2. 安徽医科大学 药学院肝病研究所，安徽 合肥 230032;
3. 安徽医科大学 炎症免疫性疾病安徽省实验室，安徽 合肥 230032
2. School of Pharmacy, Institute of Liver Diseases, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. Inflammation and Immune Mediated Diseases Laboratory of Anhui Province, Hefei 230032, China
BMPs是TGF-β超家族的成员，在胚胎发生过程中调控细胞生长和分化[1]。BMPs最初是从小鼠肝脏cDNA文库中克隆出来的，对骨和软骨的形成有一定的诱导作用，还能促进骨折的修复，因在体外调节成软骨细胞和成骨细胞的生长和分化而被发现命名[2]，但随着人们对BMPs日益深入的研究，发现BMPs除了可以诱导骨形成以外，BMPs还可调节一些细胞进程，包括细胞增殖、分化、趋化性、凋亡和迁移，且在心血管、肺、泌尿生殖系统和胃肠道系统等不同器官系统中发挥作用。BMPs作为多功能细胞因子，哺乳动物中包含多种配体，是最大的TGF-β亚家族。按其序列和结构同源性BMPs配体可分为不同的组别：BMP2和4；BMP5, 6, 7, 8和8B；BMP9/GDF-2和BMP10；BMP11/GDF-11和GDF-8；BMP12/GDF-7, BMP13/GDF-6和BMP14/GDF-5；BMP15/GDF-9b和GDF-9；GDF1和3；BMP3和BMP3b/GDF-10。此外，BMP1事实上是一种金属蛋白酶，并不属于BMPs家族。有研究表明，BMPs基因敲除或突变使BMPs的产生减少或功能异常，这些常会导致严重的疾病，并且通路中多种BMPs成分的缺失对胚胎多是致死的，例如BMP10在胚胎时期是由心脏产生，而在成年期则由右心房产生，但BMP10缺失可导致胚胎致死；BMP7基因敲除小鼠由于缺乏肾脏和眼睛在出生后不久便发生死亡；BMP9主要由肝脏产生，尽管BMP9突变会对蛋白质加工和/或功能产生负面影响，导致遗传性出血性毛细血管扩张和肺动脉高压，并且BMP9基因敲除小鼠有淋巴缺陷但却并不能导致胚胎致死。除此之外，BMP9对肝脏的生理病理也有一定影响，但人们对其影响肝脏发病的具体机制却仍然是知之甚少，因此，本文的主要目的是旨在阐述BMP9在肝脏的生理病理状况下的作用。
1 BMP9BMPs作为有丝分裂原和形态因子，在胚胎发育过程中其表达受到时间和空间的严格控制。研究发现，BMP9首先是作为前驱蛋白(precursor protein, pre-pro-BMP9)被肝脏表达分泌的，前驱蛋白由429个氨基酸组成，其中包含了22个氨基酸可引导前体进入分泌通路的N端信号肽，33 ku的prodomain和12.5 ku的C端受体结合区成熟肽[3]。其中，终端成熟区可通过二硫键的形成使pre-pro-BMP9形成二聚体，在内质网或高尔基体中的丝氨酸内切蛋白酶可通过剪切pre-pro-BMP9二聚体形成两个大小为25 ku短的成熟肽二聚体和约100 ku的prodomain。人们普遍认为，BMP9是以一种具有生物活性的形式循环，功能和结构研究表明成熟肽BMP9与其prodomain的结合不仅不会抑制其生物学活性，也并不会妨碍其与信号受体的结合，并且在与受体结合时prodomain会从成熟蛋白中快速释放出来[4]。
2 BMP9受体和信号通路BMP9在肝脏以自分泌和旁分泌方式分泌，在人体中可以检测到BMP9持续低浓度的表达，其可参与调控多种生物学功能，包括铁离子平衡、软骨形成、血管生成、神经元分化、糖脂代谢等。但是关于BMP9和肝脏疾病之间的联系，我们却仍旧知之甚少。因此，如果能充分了解BMP9信号转导通路与肝脏病理过程中多个靶分子之间的关系，将有助于深入了解BMP9在肝脏疾病中的潜在作用。
