2. 临床合理用药评价北京市重点实验室，北京 100038;
3. 临床合理用药评价国际合作联合实验室，北京 100038;
4. 中国医学科学院药物研究所，北京 100050
2. Beijing Key Lab of Bio-characteristic Profiling for Evaluation of Rational Drug Use, Beijing 100038, China;
3. International Cooperation & Joint Lab of Bio-characteristic Profiling for Evaluation of Rational Drug Use, Beijing 100038, China;
4. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical College, Beijing 100050, China
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以获得性记忆减退、认知功能障碍等为主要特征的中枢神经系统退行性疾病，记忆力减退，认知功能障碍是AD的重要特征，与脑内学习记忆部位神经元的损伤有关。基于AD主要的特征性病理改变，科学家们提出了许多相关的病理假说，包括著名的β淀粉样蛋白假说、tau蛋白过度磷酸化假说，以及神经元突触丢失等假说，这些假说都与AD密切相关[1-2]。但是，这些假说都是AD发生中后期的病理表现，并不能全面清楚地阐述AD发生的原因和内在机制。近年来，越来越多的证据表明，神经炎症反应在AD发生发展中发挥了重要的作用，神经炎症机制学说逐步被领域内科学家所认可。
自1982年Eikelenboom等[3]首次发现AD病人Aβ斑块中有炎性相关蛋白(补体因子，急性期反应蛋白)以来，人们开始认识到了先天性免疫和炎症反应在AD中的作用。此后的一系列研究显示AD中有多种炎性细胞参与，包括小神经胶质细胞、星形胶质细胞等炎性细胞，尤其是小神经胶质细胞是脑内炎性反应的主要参与者[4]。由于神经炎症机制在AD的发生发展中扮演了重要的角色，抗炎治疗AD成为了一种可能的选择。神经病理学、临床流行病学、以及转基因动物等的研究提示非甾体抗炎药治疗AD具有非常积极的作用[5]，但是，临床治疗研究尚未表现出理想的疗效[6]，NSAIDs的抗AD作用机制还不十分明确。
水杨酸甲酯糖苷(methyl salicylate 2-O-β-D-lactoside，MSL)是来源于传统民族中药滇白珠的天然产物衍生物，我们前期的研究显示其具有明确的抗类风湿关节炎作用，且没有胃肠道副作用，是一种新型的非甾体抗炎药[7-9]。本研究拟基于APP/PS1转基因小鼠AD模型，考察其对学习记忆改善的作用。
1 材料与方法 1.1 药物与试剂MSL由北京协和药厂提供(批号：20110323)，纯度为99.8%。阿司匹林、羧甲基纤维素钠购自美国Sigma公司；多聚甲醛、乙醇等购自北京化工厂；Thioflavin T购自英国Abcam公司。
1.2 仪器灌流仪(LongerPump公司，BT100-1/0602)；水迷宫实验装置(中国医学科学院药物研究所研制)；冰冻切片机(德国徕卡，CM1860)；透射电镜(Hitachi，日本日立公司)；正置荧光显微镜(NIKON ECLIPSE 80i)；光学显微镜(XSZ-HS3普通光学显微镜，重庆光学仪器厂)。
1.3 动物及实验分组APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)双转基因小鼠，野生型C57BL/6小鼠均购自南京大学模式动物研究所，8月龄，体质量(28±2) g，许可证号：SCXK(苏)2010-0001，合格证号：0006903。自由摄食、饮水，室温(2±3) ℃，相对湿度40%-50%，安静，通风干燥，12 h光照周期饲养。将APP/PS1小鼠及同窝野生型小鼠(Wide type，WT)按体重随机分为8个组，分别为WT control，WT MSL 150 mg·kg-1，WT MSL 300 mg·kg-1，WT aspirin 80 mg·kg-1，APP/PS1 control，APP/PS1 MSL 150 mg·kg-1，APP/PS1 MSL 300 mg·kg-1，APP/PS1 aspirin 80 mg·kg-1，n=8。野生型对照组和APP/PS1对照组灌胃给予0.5% CMC-Na，野生型药物对照组和APP/PS1治疗组分别灌胃给予以0.5% CMC-Na溶解的MSL和阿司匹林，每天1次，每周6次，连续给药5个月。
