化合物。黄酮类化合物在植物体内有着广泛的分布，主要以游离状态或糖苷的形式存在，具有一定的抗氧化、抗癌以及抗炎等作用[9]。研究表明HSD除通过抗氧化、抗炎等作用间接改善糖尿病外，还可能具有保护大鼠胰岛β细胞和改善其功能的潜力[10]。但目前尚无相关文献明确HSD对胰岛β细胞的体外保护作用及其机制，因此本研究将进一步采用体外培养探讨HSD对胰岛β细胞活性及胰岛素分泌功能的影响，为HSD的进一步开发提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验试剂橙皮苷(纯度≥98%)由重庆医科大学侯毅老师惠赠。RPMI 1640培养基(货号：C11875500BT)、胎牛血清(货号：10099141)购自美国Gibco公司，Hoechst 33258溶液(货号: C0003)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：P0009)购自碧云天公司；棕榈酸(palmitic acid，PA)购自美国Sigma公司(货号：P0500)；CCK-8试剂盒(货号：CK04)购自日本同仁化学研究所，逆转录试剂盒(货号：RR047A)、SYBR-Green荧光定量PCR试剂(货号：RR820A)购自TaKaRa公司；小鼠胰岛素ELISA试剂盒(货号：CSB-E05071m)购自武汉华美公司；ECL发光液(货号: k12045-D10)购自美国advansta公司。
1.1.2 实验仪器细胞培养箱、酶标仪购自美国Thermo公司；正置荧光显微镜购自德国Leica公司；定量PCR仪、电泳仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶/发光图像分析系统购自法国Vilber Lourmat公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞由本实验室保存。MIN6细胞在RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清与1%青霉素-链霉素)，5% CO2、37 ℃条件下培养，细胞贴壁达80%-90%后传代。
1.2.2 原代胰岛的分离与提取使用颈椎脱臼法处死小鼠，用体积分数为75的酒精浸泡消毒后迅速打开腹腔找到胆总管, 用止血钳夹闭胆总管汇入十二指肠的入口处, 分离胆总管, 经胆总管近端缓慢注入0.65 g·L-1胶原酶P (Krebs缓冲液溶解，无菌过滤) 溶液2 mL, 胰腺充分膨胀后，剪下胰腺，放入含Krebs胶原酶的离心管中, 37 ℃水浴消化15 min, 充分振摇，添加Krebs缓冲液终止消化，50目滤网过滤处理后，按照1.4×103 r·min-1转速离心15 s，弃上清, 使用Krebs缓冲液重悬，重复3次，在显微镜下手工挑取胰岛，置于RPIM 1640完全培养基中。挑取后的胰岛放入细胞培养箱中进行培养。
1.2.3 CCK-8法检测细胞活性将MIN6细胞以6×103/孔接种于96孔细胞培养板中，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h贴壁，分别用含0、10、20、40、80、160 μmol·L-1浓度HSD的无血清培养基预孵育4 h后，换用含33.3 mmol·L-1葡萄糖和0.25 mmol·L-1 PA的高糖高脂培养基培养24 h，并设无细胞空白组以及5.5 mmol·L-1正常糖组。每孔加入新鲜无血清培养基90 μL及10 μL CCK-8试剂，培养箱培养2 h，用酶标仪检测各孔450 nm波长处的吸光度(A)值，实验重复3次。细胞存活率/%=(A实验组- A空白组)/(A对照组- A空白组)×100%。
1.2.4 细胞分组及处理将MIN6细胞以2×105/孔接种于12孔细胞培养板。贴壁后处理细胞，分为4组：① 5.5 mmol·L-1正常糖对照组(Control组)；②高脂高糖(33.3 mmol·L-1葡萄糖+0.25 mmol·L-1 PA)实验组(HFHG组)；③ 20 μmol·L-1 HSD预处理4 h+HFHG处理24 h组；④ 40 μmol·L-1 HSD预处理4 h+HFHG处理24 h组。
1.2.5 Hoechst 33258检测细胞凋亡细胞2×105/孔接种于放有细胞爬片的12孔板中，贴壁后对细胞分组进行处理，到时间后，将培养基去除，使用PBS清洗3次，每次3 min。在孔中添加0.5 mL 4%多聚甲醛溶液，固定时间为10 min，PBS洗涤。每孔加0.5 mL Hoechst 33258染色液，避光染色15 min，PBS洗涤，加入抗荧光淬灭封片液封片，正置荧光显微镜检测各组细胞核内染色质固缩情况。