被分泌的BMP9主要通过与丝/苏氨酸激酶跨膜受体的结合而转导信号，其中，BMP9受体主要被分为Ⅰ型受体和Ⅱ型受体两类，而Ⅰ型受体又可被分为激活素受体样激酶1(the activin receptor-like kinase 1，ACVRL1 or ALK1)、ALK2(ActR-1A)、ALK3(BMPR1A)和ALK6(BMPR-1B)4种，Ⅱ型受体又可被分为BMPRII、ActRIIA和ActRIIB 3种。其中，Ⅰ型受体携带有两个额外的基序，一个是位于激酶域(GS-box)之前的富含甘氨酸/丝氨酸的区域，而另一个是在激酶域内被称为L45环，其是由8个氨基酸组成的短区域。Ⅱ型受体激酶具有结构活性。而细胞内信号的特异性主要由Ⅰ型受体决定。大多数成熟活性的BMPs分子是由同样的单体BMP配体之间双硫键的形成成为均二聚体。然而，体外和体内的证据都表明也存在一些BMP异质二聚体[5]。BMPs配体通过和两个Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体二聚体组成异四聚体复合物，从而启动信号转导级联。具体来说，Ⅰ型受体激酶的激活需要配体结合，配体-受体的寡聚化并通过Ⅱ型受体转磷酸化GS-box从而活化Ⅰ型受体。BMPs配体与细胞表面BMP受体的细胞外区域结合后产生信号组装，激活smad依赖(经典)和多种smad非依赖(非经典)信号通路，直接影响基因转录。
经典通路:Smad蛋白家族包含8种蛋白，可被分为3个亚族：调节性Smads(R-Smads)，共同性Smad(Co-Smad)，抑制性Smads(Ⅰ-Smads)。其中，Co-Smad可与R-Smads结合转导信号，而Ⅰ-Smads下调Smads活化调节受体的稳定性抑制信号的转导。BMPs结合Ⅰ型和Ⅱ型受体后，激活的Ⅰ型受体磷酸化下游底物蛋白R-Smads的C端，一旦R-Smads磷酸化便进一步与共同性受体Smad4形成复合物，最终转移至细胞核内，复合物通过与基因启动子区域的SBEs或GC富集序列结合调节靶基因的转录。一般情况下，BMPs对与它们结合的受体和可能调节信号相关的共受体有所偏好，BMP9和BMP10对ALK1的亲和性都很强，次之ALK2，最后是ALK3，ALK6。BMP9与受体结合之后，Ⅱ型受体磷酸化Ⅰ型受体，然后通过激活R-Smad1/5/8启动下游信号传导。这些Smads与Smad4的形成复合体使这种转录活性复合物的转移到核内进而能够调控BMP9的靶基因的表达，例如ID1。此外，BMP9还受到共受体内皮素(endoglin)的调节，BMP9对内皮素很敏感，亲和力很高，内皮素与ALK1共同作用可增强BMP9的反应。
非经典通路：BMP9还可以根据细胞类型和环境特异性方式激活非经典通路，使细胞特异性反应受到严格的调控。非经典通路主要包括MAPK(p38，ERK，JNK)、PI3K/AKT、PKC等通路，这些通路形成了一个复杂的分子信号网络，调控着机体的许多过程，但是目前由于我们对BMP9是如何通过如此复杂的非经典通路分子信号网络是如何影响机体肝脏的了解仍旧不足，因此仍需要大量研究进行进一步的探究。
3 BMP9与肝脏损伤及再生过程BMP9作为TGF-β家族的一员，尽管其对多种器官都有一定的作用，但对BMP9在肝脏特别是肝损伤后的具体功能知之甚少。随着现代社会的进步，人们对酒精的需求量和摄入量更是逐年增加，酒精成为慢性肝损伤的主要因素之一，酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)的发病率和死亡率持续不断的增长。ALD，是指由长期摄入大量酒精导致酒精在体内蓄积而引发的肝脏性疾病，主要包括肝脏脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌[6]，其中肝脏脂肪变性通过戒断酒精和适当治疗是可逆转的，并且只有极少一部分肝脏脂肪变性才会进展为酒精性肝炎(alcoholic hepatitis, AH)，继而向更严重的肝纤维化，肝硬化甚至是肝癌进展。由于ALD的死亡率持续增长且目前仍旧缺乏有效的药物治疗方法，因此如何早期诊断并发现治疗ALD的有效方法是我们现在急需解决的难题。
