近年来，不育已被WHO确认为一个公共卫生问题，在普通人群中的发病率逐年增高。一项调查研究显示，全世界约有15%的成年夫妇患有原发性不育症，其中由男性因素导致的不育约占50%，而其具体成因机制尚不十分清楚^[1]。研究发现，精原细胞损伤所致男性生精功能障碍是导致男性不育的主要原因^[2]。另有研究显示，DNA损伤是导致精原细胞功能受损的主要原因之一^[3-4]。近年来发现射线、活性氧(ROS)、化疗药物等都会导致睾丸生精细胞DNA损伤，从而导致睾丸功能障碍，但其研究主要聚焦在动物水平上，在细胞水平上研究甚少，且目前仍缺乏较好的细胞模型。因此，本研究以小鼠睾丸精原细胞株GC-1细胞为研究对象，采用UVB辐照、D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)、博来霉素(bleomycin，BLM)刺激建立3种GC-1细胞DNA损伤模型并进行比较和评价，以期为防治因DNA损伤所致男性不育提供相应的实验模型。

小鼠精原细胞株GC-1细胞购自上海通派生物细胞库。

D-Gal购于美国Sigma公司，批号：WXBC9497V；BLM购于瀚晖制药有限公司，批号：19012311；ECL显影液购自碧云天生物技术研究所；苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfluoride，PMSF)、RIPA裂解液、磷酸蛋白酶抑制剂购自武汉谷歌生物有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；β-actin(批号：#4970L)、p-p53(批号：#12571)购自美国Cell Signaling Technology公司；γ-H2AX(批号：sc-101696)购自Santa Cruz公司；p21(批号：ab109199)购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的山羊抗鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔二抗购自武汉科瑞科技有限公司。

CKX41型光学倒置显微镜，日本Olympus公司；FORMA series Ⅱ二氧化碳培养箱，美国Thermo公司；SW-4T-2F型超净工作台，上海博讯实业公司医疗设备厂；TD25-WS型台式低速离心机，湖南省湘仪仪器有限公司；Centrifuge 5424 R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Power Pac TM Basic电泳仪，美国Bio-Rad公司；Bioshine Chemic Q 4800化学发光凝胶成像自动显影仪，上海勤翔科学仪器有限公司；A1R+激光共聚焦显微镜，日本Nikon公司。

将GC-1细胞接种于培养皿中培养至细胞密度达80%左右时，使用40 J·m^-2辐照剂量辐照细胞，随后加入新配置的培养基，继续培养细胞0.5、1、2、4和6 h。

前期预实验结果发现，采用不同浓度(0、50、100、150、200和250 mmol·L^-1)D-Gal刺激GC-1细胞不同时间后，DNA损伤修复相关蛋白表达均在150 mmol·L^-1浓度达高峰，因此我们选择150 mmol·L^-1 D-Gal浓度刺激GC-1细胞0、1、3、6、12、24h来进一步建立DNA损伤模型。

不同浓度(2.5、5、10、25和50 mg·L^-1)BLM刺激GC-1细胞0.5、1、2、4和6 h后收集细胞。

收集上述不同处理组细胞，提取总蛋白，定量，蛋白水浴变性，将蛋白样品进行电泳并转印至PVDF膜，脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入兔抗γ-H2AX抗体(1 :1 000)、兔抗P-P53抗体(1 :2 000)、兔抗P21抗体(1 :1 000)和兔抗β-actin抗体(1 :5 000)，4 ℃冰箱摇床孵育过夜；次日，TBST洗膜，加HRP标记的山羊抗兔二抗(1 :3 000)，室温孵育1 h；TBST洗膜。ECL化学发光于凝胶成像系统中显影成像。

