


缺血性脑卒中是当今常见的高危疾病之一,因缺血后易造成永久性的损伤,且临床治疗手段有限,难以恢复死亡的神经元,所以具有预后不佳、致死、致残率高的特点[1]。近年研究发现神经细胞受损后可以通过神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植来弥补或拯救神经元[2],成为缺血性脑卒中的新型治疗候选者[3]。Notch信号通路能够调控细胞分化、增殖、凋亡、迁移和血管生成,在决定细胞命运中具有核心作用[4]。研究发现,激活状态下的Notch信号通路主要通过调节下游效应分子Hes1和Hes5来调控NSCs的增殖和分化[5]。补阳还五汤是王清任《医林改错》中的经典方剂,在临床中被广泛用于治疗缺血性脑卒中。补阳还五汤对神经干细胞移植后脑缺血/再灌注大鼠的神经保护作用是本课题组的前期研究结果,并且Notch信号通路抑制剂可以通过影响该通路促进脑缺血/再灌注大鼠NSCs移植后的神经再生。但是,补阳还五汤对脑缺血/再灌注大鼠NSCs移植后的脑保护作用是否是通过调控Notch信号通路起作用的,鲜有报导。因此,本研究以脑缺血/再灌注大鼠模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)为研究对象,探讨补阳还五汤是否通过调控Notch信号通路增强神经干细胞移植对脑缺血/再灌注大鼠的脑保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物SD大鼠80只,♂,清洁级,自北京维通利华公司购买,体质量均在(275±2) g。公司生产许可证号为:SCXK(京)2016-0011。
1.2 试剂及药品戊巴比妥钠购于北京化学试剂公司(批号020402);培养基的组成包括购于Gibco公司的DMEM/F-12(1 :1)(批号8119014)、B-27(批号1865349)和购于PeproTech公司的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(批号1210432-1)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)(批号1009390);Notch1(批号5)、Hes1(批号3)抗体购于CST公司,Hes5抗体购于Abcam公司(批号GR214854-7)。DAPI染液(批号180118)、Nestin兔抗大鼠单克隆抗体(批号AF12261998)、Actin抗体(批号LS190312)、以及其他分析纯试剂均购于赛维尔有限公司。补阳还五汤由黄芪120 g,赤芍5 g,当归尾6 g,红花3 g,地龙3 g,桃仁3 g,川芎3 g组成,药材购自河北乐仁堂药业有限公司,煎药浓缩至100 mL(1 mL约含1.43 g生药)。
1.3 主要仪器超净工作台SW-CJ-2FD型、Heal Force二氧化碳培养箱HF240型、Stoelting全自动脑立体定位仪51700型; Leica包埋机EG11508、轮转切片机RM2255、生物显微镜DMI3000B、光学显微镜DM5000B型; Eppendorf离心机; UVP凝胶成像机; Bio-Rad电泳仪、半干转膜仪。
1.4 提取、培养及鉴定NSCs[6]培养基由DMEM/F-12、B27、EGF、bFGF、配置而成。取购自维通利华公司的孕14 d大鼠,麻醉并酒精消毒后,剥出子宫,在超净台内取胎鼠大脑皮质,用眼科剪剪碎后,用手动吹打法使较大的组织变化为细胞悬浊液,并在吹打后使用细胞筛滤过以保证悬液均匀。离心5 min后取出,速率为1 000 r·min-1,倾倒上清液后加培养基,再次吹打悬浮,接种在25 cm2培养瓶,培养于CO2培养箱,密度1.0×109·L-1,恒温37 ℃。在放有多聚赖氨酸包被盖玻片的6孔板中接种已传至第3代的细胞悬液,4 h后显微镜下观察到神经球已粘附于盖玻片,贴孔板侧壁轻柔吸去多余悬液,并用体积分数0.04多聚甲醛固定,15 min后PBS轻柔冲洗3次,每次5 min(后续PBS冲洗均为3次,每次5 min); 室温下质量浓度3 g·L-1TritionX-100孵育,20 min后PBS冲洗; 室温下山羊血清封闭,30 min后PBS冲洗。之后滴加Nestin抗体(1 :200),在4 ℃环境中孵育,过夜后在室温避光环境下加入二抗(FITC)孵育,1 h后PBS冲洗; 滴加DAPI染液孵育,10 min后PBS冲洗; 取片加抗荧光淬灭封片剂进行封片,并检测Nestin的表达。