1.4 Morris水迷宫实验Morris水迷宫实验装置由圆形水池，图像自动采集和软件分析系统构成，图像自动采集和软件分析系统主要由摄像机、计算机、图像监视器组成，动物放入水中后启动监测装置，实验完毕自动分析报告结果参数，包括实验动物的运行轨迹，找到平台的时间，游泳速度等。水迷宫直径100 cm，高度35 cm，水池水深约为15.5 cm。水温维持在(23±1) ℃。在其中一个象限放置一个直径为4.5 cm，高度14.5 cm的平台，保证平台在水面之下1 cm。在水池上缘等距离地设东、西、南、北4个标记作为动物入水点，同时依据这4个入水点在水面和水池底部的投影点，将整个装置平均分为4个象限。实验过程中，保持环境安静并且水迷宫周围的物品位置和光源固定不变[10]。
水迷宫实验分为定位航行实验和空间探索实验两部分，定位航行实验用于考察小鼠学习和记忆的获取能力。每只小鼠每天从2个不同象限面向池壁入水，记录搜寻并登上平台所用时间，即潜伏期(s)，如果在60s的时间内小鼠没能找到隐匿平台，则将小鼠引导至平台，并停留30 s，以此类推。同时记录下每只小鼠的游泳速度，如此连续训练5 d即完成定位航行试验。d 6进行空间探索试验，用于考察小鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的保持能力。将水下平台撤掉，每只小鼠自由游泳60 s，记录小鼠在目标区域(前5 d放置水下平台的区域)的停留时间和穿越平台次数。所有数据均用计算机系统自动记录。
1.5 灌流、取材、固定及大脑切片制作小鼠于末次行为学测试后，禁食12 h，不禁水，次日进行脑组织取材。小鼠用干冰麻醉。取仰卧体位，打开小鼠胸腔，充分暴露心脏，自左心室插入钝针头至主动脉，剪开右心耳，快速灌注生理盐水50 mL以冲洗血液，4%多聚甲醛溶液灌注至肝脏发白，全身僵硬为止。快速断头取出全脑，冰浴中分离脑组织，用于冰冻切片的脑组织置于4%多聚甲醛溶液中于4 ℃后固定1 d，换入含30%蔗糖的4%多聚甲醛溶液中。用于石蜡切片的脑组织放入4%多聚甲醛中后固定。制作冰冻切片和石蜡切片。
1.6 尼氏染色冰冻切片置于丙酮中固定30 min，PBS冲洗，3 min×3次。然后，甲苯胺蓝染料中染色20-30 min，水洗15 min。最后，酒精梯度脱水(依次70%、95%、100%)，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察、照相。
1.7 透射电镜(TEM)检测小鼠麻醉后暴露心脏，自左心室灌注0.9%生理盐水，随后灌注4%多聚甲醛。快速断头取出全脑，冰浴中分离皮层和海马，置固定液(2%多聚甲醛-戊二醛)中固定2 h；磷酸缓冲液(pH 7.2)10 min×3次；1%锇酸4 ℃后固定2 h；双蒸水冲洗10 min×3次；梯度乙醇脱水，环氧丙烷置换，纯树脂包埋，聚合；制备超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色。干燥后的切片于电镜下观察，拍照。
1.8 硫磺素T(Thioflavin T)染色荧光染料硫磺素T通过与淀粉样蛋白中β折叠结合，从而标记组织中沉积的纤维样斑块。冰冻切片经PBS清洗后浸入苏木精溶液中染色，再经PBS水洗、1% Thioflavin T溶液染色、PBS清洗，于中性甘油中封片。切片于正置荧光显微镜下观察、拍照，通过Image Pro Plus软件计算荧光强度，以平均荧光强度表示老年斑数量及面积的变化。
1.9 统计学方法数据以x±s表示，水迷宫实验采用SPSS 22软件统计数据，采用重复测量资料的方差分析结合事后分析的方法，其它实验数据均采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 MSL对AD小鼠空间学习能力的影响水迷宫实验用来测试MSL用药小鼠的学习记忆情况，该实验潜伏期数据采用重复测量资料的方差分析。结果显示，在前5 d的定位航行试验中，小鼠逃避潜伏期随训练次数增加而逐渐缩短(P<0.001)，潜伏期的变化因分组的不同而表现出差异(P<0.001)。事后分析不同处理组的比较结果显示，与WT对照组相比，APP/PS1模型组小鼠的潜伏期明显延长，与模型组相比，MSL中高剂量组潜伏期明显缩短，而阿司匹林对潜伏期的影响差异没有显著性，提示MSL对APP/PS1小鼠的学习记忆障碍有一定的改善作用，而阿司匹林对APP/PS1小鼠的学习记忆能力无明显影响(Tab 1)。
| Group | Day 1 | Day 2 | Day 3 | Day 4 | Day 5 |