将无菌圆形盖玻片放入24孔板中，将GC-1细胞悬液接种到无菌玻片上，按照“1.2.1”、“1.2.2”、“1.2.3”项下处理细胞后弃掉上清，PBS洗涤细胞20 min后，4%多聚甲醛固定细胞30 min后PBS洗涤20 min。后经0.1% Triton X-100打孔15 min，PBS洗涤细胞20 min。1% BSA于温度为25 ℃下封闭1 h，弃掉封闭液后，置于4 ℃冰箱孵育一抗。一抗孵育完成后，25 ℃复温30 min以上，PBS洗涤细胞20 min。37 ℃下避光孵育荧光二抗1 h，PBS洗涤细胞后，避光孵育DAPI(0.5 mg·L^-1)5 min，PBS洗涤后封片，共聚焦显微镜下观察并拍照取图。

实验数据均采用GraphPad Prism 7.0、Image pro plus 6.0进行统计学分析，数据以x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

Fig 1 Effect of 40 J/m2UVB irradiation on expression of γ-H2AX protein in GC-1 cells(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group

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Fig 2 Effect of 150 mmol·L-1 D-Gal treatment on expression of γ-H2AX protein in GC-1 cells(x±s, n=3) **P < 0.01 vs Control group

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Fig 3 Effects of different concentrations of BLM on expression of γ-H2AX protein in GC-1 cells

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Fig 4 Effects of different treatment factors on expression and localization of γ-H2AX protein in GC-1 cells (× 400) A: The effect of UVB irradiation on the expression and localization of γ-H2AX protein in GC-1 cells; B: The effect of D-Gal treatment on the expression and localization of γ-H2AX protein in GC-1 cells; C: The effect of BLM stimulation on the expression and localization of γ-H2AX protein in GC-1 cells.

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Western blot结果显示，UVB辐照后，γ-H2AX蛋白表达水平在4 h达到高峰，随后开始下降；D-Gal处理GC-1细胞不同时间后，γ-H2AX蛋白表达水平在6 h达到高峰，随后开始明显下降；不同浓度BLM刺激GC-1细胞不同时间后，当BLM浓度在2.5~10 mg·L^-1范围时，γ-H2AX蛋白表达水平逐渐升高，提示DNA损伤不断加重，当BLM浓度在25~50 mg·L^-1范围时，γ-H2AX蛋白表达水平在2 h达到峰值，4 h开始下降，提示此时GC-1细胞损伤严重，细胞可能开始凋亡。

为进一步观察不同处理因素对GC-1细胞DNA损伤的影响，我们采用免疫荧光法观察GC-1细胞γ-H2AX表达和定位。UVB辐照后，γ-H2AX荧光强度在4 h最强，随后减弱；150 mmol·L^-1 D-Gal处理GC-1细胞后，γ-H2AX荧光强度在6 h最强，随后开始减弱，24 h后荧光强度已接近正常水平；10 mg·L^-1 BLM刺激GC-1细胞不同时间后，γ-H2AX荧光强度持续增强。免疫荧光结果均与Western blot结果一致。

Fig 5 Effects of different treatment factors onexpression and localization of 8-OHdG in GC-1 cells (× 400) A: The effect of UVB irradiation on the expression and location of 8-OHdG in GC-1 cells; B: The effect of D-Gal treatment on the expression and location of 8-OHdG in GC-1 cells; C: The effect of BLM stimulation on the expression and location of 8-OHdG in GC-1 cells.

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免疫荧光结果显示，在未处理的GC-1细胞中未检测到荧光，UVB辐照和BLM刺激后，8-OHdG在胞核和胞质内均有表达，且随着处理时间延长，GC-1细胞核内表达逐渐增多，提示GC-1细胞氧化性DNA损伤不断加重，DNA修复酶来不及切割8-OHdG，导致愈来愈多的8-OHdG蓄积在细胞核内；D-Gal处理后，8-OHdG主要表达在胞质，在6 h达到高峰，随后开始下降。

Fig 6 Effect of UVB irradiation on expression of p-p53 and p21 protein in GC-1 cells(x±s, n=3) **P < 0.01 vs Control group

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Fig 7 Effect of 150 mmol·L-1 D-Gal treatment on expression of p-p53 and p21 protein in GC-1 cells(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group

