玉叶金花(Mussaenda pubescens Ait.f.)，壮药名为勾北豪，属茜草科植物，常用其干燥根茎入药。具有清热、解毒、利湿、消肿的功效，主要用于感冒、咽喉疼痛、肠炎、支气管炎、肾炎水肿等疾病[1]，广西民间常用其茎叶熬制凉茶，同时，也是玉叶解毒颗粒、玉叶解毒糖浆、玉叶清火片、玉叶清火胶囊等成药中的君药。玉叶金花中含有大量的化学成分，如三萜类、环烯醚萜类、黄酮类等，由于其成分较多，发挥抗炎、镇痛作用的关键效应成分尚不十分明确。近年来谱效学的广泛应用，为中药的药效物质研究提供了有利手段，通过数学分析模型，将指纹图谱与生物效应进行关联，建立其质量、疗效与化学成分的内在关系。本实验考察了不同批次玉叶金花提取物的抗炎、镇痛药效作用，建立了HPLC指纹图谱，通过灰色关联分析方法研究了其抗炎、镇痛药效与指纹图谱之间的相关性，为完善玉叶金花药材质量评价标准，探索其药效物质基础提供参考。
1 材料与方法 1.1 仪器液相色谱仪LC-20A(岛津公司)，电子天平CP224S (Sartorius公司)，水浴锅DK-98-IIA双列8孔(天津泰斯特)，超声波清洗器KQ-400DE(昆山市超声仪器有限公司)，100 g手提式高速粉碎机DFT-100A(温岭市林大机械有限公司)，电子万用电炉(天津市泰斯特仪器有限公司); 8 mm耳肿打孔器(上海红太阳五金店)。
1.2 药物与试剂玉叶金花药材分别于不同月份采收于广西柳州，批号分别为20170201(S1)、20170202(S2)、20170301(S3)、20170302(S4)、20170401(S5)、20170402(S6)、20170501(S7)、20170601(S8)、20180901(S9)、20180902(S10)，来自湖南三金制药有限公司。主要试剂(批号)：山栀苷甲酯(201103)、绿原酸(201817)、8-O-乙酰山栀苷甲酯(201703)、异绿原酸A(201706)，购买自中国食品药品检定研究院; 玉叶金花苷酸甲酯(X22D9L78554)，购买自上海源叶生物科技有限公司; 新绿原酸(1850010)、异绿原酸B(S0990020)、异绿原酸C(J1010010)、隐绿原酸(L1470010)，购买自上海安谱实验科技股份有限公司; 去痛片(180306)，购买自广东华南药业集团有限公司; 地塞米松(1704011)，购买自天津力生制药股份有限公司; 乙酸(20150302)、乙醇(20181209)购买自国药集团; 乙醚(20170103)，购买自上海沃凯生物技术有限公司; 吡啶(180225)，购买自西陇科学股份有限公司; 巴豆油(20160207)，购买自吉安市青原区绿源天然香料油提炼厂。
1.3 动物小鼠(昆明种，SPF级)，♂，体质量(20±2)g，由广西食品药品检验所生产(许可证号SCXK桂2017-0002)。
1.4 玉叶金花药材提取物的制备分别取各批次药材500 g打粉，置烧杯中，加入6倍量的50%乙醇，混匀，浸泡1 h后，超声处理(频率40 kHz，功率320 W)1 h，放到电炉上煎煮1 h，稍冷后，用8层纱布过滤，收集滤液，同法对药粉再提取1次，合并2次滤液，置水浴上蒸干，加水溶解并完全转移至100 mL容量瓶，定容至刻度，再稀释20倍即得(溶液浓度相当于生药量250 g·L-1)。
1.5 玉叶金花药材提取物的抗炎、镇痛作用 1.5.1 耳肿实验[2]取144只小鼠，随机分组，设阳性组、模型组、药材(S1~S10)提取物组，每组12只，分别给予地塞米松(0.2 g·L-1)、纯化水、药材提取物，每天按20 mL·kg-1体积ig 1次，d 7给药1 h后，将巴豆油混合液0.01 mL涂在每只小鼠的左耳廓正反面，右耳不做处理。小鼠耳部致炎肿胀后4 h，脱颈椎法处死小鼠，从耳根处剪下左、右两边耳片，用打孔器在所剪耳片相同处打下圆形片，称重，计算左、右耳片重量差，即肿胀度，以模型组与各给药组肿胀度之差占模型组肿胀度的百分比表示抑制率。
1.5.2 扭体实验[3]取小鼠144只，按2.2.1的方法分组并给药，其中阳性组给予去痛片(36.5 g·L-1)，d 7给药1 h后，各小鼠ip醋酸溶液(0.6%)0.2 mL, 计时15 min，记录其扭体次数，以模型组与各给药组小鼠扭体均数之差占模型组扭体均数的百分比表示抑制率。
1.6 玉叶金花药材提取物指纹图谱的测定 1.6.1 对照品混合液的制备精密称取对照品适量，用甲醇溶解，分别将玉叶金花苷酸甲酯、绿原酸、异绿原酸(A、B、C)、新绿原酸、8-O-乙酰山栀苷甲酯、隐绿原酸、山栀苷甲酯配成20 mg·L-1的储备液。精密吸取各储备液1 mL，置同一容量瓶(25 mL)中，加甲醇至刻度，混匀即得。
1.6.2 色谱条件色谱柱(ZORBAX SB C18，250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，柱温：30 ℃; 流动相A为乙腈，流动相B为0.15%磷酸水溶液; 进样量：10 μL，按(0~15 min，7% A; 15~75 min，19% A; 75~90 min，90% A)梯度洗脱，流速：1.0 mL·min-1; UV检测器：254 nm。