| WT control | 54.99±3.52 | 41.39±5.09 | 35.94±5.24 | 31.98±3.56 | 23.28±3.47 |
| WT MSL 150 mg·kg-1 | 58.14±1.71 | 44.54±5.06 | 35.47±4.91 | 38.35±5.60 | 26.43±4.07 |
| WT MSL 300 mg·kg-1 | 60.00±0.00 | 46.86±4.94 | 32.43±5.82 | 38.46±5.18 | 27.35±3.23 |
| WT aspirin 80 mg·kg-1 | 60.00±0.00 | 52.87±3.52 | 30.68±5.59 | 31.07±4.14 | 31.18±4.65 |
| APP/PS1 control | 57.47±2.52 | 49.81±2.78 | 52.55±2.69## | 52.31±3.35## | 50.65±3.31## |
| APP/PS1 MSL 150 mg·kg-1 | 60.00±0.00 | 42.46±5.99 | 49.92±3.76 | 45.22±3.57 | 28.48±4.75** |
| APP/PS1 MSL 300 mg·kg-1 | 60.00±0.00 | 46.73±6.51 | 48.66±3.80 | 39.88±5.09* | 25.75±6.84** |
| APP/PS1 aspirin 80 mg·kg-1 | 59.39±0.60 | 52.61±6.23 | 48.55±6.08 | 45.85±7.17 | 47.64±4.83 |
| ##P<0.01 vs normal control group at the same time point; *P<0.05, **P<0.01 vs model group at the same time point. | |||||
此外，口服MSL没有改变野生型小鼠的逃避潜伏期，提示MSL仅能明显提高AD小鼠的学习能力，长期口服同等剂量MSL对正常小鼠学习能力没有影响。
同时评价了MSL对AD小鼠游泳速度的影响，结果显示在前5d定位航行实验中，随着训练天数的变化，各组小鼠的游泳速度趋势相同(P>0.05)，并且各组小鼠之间差异无显著性(P>0.05)，排除了小鼠个体间由于外周神经运动障碍、漂浮等因素所引起的潜伏期差异。
2.2 MSL对AD小鼠空间记忆能力的影响于实验的d 6撤掉平台进行空间探索实验，结果如Fig 1A所示，野生型和用药组能够依靠空间记忆寻找平台，其运动轨迹多位于原平台所在象限，而模型组轨迹没有趋向性，随机分布于各象限。
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| Fig 1 Spatial learning and memory in APP/PS1 mice improved by MSL A: Moving trajectory of APP/PS1 mice on sixth day by Morris water maze test; B: The time spent in target quadrant and number of crossings of APP/PS1 mice in Morris water maze test (x±s, n=8). ##P<0.01 vs WT control group; **P<0.01 vs APP/PS1 model group. |
与野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠在平台象限的停留时间及穿越平台所在位置的次数明显减少。经MSL治疗后，模型小鼠在目标象限停留时间延长(P<0.01)，穿越平台所在位置的次数增加。长期口服等量MSL未改变野生型小鼠的停留时间和穿越次数，提示MSL可提高AD小鼠的空间记忆能力，而对正常小鼠没有影响(Fig 1B)。
2.3 MSL对AD小鼠皮层和海马区神经损伤的影响在皮层组织中，WT对照组神经细胞体积较大，形态规则，尼氏体致密，而APP/PS1模型组神经细胞体积较小，尼氏体稀疏、部分缺失提示神经细胞出现损伤或功能障碍，由此导致尼氏小体溶解、缺失或合成障碍。经MSL 150 mg·kg-1、300 mg·kg-1治疗后，神经细胞形态较为正常，尼氏体染色较为致密，无明显缺失(Fig 2A)。尼氏染色阳性区域平均 光密度统计结果显示，与WT对照组相比，APP/PS1模型组的平均光密度值明显降低(P<0.01)，与APP/PS1模型组比较，MSL 300 mg·kg-1组平均光密度值明显升高(P<0.05)(Fig 2B)。而阿司匹林治疗组在神经细胞形态学和平均光密度值两方面均没有明显改变神经细胞的损伤。此外，口服MSL没有改变野生型小鼠皮层组织尼氏染色阳性区域的平均光密度值。