1.5 模型制作及评价大鼠在造左侧MCAO模型前禁食水,术前麻醉使用质量浓度为40 g·L-1的戊巴比妥钠(1 mL·kg-1)根据重量计算后腹腔注射,操作台上固定、消毒、备皮。颈总、颈内和颈外动脉在颈部正中切开2 cm后,分离暴露; 结扎3次颈外动脉后在前中结扎点间做一切口,用合适的线栓斜行插入,将颈总、颈内动脉用血管夹夹闭,剪断颈外动脉于后侧结扎点前,借助中部结扎线使颈外离断端与颈内动脉入颅方向一致,松颈内血管夹,插线栓至大脑中动脉, 稍有阻力感后停止,线栓进入约(19±1) mm。2 h后拔栓并系死前侧结扎点, 碘伏消毒,依次缝合切口, 术后动物给与保暖至苏醒[7]。术后24 h,做神经功能评分确定模型是否成功,按Zea Longa 5分制处理:行为无改变为0分; 右前爪无法舒展为1分; 向右侧行走转圈为2分; 行走向右侧歪倒为3分; 丧失自发活动与意识为4分。0分、4分动物死亡为模型失败,不予选取,将1~3分大鼠纳入实验对象。
1.6 分组及给药实验分组为假手术组(Sham)、模型组(Model)、补阳还五汤组(BYHWT)、移植组(Transplant)、补阳还五汤+移植组(BYHWT+Transplant),每组各16只; 其中假手术组只分离血管,其余4组随机平均分配64只模型成功大鼠。BYHWT组与BYHWT+Transplant组于手术麻醉清醒2 h后,灌胃给予补阳还五汤,给药剂量为14.8 g·kg-1·d-1,每日灌药量分两次给予,连续灌胃14 d,其余3组给予等体积蒸馏水。各组大鼠于NSCs移植后第14 d进行取材。
1.7 NSCs移植[8]模型制作24 h后进行NSCs移植,麻醉消毒,固定大鼠于脑立体定位仪上, 以前囟为坐标零点定位:AP=0.36 mm, ML=3.15 mm, DV=5.5 mm, 微量注射器注射速度:1 μL·min-1,细胞浓度为1.0×106·L-1,注入NSCs 10 μL于大鼠左侧纹状体区,完毕后留针10 min拔针,消毒缝合。
1.8 TTC染色检测大鼠迅速断头取脑,在置于质量浓度20 g·L-1的TTC染液前,放在-20 ℃环境15 min, 并于取出后的脑槽内做5片,2 mm厚冠状切片; 37 ℃恒温箱中避光孵育, 10 min后翻面1次, 20 min后在体积分数0.04的多聚甲醛中固定。24 h后拍照,脑梗死体积图片的分析使用Image-Pro Plus 6.0软件。
1.9 HE染色观察梗死区脑组织细胞体积分数为0.04的多聚甲醛灌注取脑,脑组织石蜡包埋,做冠状切片,厚5 μm。60 ℃烘烤石蜡切片2 h后,依次于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ中脱蜡,每次15 min,然后于梯度乙醇脱水,每次5 min,依次为体积分数1的乙醇Ⅰ、Ⅱ和体积分数0.8的乙醇; 蒸馏水复水、苏木素染液染色各5 min,流动水轻洗数秒,分化3 s,水洗反蓝少于30 s,过洗2 s,伊红染液浸染1~3 min,蒸馏水轻洗1~2 s; 再次梯度乙醇脱水,二甲苯透明处理,树胶封片,镜下拍照,进行细胞计数,并观察脑组织神经细胞损伤情况。
1.10 Western blot法检测各组大鼠快速在冰上断头,取缺血侧脑组织; 称重后,加入裂解液匀浆,取上清(组织总蛋白)。BCA法进行蛋白浓度测定。加样后,用SDS-PAGE凝胶电泳,传至PVDF膜; 室温下,质量浓度50 g·L-1脱脂奶粉封闭,2 h后分别加入兔抗大鼠Actin(1 :2 000)、Notch1、Hes1、Hes5(1 :1 000)抗体,4 ℃孵育过夜; 室温下加入二抗(1 :2 000)孵育,1 h后洗膜,避光并滴加ECL显影,于化学发光成像系统观察。以β-actin作内参照,以目的条带灰度值与内参照条带灰度值之比分析蛋白质的相对表达。