1.2.6 Western blot提取各组细胞总蛋白，BCA法测定浓度。依照20 μg上样量，明确上样体积，使用SDS-PAGE凝胶电泳方法，湿法转入PVDF膜，封闭2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。4 ℃孵育一抗，低速摇床上过夜。次日TBST洗膜，加HRP标记的山羊抗鼠或山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法曝光。使用Fusion FX Spectra system自带图像分析软件分析图像。
1.2.7 实时荧光定量PCRTRIzol法提取各组细胞总RNA，Nanodrop 2000检测浓度，逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA后进行RT-PCR。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性4 s，58 ℃退火10 s，65 ℃延伸5 s，共40个循环。PCR扩增目的基因上、下游引物序列见Tab 1。计算2-△△Ct值，以GAPDH为内参，分析目的RNA表达水平。
| Gene | Forward primer(5′→3′) | Reverse primer(5′→3′) |
| GAPDH | AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | GGGGTCGTTGATGGCAACA |
| TNF-α | GTCTACTGAACTTCGGGGTGAT | ATGATCTGAGTGTGAGGGTCTG |
| IL-1β | GGCAACTGTTCCTGAACTCAACTG | CCATTGAGGTGGAGAGCTTTCAGC |
挑选大小相近的胰岛各20个置于12孔板内，各组胰岛处理同MIN6细胞，分组处理后，在含有2.8 mmol·L-1葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(KRB)中洗涤并预孵育30 min；再孵育2 h，将上清液收集，-20 ℃环境下保存；之后在16.7 mmol·L-1葡萄糖的KRB中再孵育2 h，收集上清，-20 ℃保存。最后将各组胰岛总蛋白提取出来，测定浓度；ELISA检测上清液中胰岛素含量。
1.2.9 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0、SPSS 24.0统计分析，全部实验数据均使用x±s表示，两组计量资料比较采用student-t检验，多组比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 HSD减少HFHG对MIN6细胞诱导的凋亡HSD处理24 h对MIN6细胞活力影响的结果表明，0-160 μmol·L-1浓度的HSD均不会损害细胞活性(Fig 1A)。不同浓度的HSD预处理4 h后用HFHG处理24 h的实验结果表明当HSD浓度为20-80 μmol·L-1时细胞存活率高于HFHG实验组，选用20、40 μmol·L-1浓度的HSD用于之后的实验(P < 0.05, Fig 1B)。
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| Fig 1 Effects of different concentrations of HSD on MIN6 cell viability and HFHG- induced apoptosis reduced by HSD (x±s, n=4) ##P < 0.01 vs Control group; *P < 0.05 vs HFHG group |
染色后如Fig 2所示，Control组细胞核内染色质分布均匀，20、40 μmol·L-1 HSD预处理4 h+HFHG处理24 h组与单独HFHG组比，细胞核呈致密浓染，细胞减少(如白色箭头所示)。由此可知，HSD预处理后能显著减少HFHG诱导的细胞凋亡。
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| Fig 2 Effects of HFHG treatment for 24 h after HSD pretreatment for 4 h and HFHG treatment for 24 h on nuclear morphology of MIN6 cells (×200) A: Control; B: HFHG; C: 20 μmol·L-1 HSD+HFHG; D: 40 μmol·L-1 HSD+HFHG |