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| Fig 2 Effect of MSL on neuronal dysfunction in APP/PS1 mice with Nissl staining A: Representative photographs of tissue sections stained with cresyl violet in the cerebral cortex and hippocampus (×200); B: The mean density of positive area in cerebral cortex and hippocampus (x±s, n=3). ##P<0.01 vs WT cortex control group, *P<0.05 vs APP/PS1 cortex model group. |
在海马组织中，APP/PS1模型组神经细胞内尼氏体稀疏，MSL治疗对神经细胞尼氏体缺失的改善不明显(Fig 2A)，与WT比较，尼氏染色阳性区域平均光密度差异无统计学意义(Fig 2B)。口服MSL没有改变野生型小鼠海马组织尼氏染色阳性区域的平均光密度值。
2.4 MSL对AD小鼠皮层和海马区神经毡的影响透射电镜结果显示，WT对照组小鼠皮层和海马组织中神经元胞体较大，胞核呈圆形，核膜清晰，核内染色质分布均匀，胞质内含有丰富的内质网、线粒体等细胞器；神经毡轴索、微管形态正常。APP/PS1模型组小鼠神经毡中出现大量带有核心斑块和变性轴索的老年斑，神经毡内神经细胞与胶质细胞的突起呈现空泡化，轴索密集、变性，老年斑周边的神经元发生不同程度的固缩，胞核皱缩、变形，核染色质聚集，间质水肿。与模型组相比，MSL 150 mg·kg-1、300 mg·kg-1治疗后，APP/PS1小鼠脑内老年斑面积减小，神经毡空泡化减轻，神经毡排列较为紧密，多数神经元得到修复，神经细胞胞核扭曲变形及染色质聚集均得到改善。阿司匹林治疗组对上述神经毡的病变改善作用不明显。口服MSL对野生型小鼠皮层和海马组织神经毡区域未见明显影响(Fig 3)。
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| 图 3 Effects of MSL on neuropil in cerebral cortex and hippocampus with transmission electron microscopy N: neurons; SP: senile plaques (×3 000-7 000). |
硫磺素T染色可以标记APP/PS1小鼠脑组织中Aβ的沉积。在大脑皮层及海马组织中，WT鼠均未检测到明显的老年斑出现。与WT对照组相比，APP/PS1模型组小鼠在皮层和海马组织均呈现大量阳性绿色荧光，提示脑组织中有大量Aβ斑块沉积，即老年斑形成(Fig 4A)。同时，硫磺素T染色阳性区域平均荧光密度统计结果显示，与WT对照组相比，APP/PS1模型组皮层和海马区域的平均荧光密度均明显增大(P<0.01)；与APP/PS1模型组相比，MSL治疗组对皮层Aβ沉积所形成的绿色荧光明显减少，硫磺素T染色阳性区域平均荧光密度明显减小，在海马组织中，老年斑的荧光密度虽有所降低，但差异无统计学意义；阿司匹林治疗对老年斑沉积的改善作用不明显(Fig 4B)。
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| Fig 4 Effects of MSL on Aβ deposition in cerebral cortex and hippocampus with Thioflavin T staining A: Representative photographs of the Thio-T positive plaques in cerebral cortex and hippocampus of APP/PS1 mice. (×200); B: The proportion of Thio-T positive plaque in cerebral cortex and hippocampus (x±s, n=3). ##P<0.01 vs WT cortex control group, **P<0.01 vs cortex APP/PS1 group. |