1.11 统计学应用实验数据处理应用SPSS19.0统计软件,用x±s形式表示,组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 神经干细胞的证明如Fig 1所示,在倒置显微镜下对培养6 d的新生大鼠脑组织原代细胞进行观察,观察发现:视野中存在多个悬浮、规则、无突起的桑葚状致密细胞球和大量单细胞。免疫荧光染色检测结果显示:具有荧光特性的FITC标记的Nestin发出绿色荧光; 细胞核被DAPI核染,发出蓝色荧光,表明Nestin表达呈阳性,提示培养的细胞为NSCs。
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Fig 1 Immunofluorescence identification of neural stem cells A: 6 d neural stem cells; B: Positive cells were stained with nestin immunofluorescence; C: DAPI; D.Merge |
如Fig 2,Sham组为0分。Model组较Sham组评分增加(P < 0.05);BYHWT组、Transplant组和BYHWT+Transplant组较Model组评分均降低(P < 0.05);BYHWT+Transplant组较Transplant组评分进一步降低(P < 0.05)。
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Fig 2 Neurological score of each group (x±s, n=12) *P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs transplant group. |
如Fig 3所示,Sham组无白色梗死灶形成。与Sham组比较,Model组缺血侧梗死区体积较大(P < 0.05); BYHWT组、Transplant组和BYHWT+Transplant组较Model组相比,梗死体积均缩小(P < 0.05);BYHWT+Transplant组较Transplant组梗死体积进一步缩小(P < 0.05)。
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Fig 3 TTC staining results of each group A:Photos stained with TTC.1:Sham; 2:Model; 3:BYHWT; 4:Transplant; 5:BYHWT+Transplant; B:Percentage of infarct volume(x±s, n=6).*P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 transplant group. |
如Fig 4所示,Sham组大鼠脑组织神经细胞大小形态基本一致,分布均匀、致密,结构正常,胞质充盈,核仁清晰,未见空泡状水肿和变性,未见明显核固缩与核溶解; 与Sham组比较,Model组大鼠脑组织大量细胞受损严重,分布稀疏,出现较多空泡状水肿、变性,以及核固缩和核溶解,皱缩细胞核数量增多(P < 0.05);BYHWT组、Transplant组和BYHWT+Transplant组分别与Model组比较,细胞状态表现出不同程度的减轻,核收缩和溶解的细胞数有一定程度的降低(P < 0.05);BYHWT+Transplant组较Transplant组损伤程度进一步减轻(P < 0.05)。
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Fig 4 HE staining of brain tissues in each group of rats (Bar=100 μm) A:HE staining photographs of each group. 1: Sham; 2: Model; 3: BYHWT; 4: Transplant; 5: BYHWT+Transplant; B:Number of nuclear pyknosis in each group (x±s, n=5). *P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs transplant group. |