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Western blot结果显示，UVB辐照后，p-p53和p21蛋白表达水平逐渐升高，p-p53蛋白表达水平2 h后开始明显升高，p21在6 h开始明显升高；150 mmol·L^-1 D-Gal处理GC-1细胞不同时间后，p-p53蛋白表达水平在6 h达到高峰，p21蛋白表达水平在6 h开始明显增加，12 h达到高峰，24 h后p-p53和p21蛋白表达水平均下降；浓度为2.5、5、10 mg·L^-1的BLM处理GC-1细胞不同时间后，p-p53和p21蛋白表达水平均逐渐升高，且趋势一致，而25和50mg·L^-1浓度的BLM处理GC-1细胞不同时间后，p-p53和p21蛋白表达水平均在2 h达到峰值，4 h后p-p53表达量开始下降，p21蛋白几乎无表达。

Fig 8 Effects of different concentrations of BLM on expression of p-p53 and p21 protein in GC-1 cells A: The effect of treatment with different concentrations of BLM on the expression of p-p53 protein in GC-1 cells; B: The effect of different concentrations of BLM on the expression of p21 protein in GC-1 cells.

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现有研究发现，不育症可由多种因素引起，如DNA损伤、职业和环境、遗传、下丘脑-垂体功能紊乱等^[5-6]。射线、ROS、化疗药等都会导致睾丸生精细胞DNA损伤，从而导致睾丸功能障碍，降低男性生育力。紫外线辐照是最重要的DNA损害剂之一，特别是UVA和UVB，不仅可以被DNA直接吸收导致损伤，而且还可以被皮肤细胞中存在的生色团吸收。这一过程可导致ROS形成，从而间接造成DNA损伤^[7]。D-Gal是一种生理性营养成分，在正常机体代谢中可转变为葡萄糖，参与葡萄糖代谢，但过量的D-Gal可导致细胞内代谢紊乱，使组织和细胞中氧化酶活性改变，产生一些氧化产物如ROS，导致生物大分子结构和功能的氧化损伤^[8]。BLM是一种具有抗癌和其他临床应用的氧化还原活性药物，主要用于治疗睾丸癌、阴茎鳞癌等，也经常用作工具药，其作用机制主要是直接嵌入DNA的G-C碱基对中，还可以与DNA磷酸基相互作用，使其解链，而后导致氧自由基和羟自由基生成，引起DNA链断裂^[9]。因UVB、D-Gal和BLM 3种因素导致DNA损伤的作用机理不同，其导致细胞DNA损伤的表现，损伤后修复的机制是否有差异尚有待探究。

研究发现，当细胞发生DNA损伤时，组蛋白H2AX Ser139位点被磷酸化为γ-H2AX并募集到损伤处，在细胞核中形成焦点，是DNA双链断裂早期的一个关键标记物^[10-11]。因此，我们采用Western blot和免疫荧光法检测3种处理方式对GC-1细胞γ-H2AX蛋白表达和定位的影响。Western blot结果显示，UVB辐照后，GC-1细胞γ-H2AX蛋白表达在4 h达到高峰，D-Gal处理后GC-1细胞γ-H2AX蛋白表达在6 h达高峰，与免疫荧光结果一致。不同浓度BLM处理后γ-H2AX蛋白表达随时间延长持续升高，且BLM浓度越高，γ-H2AX蛋白表达达到高峰时间越短。随后，我们选取10 μg·L^-1 BLM不同时间刺激GC-1细胞，免疫荧光法检测γ-H2AX表达和定位，结果显示，10 mg·L^-1 BLM刺激后γ-H2AX表达持续上升，与Western blot结果一致。以上结果提示，3种处理方式对GC-1细胞DNA损伤程度不同，D-Gal处理后，GC-1细胞DNA损伤达到高峰的时间最长，提示DNA损伤较轻，而UVB辐照和BLM刺激后GC-1细胞DNA损伤较重。