虽然以记忆力减退和认知功能障碍为特征的AD发病机制还未完全阐明，但神经炎症反应贯穿着疾病发生发展的整个过程，通过抗炎改善AD的症状能否成为可行的治疗措施还需要多方面的深入研究。本研究基于APP/PS1小鼠建立AD模型探讨了来源于天然产物的新型非甾体抗炎药MSL对AD模型鼠学习记忆的影响，发现MSL具有明显的改善AD鼠空间记忆和学习的能力，这种作用可能与保护神经细胞炎症损伤和减少Aβ沉积等有密切关系。
AD病理进展过程中Aβ沉积导致的小胶质细胞活化是神经系统炎症反应重要原因，小胶质细胞的活化诱发了大量前炎性因子的分泌，从而诱发神经元的凋亡，神经元凋亡和突触丢失是AD病人学习记忆减退的主要原因[11-13]。虽然神经炎症反应在AD中的作用已经被广泛认可，但针对脑内神经炎症反应的抗炎治疗改善AD症状还没有确切的定论，所以探索通过抗炎治疗改善AD症状的机制研究和新药发现不失为一种积极的策略。本研究水迷宫实验结果显示，长期口服等量MSL未改变野生型小鼠的逃避潜伏期、停留时间和穿越次数等指标，说明长期口服MSL对正常小鼠的学习记忆能力没有影响。经MSL治疗后，模型小鼠的逃避潜伏期明显缩短，找到平台所用训练次数减少，路线更为理想，其在目标象限停留时间延长，穿越平台所在位置的次数增加，这些指标均提示MSL对APP/PS1小鼠的学习记忆障碍有较好的改善作用。另外，值得注意的是各组小鼠之间的游泳速度没有明显差异，一方面排除了游泳速度可能对潜伏期造成影响，另一方面说明MSL对潜伏期的影响源于MSL对大脑中枢神经系统的直接作用，该作用与改善外周运动神经的传导因素无关。
尽管AD的特征性病变包括区域性细胞缺失、神经元内纤维缠结和细胞外β淀粉样蛋白沉积，但最终决定AD患者认知功能障碍的是神经细胞的数目减少及功能缺失。尼氏体是神经细胞的一种正常结构，分布于胞质和树突，由大量平行排列的粗面内质网和核糖核蛋白体组成，可作为观察神经细胞功能状态的灵敏指标，当神经元损伤或代谢机能发生障碍时，尼氏体即出现形态变化，甚至消失[14]。在本研究中，APP/PS1模型小鼠大脑皮层和海马区域尼氏体着色稀疏、形态模糊、体积较小，呈现不同程度的缺失，提示神经细胞出现损伤或功能障碍。经MSL治疗后，尼氏体着色程度增加，明显提高了尼氏染色的平均光密度值，提示MSL对APP/PS1小鼠神经细胞的功能性损伤具有一定的改善作用。在对神经细胞及神经毡的超微结构检测中，我们观察到了APP/PS1小鼠脑中伴有老年斑沉积的神经退行性变化。口服MSL可使APP/PS1小鼠脑内老年斑面积减小，使神经毡空泡化减轻并紧密排列。此外，上述治疗组中的多数神经元的形态损伤得到了修复，说明MSL既可能从形态学上缓解神经损伤，又可能在代谢机能等方面改善神经功能。此外，由于长期口服同等剂量MSL对野生型对照小鼠没有影响，进一步说明MSL对AD病变小鼠具有防治作用。
Aβ是AD的特征性生物学指标，Aβ沉积也同样是检测AD颅内神经退行性变化的有效窗口，同时Aβ在脑内的沉积也是诱发神经系统炎症反应的重要因素[15]。本研究通过硫磺素T染色及电镜检测特异性观察了APP/PSl小鼠脑组织的Aβ沉积及MSL的作用，证实MSL对APP/PS1小鼠皮层Aβ沉积及老年斑的形成有一定的改善作用。提示MSL可能延缓Aβ沉积，亦或对Aβ的产生过程及代谢通路具有一定缓解作用。然而，海马组织与空间位置的学习有关，是学习记忆的关键区域，但MSL仅在降低皮层Aβ沉积中发挥了较好的作用，而对海马区域的Aβ沉积作用较弱，由此提示，MSL抑制Aβ沉积机制在治疗AD的作用中较为有限，MSL或许只能在局限部位发挥抑制Aβ沉积作用，那么其在APP/PS1小鼠行为学实验中呈现出的学习记忆改善作用，很有可能还有另外机制的参与，而电镜结果中神经元周围大量老年斑的出现及Aβ本身的致炎性提示，我们应该考虑到由其引发的神经炎症损伤及MSL通过抗神经炎症机制发挥神经保护作用的可能性。
综上，通过对AD鼠动物模型的行为学评价，以及脑组织神经元功能性损伤、形态学变化及Aβ沉积等指标的考察，发现来源于天然产物的新型非甾体抗炎药MSL具有明显的改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力，这种作用可能与MSL发挥抗炎作用而保护神经细胞、减少Aβ沉积等有关。
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