如Fig 5所示,Sham组Notch1、Hes1、Hes5蛋白均有一定量的表达,与Sham组比较,Model组Notch1、Hes1、Hes5蛋白表达水平均上调(P < 0.05);BYHWT组、Transplant组、BYHWT+Transplant组较Model组,各项蛋白表达均有所上调(P < 0.05);BYHWT+Transplant组较Transplant组各项表达上调(P < 0.05)。
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Fig 5 Western blot results A:Western blotting bands of Notch1, Hes1 and Hes5 in brain tissues of each group of rats; B: The protein expression histograms of Notch1, Hes1 and Hes5 in brain tissues of each group of rats (x±s, n=5). *P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs transplant group. |
缺血性脑卒中的治疗是当今备受关注和亟待解决的关键问题,如何有效缓解脑损伤成为治疗的首要关注点。脑损伤的修复受到多种因素的调控,其中通过经典的Notch信号通路调节NSCs的增殖和分化被多数研究认可[9]。Notch通路受体蛋白(Notch1~4)激活后与相邻配体结合,经过多次介导启动下游碱性螺旋-环-螺旋基因:Hes1和Hes5效应分子转录。研究证明,机体调控NSCs的增殖、分化与Notch1、Hes1和Hes5的活化密切相关。NSCs细胞周期的退出以及过早分化与Notch1受体表达减弱有关; Hes1与抑制NSCs分化有关; 而Hes5可以促进NSCs的增殖,它们共同参与维持神经细胞数量与种类的稳定[10]。
脑卒中属于中医中风病的范畴,缺血性脑卒中的主要病机为气虚血瘀。针对病机治疗的补阳还五汤在长期临床实践中证明疗效卓越。现代医学研究发现补阳还五汤可以从抑制神经细胞凋亡、抑制细胞毒性、抑制炎症介质等方面负向调控; 也可以从促进NSCs增殖分化、促进相关生长蛋白表达、促进信号通路激活等多个方面正向调控,共同发挥对神经细胞的保护作用[11]。
本研究结果显示在脑缺血/再灌注损伤发生后,MCAO大鼠脑组织Notch1、Hes1、Hes5表达显著升高,表明机体内源性激活Notch1、Hes1、Hes5,参与修复受损部位,与涂建锋等[12]的研究结果一致。单纯进行补阳还五汤与单纯进行外源性NSCs移植治疗14 d后,Notch1、Hes1、Hes5表达增加,脑组织细胞与神经功能有所恢复,说明Notch信号通路被激活并对脑缺血/再灌注损伤有保护作用[13-14]。然而前期研究结果显示,外源性NSCs移植治疗7 d后Notch相关蛋白表达减少,神经保护作用与Notch通路促进外源性NSCs的分化有关[8],结合本实验我们猜测NSCs移植对Notch信号通路的影响可能是动态的,结果的差异性可能是因为NSCs移植在抑制Notch通路而促进外源性NSCs分化的同时,还参与了脑组织内环境与炎症反应的改变[15],故表现为前期外源性NSCs分化程度较内源性NSCs增殖程度明显,但是随着时间的增加,外源性NSCs分化逐渐稳定,炎症反应降低,内环境相对稳定,使Notch信号通路被激活,促进内源性NSCs增殖。随后我们研究脑缺血/再灌注损伤的修复作用是否能在NSCs移植与补阳还五汤的共同作用下,通过调控Notch信号通路而提高。研究结果证实:BYHWT+Transplant组各项蛋白明显上调,脑组织与细胞的恢复明显优于Transplant组。由此我们认为补阳还五汤可能是通过上调Notch信号通路,为移植后的内源性NSCs长期保持增殖水平提供了保障,提高了内源性NSCs增殖的潜能,弥补了移植后快速分化带来的治疗短暂性,从而增加了NSCs移植对脑缺血/再灌注损伤治疗的持续性,并发挥更持久的脑保护作用。
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