1.6.3 指纹图谱及共有峰的确定分别取10批玉叶金花药材(S1~S10)提取物和对照品混合液，按1.6.2项色谱条件进样测定色谱图，以峰面积筛选共有峰，以对照品色谱峰表征特征峰，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会2004 A版)对指纹图谱进行评价。
1.7 统计学分析数据以x±s表示，用SPSS 16.0软件分析处理，以单因素方差分析法比较各组间的数据。
2 结果 2.1 小鼠耳肿胀的影响称量耳片重量，统计结果表明，与模型组相比，玉叶金花各给药组与阳性对照组均明显改善巴豆油混合液致小鼠耳肿胀程度(P < 0.05)，见Tab 1。
| Group | Swelling degree/mg | Inhibition rate/% | Number of twist/time | Inhibition rate/% |
| Model | 13.83±3.62 | - | 31.33±9.80 | - |
| Positive control | 0.94±0.82** | 93.19 | 5.08±7.19** | 83.78 |
| S1 | 9.67±3.03* | 30.12 | 22.17±7.58* | 29.26 |
| S2 | 9.15±5.08* | 33.86 | 22.08±10.98* | 29.52 |
| S3 | 9.58±2.58* | 30.72 | 22.42±8.82* | 28.46 |
| S4 | 8.08±3.46** | 41.57 | 17.83±9.89** | 43.09 |
| S5 | 9.94±4.01* | 28.13 | 21.25±9.80* | 32.18 |
| S6 | 9.00±6.32* | 34.94 | 22.33±9.81* | 28.72 |
| S7 | 9.98±6.02* | 27.89 | 19.83±10.87** | 36.70 |
| S8 | 9.99±4.49* | 27.77 | 21.33±10.67* | 31.91 |
| S9 | 9.93±4.52* | 28.25 | 22.25±9.97* | 28.99 |
| S10 | 9.54±6.55* | 31.02 | 18.58±7.90** | 40.69 |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs model | ||||
记录小鼠15 min内扭体次数，统计结果表明，与模型组相比，玉叶金花各给药组与阳性对照组均明显抑制0.6%醋酸溶液致小鼠扭体作用(P < 0.05)，见Tab 1。
2.3 玉叶金花药材指纹图谱 2.3.1 共有峰及特征峰的确定分析10批玉叶金花药材提取物色谱图并进行匹配(见Fig 1)，确定26个共有峰(见Fig 2)。以玉叶金花苷酸甲酯作为参照峰，通过保留时间确定，各对照品(色谱峰号)分别为：新绿原酸(8)、山栀苷甲酯(11)、绿原酸(12)、隐绿原酸(14)、玉叶金花苷酸甲酯(15)、8-O-乙酰山栀苷甲酯(20)、异绿原酸B(24)、异绿原酸A(25)、异绿原酸C(26)，见Fig 3。
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| Fig 1 Fingerprint matching diagram of Mussaenda pubescens Ait.f. |
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| Fig 2 Common peak figure |
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| Fig 3 Mixed control solution diagram Mixed reference: 8, Neochlorogenic acid; 11, Shanzhiside methyl ester; 12, Chlorogenic acid; 14, Cryptochlorogenic acid; 15, Mussaenoside; 20, 8-O-Acetyl Shanzhiside methyl ester; 24, Isochlorogenic acid B; 25, Isochlorogenic acid A; 26, Isochlorogenic acid C. |
由Fig 1~3可知，各批次玉叶金花药材提取物的指纹图谱与对照基本一致，表明所含成分基本相同，部分峰面积有差异，表明各批次所含成分的含量存在不同。
2.3.2 相似度评价利用软件匹配分析，10批玉叶金花药材提取物指纹图谱的相似度分别为S1：0.928，S2：0.754，S3：0.926，S4：0.956，S5：0.973，S6：0.925，S7：0.946，S8：0.890，S9：0.965，S10：0.941。结果表明，除S2和S8外，其余样品相似度在0.925~0.973，表明各批次玉叶金花药材质量基本稳定。
