肝脏是机体重要的新陈代谢和解毒器官，容易被一些化学物质如酒精、四氯化碳和对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)损伤[1]。APAP是一种广泛使用的解热镇痛药；但是，已有大量的报道过量摄入是急性肝功能衰竭的主要原因，甚至可能导致死亡[2-3]。人们普遍认为，对乙酰氨基酚可被肝细胞色素酶P450(cytochrome P450，CYP450)代谢为N-乙酰基-对苯醌亚胺(N-Acetyl-P-Benzoquinon Imine，NAPQI)，后者可以与谷胱甘肽(glutathione，GSH)结合，形成APAP-谷胱甘肽、APAP-半胱氨酸和APAP-N-乙酰半胱氨酸来解毒。但是，过量的NAQPI会使细胞内GSH耗竭，剩余的NAPQI可以共价结合细胞生物大分子形成NAQPI蛋白质加物，扰乱细胞内氧化还原平衡，从而导致氧化应激反应，线粒体功能障碍和细胞核DNA断裂，最终导致肝细胞坏死和肝损伤[4-5]。目前，临床对药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)的诊断仍有很多不足，传统检测指标如谷氨酸转氨酶(glutamate aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)等存在敏感性低、特异性差的特点，尚未找到理想的DILI生物标志物。最新版《药物性肝损伤诊治指南》(2015年版)指出，新生物标志物在DILI诊断中的贡献还有待进一步研究[6]。
代谢组学由Nicholson等[7]于1999年首次提出。它是运用高通量仪器，对机体内分子质量小于1 000的代谢物质进行定性定量分析，旨在寻找与生理病理存在规律的特异性分子标志物，适用于研究代谢性疾病的发病机制及治疗药物的作用机制[8]。根据研究发现[9]，APAP肝毒性剂量(2.5 g·kg-1)给大鼠口服后48 h，从大鼠肝肾组织的病理切片观察，产生了明显的肝损伤；肝肾组织的活性氧(reactive oxygen species)、一氧化氮(nitric oxide)和丙二醛(malondiadehyde)含量增加和GSH含量以及血清的多项生化指标与空白组相比也产生了显著的差异，说明肝损伤后大鼠机体代谢系统发生了紊乱。因此，本实验在该文献的基础上首次采用液相色谱-高分辨质谱技术(UPLC-Q-Orbitrap-MS)结合多变量数据统计分析方法，探讨大鼠口服对APAP后不同时间段血清中内源性代谢物的变化及可能的通路分析，为临床诊断和用药安全提供依据。
1 材料 1.1 药品与试剂对乙酰氨基酚(Sigma-Aldrich中国，批号099K0127)；2-氯苯丙氨酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号D1404053)，乙腈为色谱纯(美国Honeywell公司，批号K3021728)；甲醇(批号20181113)、甲酸(批号3208K240)(均为色谱纯，德国CNW公司)。
1.2 仪器FA2004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，Thermo液相色谱-质谱仪(UPLC-Q-Orbitrap-MS)；TARGINTMVX-Ⅱ多管涡旋振荡器(北京踏锦科技有限公司)；1730R离心机(基因有限公司)；SK8200LHC超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；TBA-40FR生化分析仪(日本东芝公司)。
1.3 实验动物SPF级Wistar大鼠，♂，24只，体质量(180±20)g，由上海中医药大学实验动物中心提供，置于动物饲养笼中，保持室内温度(18~22) ℃，室内昼夜自然明暗交替照明，饲养标准大鼠饲料。动物许可证号：SCXK(沪)2017-0005，伦理审查编号：PZSHUTCM190315013。
2 方法 2.1 大鼠分组及给药健康雄性Wistar大鼠24只，适应性饲养1周后，随机分为4组，即正常对照组和APAP低(1 g·kg-1)、中(2 g·kg-1)、高(3 g·kg-1)剂量组，每组6只。正常对照组口服0.5% CMC-Na溶液，APAP组口服相应剂量0.5% CMC-Na溶液配制的200 g·L-1 APAP溶液。给药前一晚大鼠禁食不禁水；饲养过程中保持温度、光照、湿度等环境条件均衡，自由进食饮水。灌胃后分别于6、24、48 h颈静脉取血；全血于5 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，取血清置于4 ℃冰箱备用。在48 h取完血后，取大鼠肝脏，分出肝大叶，立即用福尔马林固定。
2.2 生化指标的测定取50 μL血清，于全自动生化分析仪上测定AST和ALT值。
2.3 肝组织病理学检测取用福尔马林固定的肝大叶，HE染色，光镜下观察肝细胞形态。
2.4 代谢组学 2.4.1 血清样品制备取解冻后血清样品50 μL，加入200 μL甲醇和5 μL 2-氯苯丙氨酸(5 g·L-1)，振摇1 min，于4 ℃离心机中以12 000 r·min-1离心10 min，吸取100 μL上清，转入进样小瓶中待检测。同时，各组取等量样品混合，制备质控样品。