其中，肝纤维化程度的评估对ALD患者的治疗决策具有重要价值，肝脏纤维化是一个由炎症性细胞因子和肠道衍生物活化的肝脏星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)调节的胞外基质沉着的动态、渐进的过程[7-8]。TGF-β是肝纤维化的一个关键因素[9]，众所周知，TGF-β能够活化肝星状细胞，调节ECM合成，提供细胞收缩和迁移能力，促使肝细胞发生凋亡及其信号诱导氧化应激和炎症[10]。相比于TGF-β促进肝脏纤维化的作用，BMPs可能参与到这个过程最近才被提出。研究者通过诱导的肝脏急慢性肝损伤模型发现肝脏持续表达的低水平BMP9，其可以稳定健康肝脏的肝细胞功能；BMP9主要由HSCs产生，而一旦HSCs激活，内源性BMP9水平升高，在急性或慢性损伤时，BMP9水平升高会导致肝损伤增强，而阻断BMP9/ALK1通路后可减轻肝脏纤维化，表明在肝脏损伤时下调BMP9可减轻肝脏损伤[11]。同样的，有人通过DDC诱导的胆汁淤积性肝损伤发现敲除BMP9可以减轻肝脏损伤和纤维化[12]，并且还有一些研究发现通过靶向BMP9可降低肝脏的纤维化程度[3, 13]。
众所周知，中性粒细胞浸润是ALD的最主要特征之一。除了KCs和窦状内皮细胞外，HSCs也能表达LPS的主要受体TLR-4，并能通过促炎信号对LPS处理作出反应[14]。通过研究发现在肝脏急性损伤时例如LPS刺激，肝脏HSCs的BMP9的表达量下降[11]，提示BMP9与LPS和炎症有某种关联。有研究表明内皮素的缺乏可破坏白细胞聚集和内皮细胞介导的炎症，并且发现BMP9-ALK1/2通路通过上调人内皮细胞表面的受体TLR-4、E-selectin和VCAM-1从而增强LPS诱导的白细胞浸润，而只有BMP9时却并不能诱导中性粒细胞的聚集[15]。此外，还有人发现BMP9和BMP10还可通过ALK2增强TNF-α诱导的单核细胞的聚集[16]。以上提示在肝脏损伤时人们或可通过靶向BMP9从而减轻肝脏损伤。也有人探讨了通过干扰BMP9/ALK1信号通路治疗肝脏损伤的可能性，为以后探寻治疗肝脏损伤指明了可行性的方向。
BMP9是一种决定多种组织发育的蛋白，近年来，有人发现其在调控脂肪生成方面也有一定的作用。成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21, FGF21)是成纤维细胞生长因子家族的一员，具有多种代谢功能，FGF21以胰岛素不依赖的方式直接调节脂质代谢减少肝脏脂质积累。有实验室通过给高脂饲料诱导肥胖的小鼠注射不同浓度重组BMP9衍生物MB109，发现MB109通过刺激FGF21的表达可降低血清ALT和胆固醇水平，促进褐色脂肪生成，从而抑制非酒精性脂肪肝和肥胖[17]。但是，也有一些研究者发现MB109诱导高脂饮食小鼠皮下，而非内脏脂肪组织，褐色脂肪形成基因的表达，并且注射MB109可增强肥胖小鼠肝脏脂肪酸合酶的表达，其或许通过ALK1将肝脏中的葡萄糖转化为脂肪酸，降低血糖水平[18]。目前，人们对BMP9到底如何影响肝脏脂肪这一问题仍存在分歧，因此我们仍旧需要大量的实验来研究BMP9是否对肝脏脂肪有调节作用。
在慢性病变肝脏中，肝细胞经历一系列持续的损伤和代偿性刺激，从而触发旨在保护残余实质及其功能的复杂反应。根据肝病的分期和程度，受损细胞要么被清除，要么被邻近的细胞修复。尤其是肝细胞驱动的肝脏再生受损时，肝祖细胞(hepatic progenitor cells, HPCs)即通常所说的卵形细胞，成为再生的优势细胞来源，又因为这些细胞经常形成导管样结构，这种现象也被称为导管反应。HPCs扩张后向肝实质迁移，分化为肝细胞或胆管细胞，补充细胞损失，重建肝功能[19]。大量的证据已经证实，无论是在动物模型中还是在人类中，在持续性肝损伤后，HPCs会发生强烈的活化、扩增和分化[20]。有学者在肝脏急慢性肝损伤模型中发现，BMP9可干扰肝脏再生，而暂时性的抑制BMP9可以有助于恢复肝脏损伤和肝脏再生能力的增强[11]。DDC诱导的胆汁淤积性肝损伤是一个被广泛用作HPCs驱动的肝再生研究的化学损伤模型，有研究通过DDC诱导的肝再生模型发现BMP9是通过ALK2而不是ALK1，直接靶向卵形细胞抑制卵形细胞的扩增并促进其凋亡，从而干扰肝再生，提示通过靶向抑制BMP9或可促进肝再生[12, 21]。