2.4 玉叶金花药材提取物指纹图谱与其抗炎、镇痛作用相关性的分析 2.4.1 抗炎作用与指纹图谱相关性分析采用灰色关联度分析方法[4]，设母序列为不同批次玉叶金花药材提取物对巴豆油混合液致小鼠耳肿胀的抑制Fig 1 Fingerprint matching diagram of Mussaenda pubescens Ait.f.率，子序列为HPLC指纹图谱的26个峰面积，分辨系数ρ为0.5，经数据处理所得关联度见Tab 2，关联度为0.727 2~0.577 9，共有峰(编号)对抗炎作用贡献大小顺序为19＞2＞3＞23＞25＞8＞4＞22＞17＞1＞26＞14＞7＞12＞21＞18＞5＞6＞24＞10＞20＞11＞9＞16＞13＞15，说明玉叶金花药材提取物的抗炎作用是不同化学成分协同作用的结果，对抗炎作用较大的是19、2、3、23、25、8号峰，经与对照品比对，其中25号峰为异绿原酸A，8号峰为新绿原酸。
| Peak no. | Correlation | Peak no. | Correlation |
| 19 | 0.727 2 | 12 | 0.646 2 |
| 2 | 0.713 9 | 21 | 0.645 5 |
| 3 | 0.699 6 | 18 | 0.644 9 |
| 23 | 0.693 2 | 5 | 0.641 8 |
| 25 | 0.683 2 | 6 | 0.641 1 |
| 8 | 0.674 6 | 24 | 0.634 8 |
| 4 | 0.670 0 | 10 | 0.631 6 |
| 22 | 0.668 4 | 20 | 0.628 3 |
| 17 | 0.660 2 | 11 | 0.625 5 |
| 1 | 0.656 6 | 9 | 0.623 8 |
| 26 | 0.654 1 | 16 | 0.619 6 |
| 14 | 0.651 6 | 13 | 0.603 1 |
| 7 | 0.651 2 | 15 | 0.577 9 |
采用2.4.1方法，设母序列为不同批次玉叶金花药材提取物对醋酸致小鼠扭体作用的抑制率，子序列为HPLC指纹图谱的26个峰面积，分辨系数ρ为0.5，经数据处理所得关联度见Tab 3，关联度为0.733 3~0.570 8，共有峰(编号)对镇痛作用贡献大小顺序为5＞11＞20＞4＞16＞17＞10＞7＞21＞3＞6＞22＞18＞9＞1＞14＞12＞13＞8＞19＞23＞2＞26＞24＞25＞15，说明玉叶金花药材提取物的镇痛作用是不同化学成分协同作用的结果。对镇痛作用贡献较大的为5、11、20、4、16、17号峰，经与对照品比对，其中11号峰为山栀苷甲酯，20号峰为8-O-乙酰山栀苷甲酯。
| Peak no. | Correlation | Peak no. | Correlation |
| 5 | 0.733 3 | 9 | 0.673 7 |
| 11 | 0.728 8 | 1 | 0.669 5 |
| 20 | 0.719 6 | 14 | 0.669 2 |
| 4 | 0.705 6 | 12 | 0.666 1 |
| 16 | 0.699 2 | 13 | 0.657 5 |
| 17 | 0.696 7 | 8 | 0.652 4 |
| 10 | 0.693 6 | 19 | 0.637 9 |
| 7 | 0.692 4 | 23 | 0.629 6 |
| 21 | 0.691 1 | 2 | 0.629 4 |
| 3 | 0.684 9 | 26 | 0.604 1 |
| 6 | 0.679 9 | 24 | 0.597 3 |
| 22 | 0.678 9 | 25 | 0.592 1 |
| 18 | 0.673 9 | 15 | 0.570 8 |
本研究对不同批次的玉叶金花药材进行了高效液相色谱分析，根据色谱峰面积筛选了26个色谱共有峰，并确定了9个特征峰。采用灰度关联分析法将HPLC指纹图谱与其抗炎镇痛作用进行相关性分析，从分析结果可知，共有峰的关联度大部分大于0.62，表明发挥药效作用的过程中，不同化学成分很可能都参与其中。
在对抗炎作用贡献较大的前6个色谱峰中，确定两个特征峰为异绿原酸A和新绿原酸; 在对镇痛作用贡献较大的前6个峰中，确定两个特征峰为山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯。以上4个特征峰成分的抗炎、镇痛作用均有报道，刘杨等[5]通过异绿原酸A对胶原诱导性关节炎大鼠模型的干预研究表明其能明显减轻大鼠足跖的肿胀度、降低模型大鼠的脾脏系数、明显抑制骨关节损伤的病理改变。杨海星[6]用脂多糖刺激小鼠巨噬细胞，建立体外炎症模型，考察金银花中新绿原酸的抗炎作用，研究表明，200 mg·L-1浓度时，对模型细胞产生的NO和PGE2的量均有明显抑制作用，并显著下调iNOS和COX-2 mRNA和蛋白的表达。朱斌等[7]研究表明，独一味镇痛作用的有效成分为山栀子苷甲酯和8-O-乙酰山栀子苷为代表的环烯醚萜苷。
因此异绿原酸A、新绿原酸、山栀苷甲酯、8-O-乙酰山栀苷甲酯极大可能为玉叶金花药材的主要抗炎镇痛药效物质，可作为其质量控制的关键成分，本实验中仍有部分未知峰，其是否对药效产生了影响有待深入研究。
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