2.4.2 LC-MS分析条件① 色谱条件色谱柱：[Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm]；流速0.3 mL·min-1；柱温为40 ℃；流动相组成为A：纯水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脱程序见Tab 1；体积流量0.3 mL·min-1；进样量4 μL。②质谱条件:静电场轨道离子阱，ESI离子源，正离子模式为加热器温度300 ℃；鞘气体积流量45 arb；辅助气体积流量15 arb；尾气体积流量1 arb；电喷雾电压3.0 kV；毛细管加热温度350 ℃；负离子模式为加热器温度300 ℃；鞘气体积流量45 arb；辅助气体积流量15 arb；尾气体积流量1 arb；电喷雾电压3.2 kV；毛细管加热温度350 ℃。鞘气和辅助气均为氮气，扫描范围m/z：50~1 000。
| t/min | flow rate/mL·min-1 | A/% | B/% |
| 0 | 0.3 | 95 | 5 |
| 2 | 0.3 | 95 | 5 |
| 12 | 0.3 | 5 | 95 |
| 15 | 0.3 | 5 | 95 |
| 17 | 0.3 | 95 | 5 |
通过SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，将LC-MS所得原始质谱数据导入Compound Discover2.1软件(美国Thermo公司)进行提取和预处理，再导入Excel软件中进行归一化，整理成二维数据矩阵形式，通过SIMCA14.0软件进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，根据OPLS-DA模型所得的VIP值和t检验所得的P值(P＜0.05)为标准，找出中剂量组3个时间点的交集差异性代谢物；在HMDB、KEGG等数据库对此差异性代谢物进行结构鉴定，找到相应的代谢通路，探讨潜在生物标志物的生物学意义。
3 结果 3.1 APAP对ALT、AST水平的影响ALT和AST水平反映了大鼠肝细胞的损伤程度；与正常对照组相比，在6 h，给药组大鼠血清ALT、AST无显著变化；在24 h，中、高剂量组大鼠血清ALT和AST水平明显升高(P＜0.01)；在48 h，低、中、高剂量组大鼠血清ALT和AST水平均明显升高(P＜0.05，P＜0.01)，见Fig 1。
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| Fig 1 Rat serum ALT, AST detection *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
如Fig 2所示，正常对照组大鼠肝细胞正常，低剂量组大鼠肝组织出现少许空泡状肝细胞，细胞间隙扩大；中、高剂量组大鼠肝细胞严重坏死，有大量炎细胞浸润；损伤程度均较低剂量组的严重，且高剂量组的大鼠肝组织损伤程度比中剂量组更严重。
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| Fig 2 HE staining results of rat liver tissues(HE×200) |
在正模式(ESI+)及负模式(ESI-)下对大鼠血清样本进行PCA分析，从Fig 3可以看出，正常对照组、给药组和质控的血清样品能明显分开。可知给药组大鼠与正常大鼠之间的差异可以通过代谢谱有效地辨别。
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| Fig 3 PCA results of APAP(2 g·kg-1)serum metabolomics Positive:A:6 h, B:24 h, C: 48 h; negative: D: 6 h, E; 24 h, F: 48 h |
OPLS-DA分析在正模式(ESI+)及负模式(ESI-)下对大鼠血清样本进行OPLS-DA分析，正常对照组、给药组的血清样品分离，在正离子模式下，6 h的R2X、R2Y、Q2分别为0.619、0.995、0.876，24 h的分别为0.633、0.998、0.657，48 h的分别为0.728、0.999、0.901；在负离子模式下，6 h的R2X、R2Y、Q2分别为0.655、0.998、0.714，24 h的分别为0.644、0.997、0.781，48 h的分别为0.765、0.999、0.902，见Fig 4。结果显示，所建立的模型有效，模式质量良好，可用于后续的组间差异成分的寻找与分析。
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| Fig 4 OPLS results of APAP(2 g·kg-1)serum metabolomics Positive:A:6 h, B:24 h, C:48 h; negative:D:6 h, E:24 h, F:48 h |