4 BMP9与肝癌的发生进展过程肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上第五大最常见的癌症，也是导致癌症死亡的第三大原因，近年来其发病率和死亡率都在逐年增长。尽管人们对HCC的诊断和治疗进行了广泛的研究，但由于其分子机制的异质性和复发的高风险，预后仍不理想。肝切除、肝移植和几种经皮治疗是推荐给早期和中期HCC患者的治疗方法。
BMPs在肿瘤发生过程中的作用，特别是在肝脏中的作用，近年来得到了广泛的重视。HCC患者癌症复发率高，预后差与肝癌倾向于形成肿瘤侵袭性和肝内和肝外转移有关。上皮间充质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是参与癌细胞恶性进展的主要机制之一。EMT的特点是上皮细胞分化特征的丧失，如细胞接触性抑制和细胞极性的丧失，以及间充质特征的获得，如较高的运动性、侵袭性和对凋亡的抵抗力等[22]。TGF-β信号被认为是恶性肝细胞EMT表型完整的关键诱导因子。据报道，它对包括肝细胞在内的上皮细胞具有双重作用，在健康肝脏和肝癌形成的早期阶段，TGF-β介导细胞周期阻滞和细胞凋亡，而在后期，它会导致细胞去分化，EMT和肝癌转移。而作为TGF-β家族的一员BMP9是否对HCC也有着双重的影响？人们发现BMP-9能够稳定健康的肝细胞，帮助维持细胞的极化状态和功能。此外，虽然生理水平的BMP-9对成熟(健康)血管具有抗增殖和稳定作用，但高水平却可促进不同肿瘤的血管生成，而且，有研究通过检测人类肝脏标本以及BMP9对肝癌细胞系的EMT标志物和细胞迁移的影响，发现BMP9/Smad1通路通过诱导EMT成为HCC的潜在启动子，这或可成为治疗肝癌是一个重要靶点[23]。有研究表明，BMP9在约40%的HCC患者中过表达。据报道，通过重组BMP9与人类肝癌细胞系HepG2细胞结合发现BMP9不仅与HepG2细胞具有很高的结合亲和力还可以促进HepG2细胞增殖[23]。同时，也有研究表明，使用BMP9对肝癌细胞的刺激发现在HepG2中，BMP9触发Smad1/5/8磷酸化和Id1表达的上调。此外，通过使用化学抑制剂、配体诱捕和基因沉默的方法，证明了HepG2细胞是自发产生BMP9的，还发现BMP9可促进HepG2细胞的细胞周期进展，并且引人注意的是BMP9完全消除了低血清中长期孵育诱导的凋亡细胞的增加，这揭示了BMP9既能促进增殖反应，又能在HepG2细胞中发挥显著的抗凋亡功能，从而对肝癌细胞的生长产生巨大的影响，这为BMP9作为肝癌细胞生长调节剂、促进增殖和存活提供了证据[24]。以上提示BMP-9在肿瘤和非肿瘤情况下具有完全相反的功能，然而，BMP9虽然不仅能通过促进肝癌细胞的增殖和存活，还能通过诱导上皮细胞向间质转化促进肝癌的迁移从而发挥促进肿瘤进展的作用，但是我们却仍不清楚BMP9驱动这些效应的确切机制。因此，通过研究发现利用不同浓度的BMP9刺激人类肝癌HepG2细胞发现BMP9刺激可增加HepG2细胞数量，此外分别通过阻断经典和非经典通路，发现在HepG2细胞中BMP9同时诱导Smad和非Smad信号级联，尤其是PI3K/AKT和p38MAPK，但是却只有p38MAPK通路参与了BMP9对这些细胞的促生长作用，并且还证明了p38MAPK的激活虽然对BMP9的增殖活性是不必要的，但对BMP9对抑制低血清诱导的凋亡的保护作用是必需的[25]。这些发现有助于我们更好地理解BMP9在肝肿瘤细胞中促肿瘤发生作用的信号通路，为以后我们的科学研究奠定了坚实的基础。
综上所述，目前的研究表明，BMP9及其信号转导对肝脏损伤、肝再生和肝癌都有一定的影响，尽管这种情况很复杂，并且其具体影响的机制也并不清楚，但是这些发现为更好地理解BMP9的功能作用，特别是BMP9/ALK1信号通路在肝损伤和HCC发病机制中的作用提供了新的线索，这可能会激励研究人员开发出有效的、有针对性的治疗干预措施，为人类的健康作出贡献。
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