观察20、40 μmol·L-1 HSD预处理4 h + HFHG处理24 h组与单独HFHG处理组对凋亡相关蛋白表达的影响。与Control组相比，HFHG组Bcl-2/Bax比值降低(P < 0.05, Fig 3)，与HFHG组比，HSD预处理后Bcl-2/Bax比值上调(P < 0.01, Fig 3)。
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| 图 3 Effects of HFHG alone and pretreatment with HSD on expression of apoptosis-related proteins (x±s, n=4) #P < 0.05 vs Control; **P < 0.01 vs HFHG |
与Control组相比，HFHG组IL-1β、TNF-α mRNA表达均显著增加，与HFHG组相比，HSD预处理+HFHG组IL-1β mRNA的表达水平有下降趋势，TNF-α mRNA的表达下降(P < 0.05, Fig 4)。
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| Fig 4 Effects of HSD on activities of IL-1β, TNF-α in MIN6 cells treated with HFHG (x±s, n=3) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control group; *P < 0.05 vs HFHG group |
由于MIN6细胞的胰岛素分泌能力较弱，因此提取原代胰岛并进行相同的分组处理后检测胰岛素分泌。结果显示，与Control组相比，高糖刺激下HFHG组胰岛的胰岛素分泌作用减弱，而HSD一定程度上恢复了胰岛素分泌作用(P < 0.05或P < 0.01, Fig 5)。
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| Fig 5 Effects of HSD on glucose-stimulated insulin secretion of islets (x±s, n=3) ##P < 0.01 vs Control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs HFHG group |
糖尿病是一个日益增长的公共卫生问题，不同类型糖尿病病理生理学的一个共同特征是β细胞的凋亡和/或β细胞功能的损害[11]。细胞凋亡信号传导途径主要分为内源性和外源性途径，均与糖尿病发生过程中胰岛β细胞的凋亡有关[12]。内源性途径通过不同类型的细胞应激(如缺氧或氧化应激)激活，其中包括Bcl-2家族的参与[13]。Bcl-2家族分为3类：第一类抑制细胞凋亡，包括Bcl-2等；第二类促进细胞凋亡，包括Bax等；第三类抑制用作细胞应激传感器的抗凋亡蛋白来促进凋亡信号，包括Bad等[14]。外源性途径通过如TNF-α、IL-1β等细胞因子[15-16]与胰岛β细胞表面一些表达凋亡信号的受体结合，激活细胞内信号通路诱导凋亡。β细胞功能的损害主要表现在机体内胰岛素分泌的减少，而恢复β细胞分泌的手段主要包含以下4种：防止其凋亡/功能障碍、促进增殖、改善去分化、诱导细胞转分化为可以分泌胰岛素的β样细胞[11]。
本研究从预防β细胞凋亡、促进其增殖入手，探究HSD对小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞活性的影响。鉴于长期暴露于高水平的葡萄糖和游离脂肪酸会导致β细胞功能障碍，并诱导β细胞凋亡，实验选用高糖高脂培养刺激胰岛β细胞建立β细胞受损的体外模型。结果表明，高糖高脂处理后，MIN6细胞凋亡显著增加，而HSD预处理后细胞凋亡显著减少。同时，HSD预处理后增加了MIN6细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；抑制了促凋亡蛋白Bax，炎症因子TNF-α、IL-1β的表达。最后通过原代胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌试验证明HSD预处理改善了胰岛素分泌功能。
综上所述，高糖高脂环境能够使MIN6细胞活性降低、凋亡增加，胰岛的胰岛素分泌功能障碍，而HSD预处理可增加该环境下Min6细胞活性、抑制其凋亡，改善胰岛的胰岛素分泌功能。因此，HSD预处理对胰岛β细胞的保护作用可能是通过抑制细胞凋亡信号传导途径、改善胰岛素分泌作用来实现的。
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