通过OPLS-DA分析，可以找到变量权重(VIP)＞1以及P＜0.05的差异性代谢物，经HMDB、KEGG等谱库检索筛选，本实验共找出了45个差异性代谢物，正模式下鉴定出33个，负模式下共鉴定出12个(与正模式下鉴定出的相同物质删去不表)，结果见Tab 2、Tab 3。将主要产物大致归类为：磷脂类(LysoPC(22:4(7Z, 10Z, 13Z, 16Z))、LysoPC(14:0)、LysoPE(0:0/16:0)等)，鞘脂代谢产物(鞘氨醇：sphinganine)，胆酸(牛磺胆酸：taurocholic acid；3a，7a-二羟基胆酸：3a, 7a-dihydroxycholanoic acid)、嘧啶类(尿嘧啶：uracil)、不饱和脂肪酸类(二十碳五烯酸：eicosapentanoic acid)、花生四烯酸产物(N-花生四烯酸甘氨酸：N-arachidonoyl glycine)、糖代谢产物(对乙酰氨基酚葡萄糖醛酸：acetaminophen glucuronide)，等。
| tR/min | M/Z | Chemical formula | Metabolite name | APAP |
| 1.677 | 153.042 57 | C7H7NO3 | Mesalazine | ↑ |
| 2.698 | 292.049 51 | C9H8N8O2S | Chlorosesamone | ↑ |
| 6.993 | 397.319 19 | C24H39N5 | Trans-Hexadec-2-enoyl carnitine | ↑ |
| 5.342 | 316.203 68 | C20H28O3 | 2-Methoxyestradiol-3-methylether | ↑ |
| 6.333 | 369.287 98 | C21H39NO4 | Trans-2-Tetradecenoylcarnitine | ↑ |
| 8.49 | 569.347 9 | C30H52NO7P | LysoPC(22:5(7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)) | ↑ |
| 4.087 | 270.052 8 | C9H11N4O4P | 5, 6, 7-trihydroxy-3-phenyl-4H-chromen-4-one | ↑ |
| 7.147 | 467.301 11 | C23H42N5O3P | LysoPC(14:0) | ↑ |
| 6.618 | 281.271 89 | C18H35NO | Oleamide | ↑ |
| 6.819 | 301.298 17 | C18H39NO2 | Sphinganine | ↑ |
| 6.618 | 299.282 54 | C18H37NO2 | Palmitoylethanolamide | ↑ |
| 7.177 | 414.204 26 | C24H30O6 | 4-O-Methylmelleolide | ↓ |
| 3.953 | 179.058 28 | C9H9NO3 | Hippuric acid | ↓ |
| 10.151 | 571.361 07 | C26H60N3O2P3S | LysoPC(22:4(7Z, 10Z, 13Z, 16Z)) | ↓ |
| 3.63 | 129.057 82 | C9H7N | 3-Methylene-indolenine | ↓ |
| 10.964 | 328.240 53 | C22H32O2 | Retinyl acetate | ↑ |
| 11.426 | 262.229 72 | C18H30O | 6, 10, 14-Trimethyl-5, 9, 13-pentadecatrien-2-one | ↑ |
| 10.441 | 378.277 14 | C23H38O4 | 2-arachidonoylglycerol | ↑ |
| 0.959 | 159.125 96 | C8H17NO2 | L-2-Aminooctanoic acid | ↓ |
| 0.936 | 243.085 55 | C9H13N3O5 | Cytidine | ↑ |
| 9.261 | 340.297 46 | C21H40O3 | Polyoxyethylene(600) monoricinoleate | ↑ |
| 8.219 | 453.285 54 | C21H44NO7P | LysoPE(0:0/16:0) | ↑ |
| 4.981 | 189.079 03 | C11H11NO2 | Indole-3-propionic acid | ↓ |
| 2.143 | 327.095 46 | C14H17NO8 | Acetaminophen glucuronide | ↑ |
| 7.805 | 477.285 55 | C24H40N5O3P | LysoPE(0:0/18:2(9Z, 12Z)) | ↑ |
| 9.569 | 330.256 13 | C22H34O2 | Ethyl abietate | ↑ |
| 3.303 | 231.020 08 | C8H9NO5S | Paracetamol sulfate | ↑ |
| 8.697 | 326.224 54 | C16H31N4OP | 15beta-Hydroxydesogestrel | ↑ |
| 0.871 | 136.063 57 | C7H8N2O | N-Methylnicotinamide | ↓ |
| 1.329 | 112.027 09 | C4H4N2O2 | Uracil | ↑ |
| 8.806 | 604.449 19 | C40H60O4 | Cycloartanyl ferulate | ↑ |
| 8.809 | 302.224 49 | C20H30O2 | Eicosapentanoic acid | ↑ |