当细胞DNA鸟嘌呤碱基受到ROS的攻击，其第8位碳原子会额外增加1个羟基，从而直接形成1个经过氧化修饰的产物8-OHdG，而后8-OHdG会被DNA修复系统中的糖基化酶识别并切除，之后被运出胞外，此，8-OHdG被认为是氧化性DNA损伤的标记物之一^[12]。本实验采用免疫荧光法观察3种不同处理因素对GC-1细胞8-OHdG表达和定位的影响。结果显示，在未处理的GC-1细胞中未检测到荧光，UVB辐照和BLM刺激后，8-OHdG在胞核和胞浆内均有表达，且随着处理时间延长，核内表达逐渐增多，可能是GC-1细胞DNA损伤不断加重，DNA修复酶来不及切割8-OHdG，导致大量8-OHdG被蓄积在细胞核内；而D-Gal处理后，8-OHdG主要表达在胞质，在6 h达到高峰，随后开始下降，提示DNA氧化损伤开始减轻，DNA损伤修复启动。以上结果表明，相比于D-Gal处理组，UVB辐照和BLM处理组GC-1细胞DNA氧化损伤较重。

DNA损伤后，可激活细胞内DNA损伤应答反应，招募一系列损伤应答蛋白到损伤位点，介导细胞周期阻滞进而修复损伤的DNA或诱导凋亡清除无法修复的细胞，维持基因组稳定性^[13]。当细胞发生DNA损伤时可激活p53，在DNA损伤较轻时活化的p53可以激活p21，引起细胞周期停滞，避免受损的DNA进行复制后在细胞内累积，而在DNA损伤较重时，活化的p53可直接诱导细胞凋亡^[14-15]。研究发现^[16]，阿霉素可导致糖尿病性β细胞DNA损伤，γ-H2AX、53BP1及p21蛋白表达水平明显增加，而给予p21抑制剂后，细胞凋亡率明显增加。本研究结果显示，UVB辐照后，GC-1细胞p-p53蛋白表达水平2 h后开始上升，6 h后p21蛋白表达水平开始明显上升。其原因可能是UVB辐照GC-1细胞后细胞周期阻滞较滞后，而具体机制尚有待探究。D-Gal处理GC-1细胞不同时间后，p-p53蛋白表达水平在6 h达到高峰，p21蛋白表达水平在12 h达到高峰，24 h后p-p53、p21和γ-H2AX蛋白表达水平均接近正常对照组，此时8-OHdG表达量也相对较低，提示部分损伤的GC-1细胞可能已经被修复，而损伤较重的细胞则可能发生了凋亡。2.5、5、10 mg·L^-1BLM处理GC-1细胞不同时间后，p-p53和p21蛋白表达水平均在2 h开始上升，趋势保持一致，其原因可能是BLM处理后，损伤细胞较多，p-p53直接激活p21，使细胞周期阻滞，为DNA损伤修复争取时间。25、50 mg·L^-1 BLM处理GC-1细胞不同时间后，p-p53和p21蛋白表达水平在2 h达到高峰，4 h后p-p53表达量开始下降，p21蛋白几乎无表达，其原因可能是高浓度BLM处理GC-1细胞4 h后，细胞DNA损伤较为严重而导致无法修复，p-p53直接诱导了细胞凋亡。

综上所述，因3种处理方式导致GC-1细胞DNA损伤机理不同，对GC-1细胞DNA损伤的程度也就存在差异，UVB辐照和BLM处理对GC-1细胞DNA损伤更重。此外，DNA损伤修复的机制亦存在一定的差异，UVB辐照和D-Gal处理后，GC-1细胞周期阻滞较滞后，而BLM处理后，GC-1细胞DNA损伤修复与周期阻滞同步进行。因此，在后续实验中，研究者可根据不同的实验目的来选择不同的DNA损伤模型。本研究旨在为后续在细胞水平上研究DNA损伤所致的男性不育及其分子机制奠定一定的实验基础，为后期研究男性不育的防治提供一定的实验依据。