| 1.982 | 152.033 34 | C5H4N4O2 | Xanthine | ↑ |
| tR/min | M/Z | Chemical formula | Metabolite name | APAP |
| 3.57 | 261.030 08 | C9H11NO6S | 2-methoxyacetaminophen sulfate | ↑ |
| 7.582 | 392.291 26 | C24H40O4 | 3a, 7a-Dihydroxycholanoic acid | ↓ |
| 4.761 | 202.029 53 | C8H10O4S | 4-Ethylphenylsulfate | ↓ |
| 5.341 | 334.213 27 | C16H26N6O2 | 7′-Carboxy-gamma-chromanol | ↑ |
| 11.435 | 280.239 42 | C18H32O2 | Dihomolinoleic acid | ↑ |
| 4.768 | 187.062 95 | C11H9NO2 | Indoleacrylic acid | ↓ |
| 3.864 | 309.083 75 | C14H15NO7 | Indoxyl glucuronide | ↑ |
| 3.983 | 213.009 09 | C8H7NO4S | Indoxyl sulfate | ↓ |
| 7.388 | 240.172 | C14H24O3 | L-Menthyl acetoacetate | ↑ |
| 0.971 | 289.126 4 | C11H19N3O6 | Ophthalmic acid | ↑ |
| 3.758 | 189.993 2 | C6H6O5S | Pyrocatechol sulfate | ↓ |
| 5.165 | 515.289 9 | C24H38N9O2P | Taurocholic acid | ↑ |
热图是数据的一种二维呈现，可以更加清晰地表示代谢物的组间差异，因此将上述化合物构建热图，见Fig 5。其中发现，服用APAP后上调的差异物有Sph、TCA、LysoPC(14:0)、LysoPE(0:0/18:2(9Z, 12Z))等；下调的差异物有LysoPC(22:4(7Z, 10Z, 13Z, 16Z))、3a，7a-二羟基胆酸、硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate)等。
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| Fig 5 Thermographic analysis of potential biomarkers Normal group(Control 1~Control 6), middle group 6 h(M 6h.1~M 6h.6), middle group 24h(M 24h.1~M 24h.6), middle group 48 h(M 48h.1~M 48h.6) |
将Tab 2、Tab 3中的差异代谢物通过Metabo Analyst进行通路分析得知，对乙酰氨基酚致肝损伤的作用机制可能与嘧啶代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、嘌呤代谢、泛酸和CoA生物合成及初级胆汁酸的生物合成等11条代谢通路有关，见Tab 4、Fig 6。结合KEGG通路分析发现，甘油磷脂代谢、鞘脂代谢，以及初级胆汁酸的生物合成可能是其主要相关代谢通路。
| No. | Metabolism pathway | P | -log(P) | Impact |
| a | Pyrimidine metabolism | 5.31×10-2 | 2.935 7 | 4.89×10-2 |
| b | Taurine and hypotaurine metabolism | 7.20×10-2 | 2.631 2 | 0.00 |
| c | Pentose and glucuronate interconversions | 1.23×10-1 | 2.097 1 | 2.73×10-1 |
| d | Pantothenate and CoA biosynthesis | 1.31×10-1 | 2.032 4 | 0.00 |
| e | Beta-Alanine metabolism | 1.63×10-1 | 1.812 9 | 0.00 |
| f | Sphingolipid metabolism | 1.79×10-1 | 1.721 2 | 1.43×10-1 |
| g | Starch and sucrose metabolism | 1.94×10-1 | 1.638 7 | 3.78×10-2 |
| h | Glycerophospholipid metabolism | 2.46×10-1 | 1.402 3 | 4.44×10-2 |
| i | Biosynthesis of unsaturated fatty acids | 3.28×10-1 | 1.115 5 | 0.00 |
| j | Primary bile acid biosynthesis | 3.53×10-1 | 1.041 | 2.97×10-2 |
| k | Purine metabolism | 4.78×10-1 | 0.739 13 | 3.29×10-2 |
| Match status: the number of identified metabolites/the total number of metabolites in the pathway; P: the raw P value obtained by pathway analysis; Impact: the pathway impact value obtained by topological analysis. | ||||
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| Fig 6 Metabolic pathway of serum samples |
APAP是临床上广为使用的解热镇痛药，但是过量服用会超过机体代谢和排毒的能力，经肝脏代谢后生成的毒性中间产物NAPQI不能及时被谷胱甘肽结合而清除排出体内，从而导致中间产物与肝组织内的蛋白质结合，引起肝细胞坏死，出现血清ALT与AST的急剧升高。血清中ALT和AST含量的升高是肝损伤的特异性标志，可反映细胞损伤和坏死程度[10]。本实验结果表明，3个剂量组大鼠最终血清的ALT与AST水平均明显高于正常对照组，且中、高剂量组于24 h差异就产生显著性；病理组织学显示，随着APAP剂量的递增，炎性细胞浸润增多，结构损伤加重。说明服用过量的APAP可能于24 h开始产生肝毒性，剂量越大肝损伤的程度越严重。
本实验首次采用UPLC-Q-Orbitrap-MS结合多变量数据统计分析方法，探讨大鼠口服APAP后不同时间段血清中内源性代谢物的变化及可能的通路分析；结果表明其可能主要与甘油磷脂代谢、鞘脂代谢，以及初级胆汁酸的生物合成等代谢通路有关。
甘油磷脂代谢：从Tab 2可知，甘油磷脂是肝损伤大鼠血清中主要的生物标记物，包括LPCs、LPEs等；亦是生物体内含有量最丰富、种类最复杂的磷脂之一，是肝细胞以及线粒体膜的重要组成部分[11]。甘油磷脂在磷脂酶的作用下催化降解生成LPC，甘油磷脂还可以通过影响体内药物代谢的酶，如药物Ⅱ相代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase)、药物Ⅰ相代谢酶CYP450等，从而影响药物的代谢及加重代谢紊乱，并且会导致肝脏疾病；LPC可促进炎症反应，并且与许多疾病的发生有关；LPC亦具有细胞毒性，使细胞结构和功能异常[12]。本实验发现，大鼠口服APAP后体内LysoPC(14:0)、LysoPE(0:0/16:0)、LysoPE(0:0/18:2(9Z, 12Z))、LysoPC(22:5(7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z))、LysoPC(22:4(7Z, 10Z, 13Z, 16Z))含量升高；且PE可与PC相互转化，PE与细胞生长、增殖和分化密切相关，是细胞凋亡的诱因[13]，由此可知，可能是APAP导致了甘油磷脂代谢紊乱，产生了有毒的代谢产物，导致肝细胞结构破坏和细胞凋亡，引起了肝损伤。
鞘脂代谢:鞘脂(sphingolipids，SPL)的代谢较为复杂，其中神经酰胺(ceramide，Cer)处于鞘脂代谢网络中的核心位置；SPL是一类以鞘氨醇(sphingsine, Sph)为骨架的较复杂的化合物，Sph在体内生成的唯一途径是神经酰胺在神经酰胺酶(ceramidase)的作用下去乙酰化而产生的[14]。有文献报道，神经酰胺可以引起细胞内GSH的耗竭及线粒体去极化，从而诱导肝细胞氧化应激损伤[15]。本实验研究结果显示，大鼠口服APAP后Sph的含量升高，而Sph只能通过Cer转化产生，由此可推测，APAP可能引起鞘脂代谢紊乱，从而导致肝损伤。且有文献报道[16]，在多种肝脏疾病如酒精性肝病、肝脏缺血/再灌注损伤、脂肪性肝病等中，其体内的Cer和Sph含量均有明显的变化。尽管有些神经酰胺和鞘氨醇的作用机制还有待研究，但在一定程度上可作为肝损伤的生物标记物。
初级胆汁酸的生物合成：肝脏在胆汁酸代谢中占重要地位，与胆汁酸的合成、分泌、转化等具有密切关系，胆汁酸的变化亦被认为是肝损伤的代谢组学标志物[17]。初级胆汁酸是肝细胞以胆固醇为原料直接合成的，其从肝内被分泌出来后进入肠腔，在一些酶和细菌的代谢下成为次级胆汁酸[18]。本次研究结果所得，大鼠口服APAP后牛磺胆酸(Taurocholic acid，TCA)的含量升高，3a, 7a-Dihydroxycholanoic acid(亦称鹅去氧胆酸)的含量下降；据文献报道[13]，TCA为疏水性胆汁酸，可通过与体内甘氨酸及牛磺酸结合产生，其含量升高可引起肝内胆汁淤积，导致肝内胆汁酸代谢紊乱，进而产生肝毒性。
综上所述，本实验在前期研究基础上探讨了低、中、高3个剂量的APAP分别在6、24、48 h对大鼠肝脏造成的影响；首次采用液相色谱-高分辨质谱技术(UPLC-Q-Orbitrap-MS)结合多变量数据统计分析方法进行代谢差异物及通路分析，结果显示，APAP致肝毒性代谢通路可能与甘油磷脂代谢、鞘脂代谢，以及初级胆汁酸的生物合成等代谢通路紊乱有关，为后期深入研究APAP致肝毒性的作用机制及治疗药物的开发提供一定的依据。
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